專(zhuān)利名稱(chēng)：：hBAFF的單鏈抗體scFv及其在生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及hBAFF的單鏈抗體scFv，以及其在BAFF人源性單克隆抗體制備中的應(yīng)用。技術(shù)背景免疫系統(tǒng)的紊亂是許多疾病的主要發(fā)病原因，針對(duì)免疫系統(tǒng)重要分子的抗體可有效干預(yù)病理性免疫過(guò)程，成為治療性單抗開(kāi)發(fā)中極為活躍的領(lǐng)域。人B淋巴細(xì)胞激活因子(hBAFF)是1999年新發(fā)現(xiàn)的一種與人體免疫調(diào)控密切相關(guān)的細(xì)胞因子，屬腫瘤壞死因子(TNF)超家族。作為B淋巴細(xì)胞發(fā)育的正調(diào)節(jié)因子，hBAFF在體內(nèi)具有促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化，存活的作用，而過(guò)多的hBAFF可導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，促使機(jī)體產(chǎn)生大量抗核抗體、抗ds-DNA抗體和抗SSA抗體等，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，誘發(fā)自身免疫性疾病。因此設(shè)法阻斷BAFF的生物學(xué)活性對(duì)于這些自身免疫性疾病的治療意義重大。目前,阻斷hBAFF生物學(xué)作用的制劑主要有hBAFF的可溶性受體(為可溶性受體sTACI與Fc的融合蛋白)和抗-hBAFF抗體兩類(lèi)。在人類(lèi)，針對(duì)SLE,FDA已正式批準(zhǔn)美國(guó)HGSI公司研制的抗-hBAFF抗體LymphoStat-B進(jìn)入III期臨床實(shí)驗(yàn)階段，從I期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，LymphoStat-B顯著地降低了SLE病人體內(nèi)產(chǎn)生抗核抗體的CD20+B細(xì)胞數(shù)目，極大改善了病人的病情，而且?guī)谉o(wú)副作用，同時(shí)，LymphoStat-B針對(duì)RA的II期臨床試驗(yàn)也在開(kāi)展。自身免疫疾病的治療至今缺乏理想的辦法，環(huán)孢菌素A是目前廣泛使用的免疫抑制劑，但它的副作用和并發(fā)癥——腎臟毒性、高血壓和高血脂癥也讓醫(yī)患人員極為頭疼，因此LymphoStat-B顯示了良好的商業(yè)應(yīng)用前景。但我國(guó)目前關(guān)于hBAFF人源性單抗制備還處于空白階段。原核表達(dá)體系缺少糖基化修飾系統(tǒng)無(wú)法生產(chǎn)治療性糖蛋白，而利用淋巴瘤融合生產(chǎn)的單克隆抗體又容易引起人的免疫反應(yīng)，真核細(xì)胞中，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(ChineseHamsterOvaryCell,CHO)是目前治療性重組糖蛋白的首選體系，是美國(guó)FDA認(rèn)可用于藥品生產(chǎn)的表達(dá)體系之一。CHO細(xì)胞具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子，同時(shí)減少免疫交叉反應(yīng)。目前已有越來(lái)越多的藥物蛋白在CHO細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)，其中部分藥物已投放市場(chǎng)，例如EPO、G-CSF等。但真核基因表達(dá)的產(chǎn)量往往很低，外源基因在CHO細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增是提高外源基因表達(dá)水平的重要策略之一。二氫葉酸還原酶基因(dhfr)擴(kuò)增系統(tǒng)最常用。DHFR可被葉酸類(lèi)似物氨甲喋吟(MTX)所抑制，不斷提高M(jìn)TX濃度，進(jìn)行性選擇抗氨甲喋吟的細(xì)胞系，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致與dhfr聯(lián)在一起的外源基因的共擴(kuò)增，其拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種hBAFF的單鏈抗體scFv,以及其在生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體中的應(yīng)用。一種hBAFF的單鏈抗體scFv，其特征在于，其序列如SEQIDNO.1所示。上述hBAFF的單鏈抗體scFv能應(yīng)用于生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體。所說(shuō)的hBAFF的單鏈抗體scFv在生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體中的應(yīng)用，具體包括以下步驟1)BAFF人源性單克隆抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建將hBAFF的單鏈抗體scFv和人IgGlFc(hinge+CH2+CH3)cDNA序列連接，合成scFv-Fc，所說(shuō)的scFv-Fc的序列如SEQIDNO.3;禾U用引物延伸技術(shù)將鼠IgGK鏈信號(hào)肽與scFv-Fc結(jié)合，并將得到的序列酶切后轉(zhuǎn)入pcDNA3.0真核表達(dá)載體，表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA3.0/scFv-Fc;2)抗hsBAFF全人源性基因工程抗體scFv-Fc的穩(wěn)定表達(dá)采用中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞二氫葉酸還原酶缺陷株(CHO/dhfr)，脂質(zhì)體法將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/scFv-Fc和標(biāo)志質(zhì)粒pSV-dhfr，共轉(zhuǎn)染入CHO/dhfr細(xì)胞；先利用G418篩選轉(zhuǎn)染成功的克隆，接著利用不含次黃嘌呤和胸腺?lài)娻?H.T.)的MEM選擇培養(yǎng)液，篩選dhfr陽(yáng)性細(xì)胞克隆株；之后氨甲喋吟(MTX)濃度梯度增高，加壓擴(kuò)增外源基因，提高scFv-Fc表達(dá)量，經(jīng)過(guò)多輪加壓培養(yǎng)，篩選到scFv-Fc穩(wěn)定、高效表達(dá)的細(xì)胞株；3)scFv-Fc的表達(dá)純化將得到的高表達(dá)細(xì)胞株轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)生產(chǎn)scFv-Fc;收集上清、離心，ProteinA親和層析純化蛋白，再將收集的蛋白于4'C對(duì)純水透析16h，過(guò)濾除菌后，。在本發(fā)明中，我們利用噬菌體展示技術(shù)從全人源性抗體文庫(kù)中篩選到自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)具有阻斷hsBAFF生物學(xué)活性的單鏈抗體片斷scFv，單鏈抗體雖然具有分子小、穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其親和力弱，在體內(nèi)半壽期短，效應(yīng)功能差。因此通過(guò)基因工程技術(shù)將人抗體IgGl恒定區(qū)Fc結(jié)構(gòu)域引入單鏈抗體，不僅可使單鏈抗體具有雙價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)，又可賦予單鏈抗體介導(dǎo)ADCC和CDC的效應(yīng)功能，從而改善單鏈抗體的性能，F(xiàn)c效應(yīng)區(qū)的引入使得構(gòu)建的基因工程抗體分子更接近于天然抗體分子的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)c區(qū)能與ProteinA或者ProteinG結(jié)合，這也方便了抗體分子的分離純化。本實(shí)驗(yàn)還采用鼠IgK鏈的信號(hào)肽序列，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.0/scFv-Fc，通過(guò)脂質(zhì)體法將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/scFv-Fc和標(biāo)志質(zhì)粒pSV-dhfr，共轉(zhuǎn)染入CHO/dhfr細(xì)胞。通過(guò)不斷給藥加壓篩選scFv-Fc穩(wěn)定、高效表達(dá)的細(xì)胞株，并且對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化鑒定，為hsBAFF全人源性基因工程抗體scFv-Fc的規(guī)模化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明采取哺乳動(dòng)物細(xì)胞株表達(dá)系統(tǒng)，所表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子，同時(shí)減少免疫交叉反應(yīng)。并且采用MTX作用于dhfr的基因擴(kuò)增系統(tǒng)，從而使轉(zhuǎn)染基因得到非常高水平的擴(kuò)增和表達(dá)，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間篩選得到的細(xì)胞株在無(wú)血清培養(yǎng)基中成長(zhǎng)可以方便地生產(chǎn)抗體，并且易于純化。因此，本發(fā)明利用hBAFF的單鏈抗體scFv生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體，具有穩(wěn)定、高效的優(yōu)點(diǎn)，且可以針對(duì)人類(lèi)自身免疫性疾病(SLE，RA等)的臨床診斷試劑和潛在治療效果的基因工程藥物。圖l是載體構(gòu)建示意2是SDS-PAGE和Westernblotting檢測(cè)純化后的蛋白純度以及是否形成同源二聚體圖3是通過(guò)ELISA法檢測(cè)scFv-Fc識(shí)別抗原的特異性圖4是通過(guò)ELISA法檢測(cè)scFv-Fc與抗原結(jié)合的親和效率圖5是以BAFF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞K-562為靶細(xì)胞，乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)scFv-Fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity)圖6是流式細(xì)胞法(FACS)檢測(cè)scFv-Fc與跨膜表達(dá)BAFF全長(zhǎng)的人淋巴細(xì)胞的抄A5口PI圖7是通過(guò)ELISA法檢測(cè)scFv和scFv-Fc靜脈注射小鼠后在血清中的耐受時(shí)間的比較圖8是MTT法比較scFv-Fc體外抑制hBAFF對(duì)人外周血B淋巴細(xì)胞的增殖作用具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。以下實(shí)施例中，pcDNA3.0購(gòu)自Invitrogene公司；中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞二氫葉酸還原酶缺陷株(CHO/dhfr)和質(zhì)粒pSV-dhfr由南京川博生物技術(shù)有限公司胡云龍博士饋贈(zèng)；所說(shuō)的人IgGlFc(hinge十CH2+CH3)cDNA的序列如SEQIDNO.2。實(shí)施例一BAFF人源性單克隆抗體的生產(chǎn)、純化及鑒定1.BAFF人源性單克隆抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建如圖l所示，通過(guò)over-lapPCR技術(shù)將scFv和Fc的基因序列拼合；利用引物延伸PCR技術(shù)，通過(guò)三次PCR將鼠IgK信號(hào)肽連接在scFv-Fc序列的氨基端；再將目的基因與pcDNA3.0質(zhì)粒分別用MmiIII和五coRV內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；將酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pcDNA3.0/scFv-Fc。具體是1.1根據(jù)通過(guò)PhageDisplay技術(shù)篩選的hBAFF的單鏈抗體scFv和人IgGlFc(hinge十CH2+CH3)cDNA序列設(shè)計(jì)如下引物PscFvl:5，GCGGAGGTGCAGCTGGTG3，PscFv2:5，G3XMC4r7TG4GTGCGGCCGC3，PFcl:5，CCCA4J7Ur7Ur04CAAAACTCACAC3'PFc2:5，GAAGCTGATATCTTATTTACCCGGGGAC3'伸拼接技術(shù)合成scFv-Fc。1.2根據(jù)鼠IgGK鏈和scFv-Fc序列設(shè)計(jì)如下引物:IgK信號(hào)肽plgKl:IgK信號(hào)肽plgK2:IgK信號(hào)肽與scFv互補(bǔ)區(qū)域plgK3:5，7UGG7TCC4GGr7UC^C7GGr04CGCGGCGGAGGTGCAGCTGGTG3，其中plgKl，plgK2和plgK3斜體部分為信號(hào)肽，plgKl含由ff/MdIH酶切位點(diǎn)和Kozak序列，plgK3含由與scFv互補(bǔ)區(qū)域。利用引物延伸技術(shù)合成信號(hào)肽之后，通過(guò)重疊拼接技術(shù)將信號(hào)肽與scFv-Fc結(jié)合并將得到的序列酶切后轉(zhuǎn)入pcDNA3.0真核表達(dá)載體，表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA3.0/scFv-Fc。2.抗hsBAFF全人源性基因工程抗體scFv-Fc的穩(wěn)定表達(dá)采用中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞二氫葉酸還原酶缺陷株(CHO/dhfr)。脂質(zhì)體法將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/scFv-Fc和標(biāo)志質(zhì)粒pSV-dhfr，共轉(zhuǎn)染入CHO/dhfr細(xì)胞；先利用G418篩選轉(zhuǎn)染成功的克隆，接著利用不含次黃嘌呤和胸腺嘧啶(H.T.)的MEM選擇培養(yǎng)液，篩選dhfr陽(yáng)性細(xì)胞克隆株；ELISA檢測(cè)選擇高表達(dá)的細(xì)胞株，繼續(xù)培養(yǎng)，放棄低表達(dá)的細(xì)胞株。等到轉(zhuǎn)染細(xì)胞長(zhǎng)滿平板，l:6接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)皿，在低濃度MTX(0.0005(iM)加壓下，待抗性基因克隆形成，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的dhfr基因已經(jīng)得到了表達(dá)，等到細(xì)胞長(zhǎng)滿平板，按照1:6接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)皿，提高M(jìn)TX濃度(0.002pM)進(jìn)行下一輪加壓篩選，如此經(jīng)過(guò)7輪篩選，直到MTX增加到20pM。獲得scFv-Fc穩(wěn)定、高效表達(dá)的細(xì)胞株。3.表達(dá)產(chǎn)物的純化經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間篩選之后，將得到的高表達(dá)細(xì)胞株轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基(CHO-S-SFMII)在微量控制搖瓶(spinnerflask)中生產(chǎn)scFv-Fc。約1L培養(yǎng)后的上清被收集后離心(13000rpm，4。C20min)以去除細(xì)胞碎片。用lMNaOH調(diào)節(jié)上清液，使得pH值在7.5左右；利用BiologicLP層析系統(tǒng)，上清液以0.5ml/min流速上樣至結(jié)合緩沖液(1MTris-HCl，pH7.5)預(yù)平衡的rProteinASepharoseFastFlow親和層析柱(0.8cm,2cm);用結(jié)合緩沖液以0.5ml/min流速?zèng)_洗，至流出液0028()值到達(dá)基線；收樣留以電泳；用洗脫緩沖液(0.05MGly-HCl，pH3.0)以0.5ml/min流速洗脫抗體，至流出液OD2肌值到達(dá)基線，每1ml作為一管，分步收集；立即用0.5ml中和緩沖液(1MTris-HCl，pH8.8)為溶液中和收集到的抗體溶液；將收集的靶蛋白于4'C對(duì)純水透析16h，過(guò)濾除菌，-70°<:分裝冷凍保存。4.SDS-PAGE及westernblot鑒定將lOpl樣品分別加入等量含或不含P-巰基乙醇的2x上樣緩沖液，恒壓100V進(jìn)行12%SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R250染色顯帶分析。同樣的樣品在12%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，5%脫脂奶粉封閉后，加HRP偶聯(lián)的羊抗人IgGlFc，37°C孵育lh，TMB顯色(具體參照Currentprotocolinimmunologyunit8.10).結(jié)果顯示scFv-Fc在還原條件下分子量為55kDa左右，而在非還原條件下通過(guò)二硫鍵形成類(lèi)似于天然抗體的二聚體(圖.2)。5.純化的scFv-Fc的生物學(xué)活性鑒定5.1.用0.02M，pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將牛血清白蛋白(BSA)、人誘導(dǎo)增殖配體胞外可溶區(qū)片斷(hsAPRIL)、鼠B淋巴細(xì)胞激活因子胞外可溶區(qū)片斷(msBAFF)和人B淋巴細(xì)胞激活因子胞外可溶區(qū)片(hsBAFF)蛋白系列稀釋至10pg/ml、lng/ml、0.1pg/ml和0.05pg/ml，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加100pl，每個(gè)樣品重復(fù)三孔，4'C包被過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3mim用5%脫脂牛奶每孔加入200nl，37匸封閉2h;加入100pl1:1000稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗人IgGlFc多克隆抗體，置37X:孵育1小時(shí)，然后洗滌；加入1:1000稀釋的HRP酶標(biāo)記的鼠抗His6tag的單抗(識(shí)別scFv)或者HRP酶標(biāo)記的羊抗人IgGFc多克隆抗體(識(shí)別scFv-Fc和人IgGl)，置37'C孵育1小時(shí)，然后洗滌；于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的OPD底物溶液100pi，室溫反應(yīng)20分鐘；于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸50pi;在ELISA檢測(cè)儀上490nm讀數(shù)，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值(圖3)。結(jié)果顯示，隨著包被抗原h(huán)sBAFF濃度的升高，OD值劑量依賴(lài)性的增加，即使抗原濃度達(dá)到10嗎/ml，scFv-Fc與BSA，hsAPRIL和msBAFF仍不能發(fā)生交叉反應(yīng)。這些結(jié)果表明scFv-Fc具有特異性的抗原識(shí)別能力。5.2用碳酸鹽包被緩沖液將hsBAFF蛋白稀釋成兩個(gè)系列系列1為固定hsBAFF蛋白濃度為10嗎/ml，系列2為將hsBAFF蛋白梯度稀釋至蛋白質(zhì)含量分別為0.04|ag/ml、0.12fig/ml、0.4|ig/ml、1.2|ig/ml、3.6(ig/ml、11jag/ml、33|ig/ml、100pg/ml。與ELISA法檢測(cè)scFv-Fc抗原識(shí)別特異性相同的步驟鑒定抗體的親和效率。結(jié)果如圖4A所示，隨著scFv-Fc抗體濃度的梯度上升，OD值呈劑量依賴(lài)性的增加，但陰性對(duì)照抗體人IgGl濃度即使達(dá)到100ng/ml，hsBAFF與之反應(yīng)也呈陰性；同時(shí)包被一系列抗原濃度，固定抗體濃度，結(jié)果如Fig.4B所示，隨著hsBAFF濃度的梯度上升，OD值也劑量依賴(lài)性的增加，但濃度即使達(dá)到100ug/ml，hsBAFF與陰性對(duì)照抗體人IgGl的反應(yīng)也呈陰性。這些數(shù)據(jù)表明相比于scFv單鏈抗體，scFv-Fc能夠更好的識(shí)別hsBAFF抗原。5.3K-562人淋巴瘤細(xì)胞重懸于含10%小牛血清1640培養(yǎng)液中，調(diào)細(xì)胞濃度至lxl05/ml，即為備用的靶細(xì)胞。利用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血中的單核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。將不同濃度效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞懸液各100pl加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)加入50pl不同濃度的scFv-Fc溶液，每份樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照和最大釋放對(duì)照，利用乳酸脫氫酶釋放法，選擇570nm在ELx800型酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收」(absorbance)值，并計(jì)算殺傷效率。計(jì)算公式殺傷效率(％)=(實(shí)驗(yàn)組^值-自然釋放對(duì)照X值)/(最大釋放對(duì)照X值-自然釋放對(duì)照^值)xlOO。結(jié)果如圖5所示，重組融合蛋白scFv-Fc的Fc片斷顯示出了與天然抗體類(lèi)似地由Fc片段所介導(dǎo)的抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity)5.4將5xl05/mlK-562細(xì)胞用PBS清洗2遍后，加入2叱scFv-Fc孵育1小時(shí)，PBS洗滌2遍后加入FITC標(biāo)記的羊抗人IgGFc單克隆抗體，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)scFv-Fc與跨膜表達(dá)BAFF全長(zhǎng)的人淋巴細(xì)胞的結(jié)合(圖.6)。結(jié)果顯示scFv-Fc可以與跨膜表達(dá)BAFF全長(zhǎng)的人淋巴細(xì)胞的結(jié)合。5.5十六只雄性ICR小鼠分為兩組，每組8只分別尾靜脈注射scFv和scFv-Fc，分別于3、6、24、48和72小時(shí)釆取血樣，通過(guò)上文描述的ELISA法檢測(cè)scFv和scFv-Fc靜脈注射小鼠后在血清中的耐受時(shí)間的比較(圖7)。結(jié)果顯示scFv在注射后24小時(shí)就無(wú)法在小鼠血清中被檢測(cè)出，而scFv-Fc在注射后72小時(shí)仍然能夠被檢測(cè)到。此結(jié)果提示我們scFv-Fc大大延長(zhǎng)了抗體在小鼠血清中的耐受時(shí)間。5.6利用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血淋巴細(xì)胞，之后用帶有CD19抗體的磁珠分離B淋巴細(xì)胞，然后用含有10%小牛血清的RPMI1640稀釋細(xì)胞到2xl05/ml制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔100til，隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37'C，含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中適應(yīng)性培養(yǎng)4h。將適應(yīng)性培養(yǎng)4h之后的細(xì)胞分為9組，每組3孔，這8組的設(shè)置如下1對(duì)照組2hsBAFF(2嗎/ml)組3anti-IgM(2昭/ml)組4hsBAFF(2昭/ml)十a(chǎn)nti-IgM(2嗎/ml)組5hsBAFF(2ng/ml)十a(chǎn)nti-IgM(2fig/ml)+hlgG1(10pg/ml)組6hsBAFF(2昭/ml)+anti-IgM(2嗎/ml)+scFv-Fc(0.5嗎/ml)組7hsBAFF(2昭/ml)十a(chǎn)nti-IgM(2昭/ml)+scFv-Fc(1pg/ml)組8hsBAFF(2昭/ml)+anti-IgM(2|ag/ml)+scFv-Fc(5嗎/ml)組9hsBAFF(2pg/ml)十a(chǎn)nti-IgM(2嗎/ml)+scFv-Fc(10pg/ml)組將相應(yīng)劑量的hsBAFF與抗體加入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37°C、含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h之后，每孔加入5mg/mlMTT溶液10pl，然后37°C孵育4h，然后每孔加入DMSO100^溶解沉淀物。選擇570nm在ELX800型酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收」值。結(jié)果如圖8，hsBAFF在anti-IgM協(xié)調(diào)作用下能夠強(qiáng)烈刺激B淋巴細(xì)胞增殖，如果同時(shí)加入一系列梯度稀釋的scFv-Fc后，B淋巴細(xì)胞增殖梯度依賴(lài)型的受到抑制，尤其scFv-Fc達(dá)到2pg/ml時(shí)候，抑制程度最高，而人IgGl濃度即使在10^g/ml也不能抑制B淋巴細(xì)胞增殖。SEQUENCELISTING〈110〉南京師范大學(xué)<120>hBAFF的單鏈抗體scFv及其在生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體中的應(yīng)用<160>3〈210>1〈211〉723〈212〉cDNA〈213〉人(Homo)〈400〉1gcggcgg鄉(xiāng)tgcagctggtggsgtctggggg鄉(xiāng)cttggtseagectggggggtccctg60agactctcctgtgeaggetctggattcaccttcagtagctatgetatgeactgggUcgc120caggctccaggaaaaggtctggagtgggtatcagctattggtactggtggtggcacatsc180tatgcag已ctccgtgaagggccgattcaccacctccagag8caatgcc犯gaattccttg240tgaacagectg卿gccgaggacacggccgtgtattactgtgcaagaaag300atttctgagcettggggecaaggtaccctggtcaccgtctcgagtggtgg鄉(xiāng)cggttca360ggcggaggtggetctggeggtagtgeaetttcttctgagctgactcaggaccctgctgtg420tctgtggccttgggac卿cagtcaggatcacatgcc犯ggag已cagcctcagaagctat■tstgc犯gctggtaccagcag卿ccaggacaggcccctgtacttgtcatctatggt犯已540aacaaccggccctcagggatcccagaccgattctctggctccagctcagg^3C8CagCt600tccttgaccatcactggggctc已ggcgg犯g3tg鄉(xiāng)ctgactattactgtaactcccgg660gacagcagtg已taaccatgtatteggeggagggaegetgaccgtcct鄉(xiāng)tgcggcc720get723〈210〉2〈211〉696〈212〉c腿<213〉人(Homo)〈400〉2cccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggg60ggaccgtcagtcttcctcttcccccca^a<cccaaggacaccctcatgatctcccggacc120cctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagecacgaagsccctg已ggtcaagttcaac180tggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgecaagacaaagccgcggg已ggagcagtac240已ccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc300agtgca鄉(xiāng)tctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaa3acc3tc360tccaaagccaaagggcageeccgag犯ccacaggtgtacaccctgcccccatecegggag420gagaitgscc已a(bǔ)gaaCCElggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgac480atcgccgtggagtggg卿gcaatgggcag已ctacaagaccacgcctccc540gtgctggactccgacggctccttcttcctctatagc犯gctcaccatgg已caagagcagg600<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1、一種人B淋巴細(xì)胞激活因子的單鏈抗體scFv，其特征在于，有SEQIDNO.1所示的序列。2、權(quán)利要求1所說(shuō)的人B淋巴細(xì)胞激活因子的單鏈抗體scFv,生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體中的應(yīng)用。3、根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟(1)BAFF人源性單克隆抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建將hBAFF的單鏈抗體scFv和人IgGlFc(hinge+CH2+CH3)cDNA序列連接，合成scFv-Fc，所說(shuō)的scFv-Fc的序列如SEQIDN0.3;利用引物延伸技術(shù)將鼠IgGk鏈信號(hào)肽與scFv-Fc結(jié)合，并將得到的序列酶切后轉(zhuǎn)入pcDNA3.0真核表達(dá)載體，表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA3.0/scFv-Fc;(2)抗hsBAFF全人源性基因工程抗體scFv-Fc的穩(wěn)定表達(dá)采用中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞二氫葉酸還原酶缺陷株CHO/dhfr，脂質(zhì)體法將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/scFv-Fc和標(biāo)志質(zhì)粒pSV-dhfr，共轉(zhuǎn)染入CHO/dhfr細(xì)胞；先利用G418篩選轉(zhuǎn)染成功的克隆，接著利用不含次黃嘌呤和胸腺嘧啶的MEM選擇培養(yǎng)液，篩選dhfr陽(yáng)性細(xì)胞克隆株；之后氨甲喋吟濃度梯度增高，加壓擴(kuò)增外源基因，提高scFv-Fc表達(dá)量，經(jīng)過(guò)多輪加壓培養(yǎng)，篩選到scFv-Fc穩(wěn)定、高效表達(dá)的細(xì)胞株；(3)scFv-Fc的表達(dá)純化將得到的高表達(dá)細(xì)胞株轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)生產(chǎn)scFv-Fc;收集上清、離心，ProteinA親和層析純化蛋白，再將收集的蛋白于4'C對(duì)純水透析16h，過(guò)濾除菌后，-701:分裝冷凍保存。4、根據(jù)權(quán)利要求3所說(shuō)的應(yīng)用方法，其特征在于，所說(shuō)的步驟(1)具體是根據(jù)單鏈抗體scFv和人IgGlFc(hinge+CH2+CH3)cDNA序列設(shè)計(jì)如下引物PscFvl:5，GCGGAGGTGCAGCTGGTG3，PscFv2:5，G7CMC47YT04GTGCGGCCGC3'PFc1:5，CCC7TT7Ur04CAAAACTCACAC3'PFc2:5，GAAGCTGATATCTTATTTACCCGGGGAC3'其中PscFv2和PFcl斜體部分為互補(bǔ)區(qū)域，PFc2含由^BL酶切位點(diǎn)，利用重疊延伸拼接技術(shù)合成scFv-Fc;根據(jù)鼠IgGk鏈和scFv-Fc序列設(shè)計(jì)如下引物KozakIgK信號(hào)肽plgKl:IgK信號(hào)肽plgK2::IgK信號(hào)肽與scFv互補(bǔ)區(qū)域plgK3:5，TGGG7TCC4GGr7TC爿CTGGr04CGCGGCGGAGGTGCAGCTGGTG3，其中pIgKl，plgK2和pIgK3斜體部分為信號(hào)肽，PlgKl含由歷'MdIII酶切位點(diǎn)和Kozak序列，plgK3含由與scFv互補(bǔ)區(qū)域；利用引物延伸技術(shù)合成信號(hào)肽之后，通過(guò)重疊拼接技術(shù)將信號(hào)肽與scFv-Fc結(jié)合并將得到的序列酶切后轉(zhuǎn)入pcDNA3.0真核表達(dá)載體，表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA3.0/scFv-Fc。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及hBAFF的單鏈抗體scFv，以及其在BAFF人源性單克隆抗體制備中的應(yīng)用。所說(shuō)的hBAFF的單鏈抗體scFv，其序列如SEQIDNO.1所示。所說(shuō)的hBAFF的單鏈抗體scFv能應(yīng)用于生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體。本發(fā)明利用hBAFF的單鏈抗體scFv生產(chǎn)BAFF人源性單克隆抗體，具有穩(wěn)定、高效的優(yōu)點(diǎn)，且可以針對(duì)人類(lèi)自身免疫性疾病(SLE，RA等)的臨床診斷試劑和潛在治療效果的基因工程藥物。文檔編號(hào)C12N15/13GK101240024SQ200810018940公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日發(fā)明者張雙全,萌曹申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)