專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種促胰島素分泌肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法一種促胰島素分泌肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種促胰島素分泌肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法，屬于長(zhǎng)效重組融合蛋白藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明通過(guò)多個(gè)Exendin-4多肽重復(fù)序列和人血清白蛋白的融合，在保持了Exendin-4的藥理特性的基礎(chǔ)上延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明涉及治療非胰島素依賴(lài)性糖尿病及肥胖癥的長(zhǎng)效藥物的制備。技術(shù)背景促胰島素分泌肽(Exendin-4)是一種刺激胰島素分泌的肽激素，含39個(gè)氨基酸，早年是從生長(zhǎng)在美國(guó)西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥(Gilamonster)唾液中發(fā)現(xiàn)的一種激素物質(zhì)，其氨基酸序列有53%與人類(lèi)血液中調(diào)控血糖激素即胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)同源。該物質(zhì)具有直接降血糖，促胰腺分泌胰島素作用，是GLP-1受體(GLP-1R)的潛在激動(dòng)劑；還可以通過(guò)減緩胃腸道的蠕動(dòng)使食物的吸收減慢，從而降低食物中的葡萄糖在血液內(nèi)出現(xiàn)的高峰。同時(shí)，由于不被二肽基肽酶一IV(DPP-IV)降解，Exendin-4在人體內(nèi)的半衰期為2-3小時(shí)，遠(yuǎn)長(zhǎng)于GLP-1的1-2分鐘，其穩(wěn)定性和生物活性明顯高于GLP-1，顯示較GLP-1更好的治療效果。目前人工合成的Exendin-4(Byetta)已被用于治療II-型糖尿病患者。然而，由于它的分子量小，能被腎臟快速清除，患者還是需要每天注射兩次才能獲得滿意的治療效果，血清濃度變化很大，即使一天注射兩次亦不能持續(xù)刺激GLP-1R，給患者帶來(lái)諸多不便。Exendin-4展示了比GLP-1更強(qiáng)的降血糖效應(yīng)，開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效Exendin-4類(lèi)藥物將更有利于提高其治療II型糖尿病的效果。藥物研發(fā)人員正在嘗試改變其分子結(jié)構(gòu)，使藥物在降糖的同時(shí)還能延長(zhǎng)其在體內(nèi)的持續(xù)效果。如Lilly公司采用基因工程方法將Exendin-4與免疫球蛋白(IgG)的Fc段融合；加拿大ConjuChem公司開(kāi)發(fā)研制的Exendin-4與人血清白蛋白(Recombumin)在體外結(jié)合產(chǎn)生CJC-1134-PC;Exendin-4與聚乙二醇(PEG)以水解化學(xué)鍵融合的PEG40,000-FMS-Exendin-4。白蛋白是人血清中的主要蛋白組分，占血清總蛋白量的一半。人血清白蛋白由585個(gè)氨基酸組成，分子量為66KD。人血清白蛋白表現(xiàn)出多樣性，有30種變異分子。人血清白蛋白基因已經(jīng)被克隆(A.Drgaiczyketal，PNAS，79:71-75，1982)，并被成功地應(yīng)用在多種體外表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。人血清白蛋白生物學(xué)詳細(xì)功能不詳，但是其功能可能是多方面的。白蛋白在正常生理狀況下不易透過(guò)腎小球，在血清中的半衰期達(dá)14-21天。白蛋白由于具有較長(zhǎng)的半衰期，也可以作為一種載體通過(guò)與血液中的其它因子，包括生物活性蛋白的結(jié)合，從而保持或延長(zhǎng)其它因子在體內(nèi)的生物活性。將一些小分子肽或蛋白質(zhì)藥物與白蛋白進(jìn)行融合是改進(jìn)小分子蛋白或多肽藥物半衰期的有效方法。與其它方法相比，構(gòu)建長(zhǎng)效白蛋白融合蛋白藥物可以避免復(fù)雜的化學(xué)修飾和處理過(guò)程，因而具有容易操作和更好的經(jīng)濟(jì)性?xún)?yōu)勢(shì)。白蛋白作為一種藥物載體，在臨床上己經(jīng)獲得了應(yīng)用，如已成熟的長(zhǎng)效白蛋白融合蛋白藥物有胰島素，人生長(zhǎng)激素，白介素，干擾素。使用白蛋白作為載體，不僅可以延長(zhǎng)藥物的半衰期，使這些藥物的治療效果及藥理特性獲得明顯的改善。利用基因工程技術(shù)，將白蛋白與具有生物活性的蛋白分子進(jìn)行重組表達(dá)構(gòu)建融合蛋白，已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效蛋白藥物的一個(gè)重要手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種促胰島素分泌肽與人血清白蛋白的融合蛋白長(zhǎng)效藥物及其制備方法。本發(fā)明的目的還在于開(kāi)發(fā)一類(lèi)具有高活性、高穩(wěn)定性、低副作用的降血糖藥物，在保持Exendin-4的生理特性的基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)其半衰期，使之成為新一代長(zhǎng)效治療糖尿病藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案一種促胰島素分泌肽與人血清白蛋白的融合蛋白，含有2個(gè)多肽區(qū)，其l區(qū)由多個(gè)促胰島素分泌肽Exendin-4重復(fù)序列組成，其2區(qū)是人血清白蛋白HSA，1區(qū)通過(guò)其C-末端與第2區(qū)的N-末端直接連接，或1區(qū)通過(guò)其N(xiāo)末端與2區(qū)的C-末端直接連接，中間不加入任何連接肽，其結(jié)構(gòu)式是:(Exendin-4)n-HSA，n為Exendin-4多肽重復(fù)序列組成的重復(fù)次數(shù)，n為2-8。其Exendin-4氨基酸序列與序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性。其1區(qū)的優(yōu)選結(jié)構(gòu)為(Exendin-4)2，得到(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，該結(jié)構(gòu)可以增強(qiáng)融合蛋白的生物活性。所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，其Exendin-4重復(fù)序列各個(gè)序列之間的連結(jié)方式為上一個(gè)Exendin-4的C末端與下一個(gè)Exendin-4的N末端直接連接，中間不加入任何連接肽。所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，2區(qū)多肽選自人血清白蛋白HSA，其氨基酸序列與序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性。所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其核苷酸序列編碼為SEQIDNO:3。所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其氨基酸序列為SEQIDNO:4。所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其重組核苷酸序列插入在一種表達(dá)載體和細(xì)胞宿主系統(tǒng)。所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白的制備方法，包括轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白分離和純化，以及鑒定步驟。所述(Exendin-4)n-HSA融合蛋白的應(yīng)用，是使哺乳動(dòng)物血糖水平正?；?，用于制備非胰島素依賴(lài)性糖尿病及肥胖者的治療制劑。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，制備促胰島素分泌肽融合蛋白長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物,其長(zhǎng)效方案包括一是該融合蛋白中含有Exendin-4重復(fù)序列(Exendin-4)n;二是該融合蛋白含有在人血液中具有長(zhǎng)半衰期的人血清白蛋白HSA肽段。通過(guò)生化以及細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，(Exendin-4)n-HSA融合蛋白比Exendin-4藥物具有更好的穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期。本發(fā)明中的Exendin-4氨基酸序列是為39個(gè)氨基酸，與序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性，優(yōu)選同源性是95%。其中可以有多種氨基酸位點(diǎn)的替代，目的是使該活性肽更穩(wěn)定，活性更高。本發(fā)明中的HSA氨基酸序列與序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性，優(yōu)選同源性是95%。其中可以有多種氨基酸位點(diǎn)的替代，目的是使該活性肽更穩(wěn)定，活性更高。本發(fā)明提供一種人血清白蛋白HSA與多個(gè)Exendin-4多肽重復(fù)序列所形成的融合蛋白活性分子。該融合蛋白是由HSA與Exendin-4化合物直接連接而成，中間不加入任何連接肽。連接方式可以是以Exendin-4多肽的C-末端直接連接在HSA多肽的N-末端，即(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，也可以是以Exendin-4多肽的N-末端直接連接在HSA多肽的C-末端，即HSA-(Exendin-4)n。優(yōu)選連接方式是(Exendin-4)n-HSA。Exendin-4多肽重復(fù)序列的銜接方式為，其中的每一個(gè)Exendin-4單體均直接以同一方向排列。具體地，每一個(gè)Exendin-4多肽單體的N-末端直接連接在上一個(gè)多肽Exendin-4多肽單體的C-末端；每一個(gè)Exendin-4多肽單體的C-末端直接連接在下一個(gè)Exendin-4多肽單體的N-末端，其結(jié)構(gòu)式為(Exendin-4)n。其中Exendin-4多肽單體的重復(fù)數(shù)為2-8，優(yōu)選的重復(fù)數(shù)為2，表示為(Exendin-4)2，該結(jié)構(gòu)可以增強(qiáng)融合蛋白的生物活性。(Exendin-4)2與HSA融合形成的融合蛋白表示為(Exendin-4)rHSA。本發(fā)明為了使獲得表達(dá)的融合蛋白正確折疊,并且能夠進(jìn)行外分泌，(Exendin-4)rHSA融合蛋白的N-末端連接有信號(hào)肽。具體地，在進(jìn)行(Exendin-4)2基因合成時(shí)在其上游5'端加上HSA的信號(hào)肽，并使其與(Exendin-4)2進(jìn)行框內(nèi)融合。編碼該信號(hào)肽的核苷酸序列atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcga。本發(fā)明優(yōu)選的質(zhì)粒是pYES3/CT，適合在酵母工程菌中表達(dá)。但是，本發(fā)明中的融合蛋白也可選擇利用其它質(zhì)粒來(lái)表達(dá)，這些表達(dá)質(zhì)粒包括但是不局限于原核、真核表達(dá)系統(tǒng)常用的質(zhì)粒。具體地，該表達(dá)質(zhì)粒含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，用以控制融合蛋白的表達(dá)。這些啟動(dòng)子包括但是不局限于以下所述啟動(dòng)子GALl,優(yōu)選的啟動(dòng)子為GALl。本發(fā)明為使表達(dá)的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白不帶有任何本融合蛋白以外氨基酸殘基，在HSA基因的3'未端加入終止密碼子，使融合蛋白轉(zhuǎn)譯過(guò)程中不會(huì)帶上表達(dá)載體上的任何成份。本發(fā)明提供構(gòu)建上述優(yōu)選的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法及工程菌構(gòu)建方法。首先克隆獲得一重組多聚核苷酸序列，該序列含有編碼HSA多肽區(qū)的核苷酸序列區(qū)和編碼Exendin-4多肽區(qū)的核苷酸序列區(qū)。編碼HSA多肽區(qū)的氨基酸序列與序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性。編碼Exendin-4多肽區(qū)的氨基酸序列與序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性。具體地，通過(guò)PCR技術(shù)，從人胎肝來(lái)源的RNA中反轉(zhuǎn)錄獲得編碼HSA多肽區(qū)的核苷酸序列，并使HSA基因的5鄰3'端分別帶有&m/fl、的酶切位點(diǎn)，將HSA片段插入到TA克隆載體pCR2.1(購(gòu)自Invitrogen公司)中，獲得HSA/pCR2.1重組質(zhì)粒。編碼HSA信號(hào)肽(Sig)和(Exendin-4)2多肽區(qū)的核苷酸序列通過(guò)人工合成，獲得Sig-(EXendin-4)2，并在其5'端帶有^wz//1酶切位點(diǎn)，3'端帶有C/al酶切位點(diǎn)。將Sig-(Exendin-4)2片段插入到TA克隆載體pCR2.1中，獲得Sig-(Exendin-4VpCR2.1重組質(zhì)粒。使用限制性?xún)?nèi)切酶S"m//1、C7al對(duì)重組質(zhì)粒Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1進(jìn)行酶切，制備Sig-(Exendin-4)2DNA片段；使用限制性?xún)?nèi)切酶Sam/H和Ctol對(duì)重組質(zhì)粒HSA/pCR2.1進(jìn)行酶切，制備線性化的HSA/pCR2.1質(zhì)粒DNA(不含有HSA信號(hào)肽)；將Sig-(Exendin-4)2DNA片段與線性化的HSA/pCR2.1質(zhì)粒DNA連結(jié)，產(chǎn)生含有Sig-(Exendin-4)2-HSA融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒EXHSA/pCR2.1。將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，再轉(zhuǎn)種到含有氨芐青霉素(AMP)的LB平板進(jìn)行繁殖和保種。用限制性?xún)?nèi)切酶5am/fl、￡coil同時(shí)切割重組質(zhì)粒EXHSA/pCR2.1和表達(dá)質(zhì)粒pYES3/CT(購(gòu)自Invitrogen公司)，分別制備Sig-(Exendin-4)2-HSA融合基因片段和線性化pYES3/CT質(zhì)粒片段；將純化的Sig-(EXendin-4)2-HSA融合基因片段和線性化pYES3/CT質(zhì)粒片段用T4DNA連結(jié)酶進(jìn)行連結(jié)，構(gòu)建能表達(dá)(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒EXHSA-pYES3/CT，將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，再轉(zhuǎn)種到含有氨芐青霉素(AMP)的LB平板進(jìn)行繁殖和保種。本發(fā)明表達(dá)(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的重組質(zhì)粒EXHSA-pYES3/CT可在多種酵母菌中表達(dá)，其優(yōu)選的酵母菌是釀酒酵母，其優(yōu)選菌株是INVScl(購(gòu)自Invitrogen公司)。本發(fā)明提供一種工程菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的方法。具體地，將含有重組表達(dá)質(zhì)粒EXHSA-pYES3/CT的單個(gè)酵母菌(INVScl)菌落接種到選擇性培養(yǎng)基SCTip—(酵母基本氮源YNB0.67%，葡萄糖2%，省卻營(yíng)養(yǎng)物的氨基酸等混合物見(jiàn)附錄)中，3(TC振搖過(guò)夜。計(jì)算獲得50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基OD6。(T0.4所需要過(guò)夜培養(yǎng)物的總量。離心收集菌體沉淀，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(酵母基本氮源YNB0.67%,半乳糖2%,棉籽糖1%，省卻營(yíng)養(yǎng)物的氨基酸等混合物見(jiàn)附錄)懸浮，并轉(zhuǎn)種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)酵，3(TC振搖培養(yǎng)24h，離心收集發(fā)酵上清液，-S(TC保存用于融合蛋白表達(dá)的分析和純化。融合蛋白的表達(dá)，可以通過(guò)一般的蛋白生化手段檢測(cè)，包括但不局限于SDS-PAGE，Westernblotting等。本發(fā)明也提供一種(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的分離純化方法。具體地，該分離純化方法利用了(Exendin-4)2-HSA的等電點(diǎn)pH5.5左右的特點(diǎn)，選擇陽(yáng)離子交換層析柱，使用SPSepharoseFF分離效果最好，目的蛋白質(zhì)洗脫峰最高，含雜最少。選擇SPSeharoseFF為填料，成功捕獲了發(fā)酵液中的產(chǎn)物(Exendin-4)2-HSA融合蛋白質(zhì)。捕獲的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白質(zhì)再經(jīng)過(guò)疏水型層析柱ButylSepharoseFF，陰離子交換層析DEAESepharoseFF進(jìn)行精細(xì)純化，目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度可以達(dá)98%以上。本發(fā)明也提供了一種鑒定(Exendin-4)2-HSA融合蛋白生物活性的方法。本發(fā)明也提供了一種測(cè)定(Exendin-4)2-HSA融合蛋白體外穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期鑒定的方法。具體地，檢測(cè)方法測(cè)定融合蛋白的活性的貨架壽命(shelflife)以及動(dòng)物體內(nèi)的活性半衰期。動(dòng)物包括但不限制于小鼠，狗，猴子，以及人類(lèi)。本發(fā)明的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白可以用于包括糖尿病等癥狀的治療。給藥方式可以是注射，口服，鼻內(nèi)，呼吸道等。為了提高用藥效果，本發(fā)明的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白也可以制成不同的劑型，包括但不限制于使用各種酸堿所形成的鹽形式。為了提高用藥效果，本發(fā)明的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白也可以與其他藥物共同使用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用基因重組技術(shù)，將多個(gè)Exendin-4多肽重復(fù)序列和人血清白蛋白融合，產(chǎn)生促胰島素分泌肽融合蛋白(Exendin-4)n-HSA，中間不加入任何連接肽，在保持Exendin-4的藥理特性的基礎(chǔ)上延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，在藥學(xué)領(lǐng)域包括II型糖尿病及肥胖癥治療將有良好的應(yīng)用前景。圖1:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖2:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的表達(dá)與純化。2A:1，ProteinMarker;2，3，4為(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表達(dá)上清液。2B:2，3，4為(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的Westemblotting識(shí)別圖。圖3:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的純化。1)ProteinMarker;2)發(fā)酵液；3)SPSepharoseFF洗脫收集；4)ButylSepharoseFF洗脫收集；5)DEAESepharoseFF洗脫收集。圖4:小鼠葡萄糖耐糖試驗(yàn)結(jié)果圖5:血漿胰島素測(cè)定圖6:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的長(zhǎng)效活性觀察圖7:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白在糖尿病模型鼠內(nèi)藥效的觀察圖8:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)具體實(shí)施方式以下所提供的實(shí)施例，可以更詳細(xì)地解釋本
發(fā)明內(nèi)容。但是，本發(fā)明的內(nèi)容并不限于這些實(shí)施例所闡述的內(nèi)容。實(shí)施例l:人白蛋白基因克隆白蛋白基因通過(guò)RT-PCR獲得。首先獲得人胎肝組織，并從中制備總RNA。然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄方法獲得cDNA。再用PCR分子克隆技術(shù)擴(kuò)增獲得白蛋白基因。具體說(shuō)明如下1、人胎肝總RNA的抽提將人胎肝組織在液氮中冷凍粉碎后，50-100mg/mL加入Trizol(購(gòu)自Invitrogen公司)，然后電動(dòng)勻漿l-2min，室溫放置5min，以12000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到一新管中，再按200pL/mL的比例加入氯仿混勻后室溫放置15min,4'C,12000g離心15min，將上清液再轉(zhuǎn)移到另一新管中，按每lmLTrizol加入0.5mL異丙醇，混勻后室溫放置5-10min;4°C、12000g離心10min，棄上清；用75%的乙醇洗滌沉淀的RNA，再以8000g離心5min，棄上清，室溫下干燥RNA沉淀，用50jiiL/mLH20溶解RNA，55-6(TC放置5-10min，用分光光度計(jì)測(cè)RNA的純度與含量。2、HSA基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)HSA1:5'-ATGGATCCGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTA-3'HSA2:5'-AAGAATTCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3'。RT-PCR反應(yīng)條件在一個(gè)0.2mL的PCR管中，加入5xRTPCR緩沖液(250mmol/LTris'ClpH8.3;375mmol/LKCl;15mmol/LMgC12;50mmol/LDTT;10mmol/LdATP，dCTP,dGTP，dTTP混合物(各2.5mmol/L))10pL，總RNA3pL(50ng),引物HSA10.5pL(25^iM)、HSA20.5|iL(25jaM)，RT國(guó)Taq混合酶lpL，加DEPC水到終體積50pL.PCR條件45°C30min;然后94""C變性2min;再按94。C，30min;55°C，lmin，72°C，2min，一共30個(gè)循環(huán)。最后，72°C，保溫5min。然后采用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳方法回收純的HSA基因片段。具體是用0.5%的agarose膠電泳酶切產(chǎn)物，切下1800bp左右的目的條帶，再用QIAgen公司的PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒純化HSA基因DNA片段。將HSA基因片段與PCR2.1TA克隆載體連結(jié)，構(gòu)建.HSA/pCR2.1重組質(zhì)粒，連結(jié)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,再經(jīng)含Ampicilin的LB平板篩選獲得HSA/pCR2.1重組質(zhì)粒菌株。用質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Promega)純化重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行DNA序列分析，確定HSA基因序列的正確性。實(shí)施例2:Sig-(Exendin-4)2基因合成與克隆Sig-(Exendin-4)2基因是利用人工合成方法獲得。按SEQIDNO:5的序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司Sig-(Exendin-4)2基因進(jìn)行合成，并使其5'和3'末端分別帶下^^i/1、Cfel的酶切位點(diǎn)。用以下引物Exl:5'-AAGGATCCAAAATGAAGTGGGTAAGCTTTATTTCCCT誦3'Ex2:5'隱TTAAATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCA-3'通過(guò)PCR對(duì)合成的Sig-(Exendin-4)2基因進(jìn)行擴(kuò)增。具體條件如下人工合成的單序列Exendin-4，10pL;10xpfUBuffer(500mmol/LKC1,100mmol/LTris'ClpH9.0,1.0%TritonX-100)5jiL;dNTPMixture,2fiL;pfUDNAPolymerase,0.5)iL;Exl，0.5pL(25)aM);Ex2，0.5pL(25|aM);ddH20，31.5|iL。然后，把加好樣品的PCR管放到PCR儀孔中，根據(jù)下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增94°C;2min;然后，94°C，30sec;55°C，20sec，72°C，50sec，共30個(gè)循環(huán)。最后，72°C，5min。所產(chǎn)生的PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用瓊脂糖電泳方法進(jìn)行分析,在紫外燈下觀察電泳情況。采用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收分子量約350bp的Sig-(Exendin-4)2DNA條帶。將Sig-(Exendin-4)2與pCR2.1TA克隆載體連結(jié)，構(gòu)建Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1重組質(zhì)粒，連結(jié)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)含Ampicilin的LB平板篩選獲得含Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1重組質(zhì)粒的菌株。用質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Promega)純化重組質(zhì)粒，DNA序列分析確保Sig-(Exendin-4)2的正確性。實(shí)施例3:(Exendin-4)2-HSA融合基因的構(gòu)建與克隆以(Exendin-4)2和HSA基因構(gòu)成(Exendin-4)2-HSA融合基因?yàn)槔?，說(shuō)明合成融合基因的方法。本方法也適合HSA基因與其它多個(gè)重復(fù)Exendin-4多肽基因形成融合基因的方法。具體如下。(一)通過(guò)培養(yǎng)含有Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1、HSA/pCR2.1重組質(zhì)粒的菌種，提取獲得該質(zhì)粒DNA。重組質(zhì)粒Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1用、C7al進(jìn)行雙酶切，采用瓊脂糖凝膠電泳回收Sig-(Exendin-4)2DNA片段；HSA/pCR2.1重組質(zhì)粒用C/"l、5amHl進(jìn)行雙酶切，同樣用瓊脂糖凝膠電泳回收線性化的HSA/pCR2.1DNA片段。(二)將回收Sig-(Exendin-4)2DNA片段DNA與HSA/pCR2.1DNA片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒Sig-(Exendin-4)2-HSA/pCR2.1。連接體系一般為10uL，雙酶切的HSA/pCR2.1質(zhì)粒載體與雙酶切Sig-(Exendin-4)2DNA的摩爾比為1:2-10，10xT4DNAligase緩沖液l|iL，T4DNAligaselpL,加無(wú)菌水至總體積為10jaL。連接反應(yīng)于16"C恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)16小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆鑒定是通過(guò)含Ampicilin的LB平板挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序確定融合基因序列的準(zhǔn)確性。實(shí)施例4:(Exendin-4)2-HSA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以下以(Exendin-4)2-HSA融合基因?yàn)槔?，說(shuō)明表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建。采用pYES3/CT為表達(dá)載體質(zhì)粒，其制備方法為常用分子生物學(xué)方法。即通過(guò)培養(yǎng)含有表達(dá)載體的菌種，提取獲得該質(zhì)粒。制備質(zhì)粒后-20'C保存待用。具體如下，先對(duì)表達(dá)載體質(zhì)粒pYES3/CT，進(jìn)行Baw/n、五coRl雙酶切。具體條件如下。表達(dá)載體質(zhì)粒pYES3/CT，10|iL;S"m//1l|iL,五co/llpL，10x酶切緩沖液(H)(購(gòu)自美國(guó)promega公司)，5pL;ddH20，33pL，總體積為50(iL。37'C恒溫水浴箱內(nèi)反應(yīng)3小時(shí)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收線性化的pYES3/CT質(zhì)粒DNA。Sig-(Exendin-4)2-HSA/pCR2.1DNA作同樣的雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收分子量約2100bp的Sig-(Exendin-4)rHSA基因片段。將回收的Sig-(Exendin-4)2-HSADNA與上述雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pYES3/CT連接構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒EXHSA-pYES3/CT。連接體系一般為10pL，雙酶切的pYES3/CT質(zhì)粒載體與雙酶切Sig-(Exendin-4)2-HSADNA的摩爾比為1:2-10，10xT4DNAligase緩沖液1)iL,T4DNAligaselnL，加無(wú)菌水至總體積為10pL。連接反應(yīng)于16"C恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)16小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆鑒定是通過(guò)含Ampicilin的LB平板挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序確定融合基因序列的準(zhǔn)確性(圖l)。實(shí)施例5:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表達(dá)工程菌的構(gòu)建利用電轉(zhuǎn)化方法和(Exendin-4)2-HSA融合基因?yàn)槔?，說(shuō)明(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表達(dá)工程菌構(gòu)建的方法。具體方法如下。首先挑選含有EXHSA-pYES3/CT表達(dá)載體質(zhì)粒的細(xì)菌克隆，提取表達(dá)載體質(zhì)粒。然后，用電轉(zhuǎn)化的方法把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVScl中。質(zhì)粒DNA提取方法按Promega公司質(zhì)粒DNA純化試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母具體如下.先進(jìn)行菌體的準(zhǔn)備。挑取酵母單菌落，接種至含有5mLYPD培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，30°C、250-300r/min培養(yǎng)過(guò)夜。然后取100-500pL的培養(yǎng)物接種至含有500mL新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28~30°C、250-300r/min培養(yǎng)過(guò)夜，至OD,達(dá)到1-1.5。再將細(xì)胞培養(yǎng)物于4°C，1500g離心5min，用500mL的冰預(yù)冷的ddH20將菌體沉淀重懸。離心后，再用250mL的冰預(yù)冷的ddH20將菌體沉淀重懸。再離心，用20mL的冰預(yù)冷的lmol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。再離心，用lmL的冰預(yù)冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5mL。然后用電擊方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。具體如下將520pgEXHSA-pYES3/CT表達(dá)質(zhì)粒DNA溶解在5~10|iLTE溶液中，與80pL的上述感受態(tài)菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min。然后根據(jù)相應(yīng)的電轉(zhuǎn)化儀，采用優(yōu)化的電壓、電流、電容等參數(shù)，進(jìn)行電擊。電擊完畢后，加入lmL冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5mL的離心管中，將菌體懸液涂布于SCTrp-選擇性平板上，每20060(^L涂布一塊平板。將平板置于3(TC培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。推薦電擊參數(shù)為電壓1.5kV;電容25nF;電阻200Q。電擊時(shí)間為410msec。實(shí)施例6:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表達(dá)和純化EXHSA-pYES3/CT質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母，經(jīng)SCTip—篩選培養(yǎng)基平板挑選較飽滿的菌落接于SCTrpf帝選培養(yǎng)基([腺嘌呤,L-精氨酸，半胱氨酸，L-亮氨酸，L-賴(lài)氨酸,L-蘇氨酸，尿嘧啶]各0.01%)中擴(kuò)大培養(yǎng)，菌體生長(zhǎng)到一定濃度后接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中([L-天冬氨酸，L-組氨酸,L-異亮氨酸,L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸,脯氨酸，L-絲氨酸，L-酪氨酸，L-纈氨酸]各0.005%)發(fā)酵表達(dá)融合蛋白質(zhì)。發(fā)酵液經(jīng)離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析顯示70kd的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物條帶(圖示2A，2-4)，Westernbloting試驗(yàn)顯示能與Anti-Exendin-4抗體有特異性結(jié)合(圖示2B，2-4)。將發(fā)酵上清液過(guò)SPSepharoseFF柱，捕獲的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白質(zhì)，再經(jīng)過(guò)疏水型層析柱ButylSepharoseFF，陰離子交換層析DEAESepharoseFF分離精細(xì)純化，獲得純度可以達(dá)98。/。以上的(Exendin-4)2-HSA(圖示3)。實(shí)施例7:小鼠耐糖試驗(yàn)C57BL/6小鼠，雌雄各半，禁食18h,腹腔注射Exendin-4(10pg/kg)或(Exendin-4)2-HSA、Exendin-4-HSA(lmg/kg)。lh后腹腔注射葡萄糖(1.5mg/kg)，注射葡萄糖后分別于IO、20、30、60、120min尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)定血樣中葡萄糖含量，觀察上述待試品對(duì)小鼠血糖的影響。結(jié)果表明給藥能有效地降低空腹血糖峰濃度，同時(shí)使血糖濃度曲線趨于平穩(wěn)(圖示4)。實(shí)施例8:血漿胰島素測(cè)定取小鼠8只，通過(guò)腹腔注射(Exending-4)2-HSA1.0mg/kg或Exendin-410pg/mL(IP)，20分鐘時(shí)眼眶取血，采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA,—抗Anti-insulinantibodyD6C4;酉己對(duì)二抗Anti-insulinbiotinlatedantibodyD3E7，由ABCAntibody.com供應(yīng))對(duì)小鼠血清中的胰島素進(jìn)行檢測(cè)，觀察(Exending-4)2-HSA是否能有效地促進(jìn)胰島素分泌。結(jié)果顯示(Exending-4)2-HSA使用組的胰島素水平比對(duì)照組HSA高3.6倍(圖示5)。實(shí)施例9:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的長(zhǎng)效活性觀察給小鼠腹腔注射(Exendin-4)2-HSA(1.0mg/kg)，于1、24、48、72、96小時(shí)注射葡萄糖(IP)，注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)取血樣，用血糖儀測(cè)定血樣中葡萄糖含量，觀察(Exendin-4)2-HSA在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠血糖的影響。與陰性對(duì)照HSA相比，(EXendin-4)2-HSA明顯降低血糖峰值，血糖濃度波動(dòng)較小，顯示明顯降低血糖作用，并具有長(zhǎng)效特性(圖示6)。實(shí)施例10:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白在糖尿病模型鼠上藥效的觀察糖尿病模型鼠BSKdb/db，其特征為高血糖(19-32mmol/L，血糖為正常鼠的2-3倍)，肥胖(40-56克/只，體重為正常鼠的2-3倍)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠腹腔注射(Exendin隱4)2國(guó)HSA(1.0mg/kg)，每?jī)商煲淮危?2天，觀察給藥后30min、60min、2h、24h、48h小時(shí)血糖值；1、3、5、7、9、11天飲水，飲食，體重變化。與陰性對(duì)照藥HSA相比，(Exendin-4)2-HSA明顯降低糖尿病模型鼠BSKdb/db血糖峰值，具有顯示降低血糖濃度的作用，并具有長(zhǎng)效特性，結(jié)果見(jiàn)圖示7A;明顯減少糖尿病模型鼠BSKdb/db的攝食，飲水量及體重，結(jié)果見(jiàn)圖示7B,C，D。實(shí)施例11:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)給小鼠注射(Exendin-4)2畫(huà)HSA(1.0mg/kg，IP)，于0、0.133、3、6、24、48、72、96h時(shí)間點(diǎn)取血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中的(Exendin-4)2-HSA濃度，并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。顯示半衰期為33小時(shí)，具有長(zhǎng)效特性，結(jié)果見(jiàn)圖示8，而文獻(xiàn)報(bào)道皮下注射Exendin-4的半衰期為2-4小時(shí)。序列表<210>SEQIDNO:1<211>39<212>PRT<213>Exendin-4氨基酸序列<400>1HisGlyGluGlyThrPheThrSerA印LeuSerLysGinMetGlu51015GluGluAlaValArgLeuPhelieGluTrpLeuLysAsnGlyGly202530ProSerSerGlyAlaProProProSer3539<210>SEQIDNO:2<211>585<212>PRT<213>HSA氨基酸序列<400>2AspAlaHisLysSerGluValAlaHisArgPheLysAspLeuGly51015GluGluAsnPheLysAlaLeuValLeulieAlaPheAlaGinTyr202530LeuGinGinCysProPheGluAspHisValLysLeuValAsnGlu354045ValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAspGluSerAlaGlu505560AsnCysAspLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAspLysLeuCys657075ThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMetAlaAspCys808590CysAlaLysGinGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGinHis95100105LysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuValArgProGluVal110115120AspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGluThrPheLeu125130135LysLysTyrAlaProGluThrGluCysLysLeuAspGinArgLeuPheLysAlaAlaGluPheValHisThrAspArgAlalieSerSerLysSerHisAspLeuProCysLysAsnLeuTyrGluLeuLeuArgCysAlaAlaGluPheLysAsnCysGluLeuTyrGlulieAlaLeuCysGluLysTrpAlaGluAspLysCysSerTyrTyrLeuAlaProLeuTyr140Leu155Gin170Leu185Cys200Ala215Glu230Cys245Leu260Leu275lie290Leu305Ala320Ala335Ala350Asp365Leu380Phe395PheAlaArgAlaValValCysAlaLysAlaAlaGluArgLysProValLysliePheAlaAspSerAlaSerHisLysGluGluAlaAlaArgThrHisGluGinAlaAspGluLeuLysGlyTyrCysValAspLysArgLysLysGlyGinLeuSerGinLeuAsplieCysGluPheAspHisProTyrGluGluLeuGluCysProGlyArg145Arg160Ala175Lys190Lys205Ser220Val235Leu250Cys265Glu280Asn295Val310Val325Asp340Thr355Tyr370Gin385Glu400HisProTyrPheAlaTyrAlaAlaSerSerPheGlyGluThrLeuGluLysAspGluPheTyrThrAlaAsnTyrLysCysSerGlyArgAspGluAsnProGluSerLeuSerLeuLysLeuLysAlaLeuLeuPheLeuCysGinLeuMetLysGlyValGluValliePheAlaArgProThrAlaAspLeuProAspMetValLysPheLysGinTyr150Phe165Pro180Lys195Ala210Lys225Lys240Asp255Ser270Glu285Ala300Val315Phe330Leu345Cys360Asp375Gin390Asn405AlaLeuLeuValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThr410415420ProThrLeuValGluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySer425430435LysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMetProCysAlaGlu440445450AspTyrLeuSerValValLeuAsnGinLeuCysValLeuHisGlu455460465LysThrProValSerAspArgValThrLysCysCysThrGluSer470475480LeuValAsnArgArgProCysPheSerAlaLeuGluValAspGlu485490495ThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPheHis500505510AlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGluArgGinlieLysLys515520525GinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThr530535540LysGluGinUuLysAlaValMetAspAspPheAlaAlaPheVal545550555GluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAlaGlu560565570GluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGlyLeu575580585<210>SEQIDNO:3<211>2067<212>DNA<213>(EXendin-4)2-HSA融合蛋白基因核苷酸序列<400>3Atgaagtgggtaacctttatttcccttxtttttctctttagctcggcttattccaggggt60gtgUtcgtcgacacggtgsaggtactttcacttctgatttgtctaagcaaatggaagaa120g犯gCtgtt8gattgttcattgaatggttg鄉(xiāng)aacggtggtccatcttctggtgctcca180ccaccatctc3cggtgaaggtactttcacttctgatttgtctaagc犯atgg3卿ag犯240gctgttagattgttcattga已tggttgaagaacggtggtccatcttctggtgctccacca300ccatctgatgcacscaagagtgaggttgctcatcgatttaa卿tttgggagaag已a(bǔ)aat360ttcaaagcctactcttcgtg犯tg犯tgctg已ggttg3tgttatstgaaaaaaaggtatattgcca犯gca3gtgtgcc已ctgagccagaaLCcaa3gtccgaccttgccatgtgaa^a^ccctgctgacttatgctg鄉(xiāng)cctgattactaagtgctgtgcctcttgtgggg卿gtacatcaactccaacagttatgtggaatccttggcccaaagagt犯gg卿gELCtgc已鄉(xiāng)ctgagtcaagctgtggtgttgattagtg犯tgagtgacaaMc^eicctatggtcttgcaac3tgatgtgc已cttgccag已a(bǔ)gaagctgcttttcgatgaactgtctccaaaagatttcccaaac已cggaatg3gt3t已tctgctctgttggatgccttcattcaaaggatgtctgtcgtgctccgctgcagaaagagcctc3aattccaga^ctcttgtagatgttgcatgatg獄aggcgttaatgctga3gcs￡ictga3ccttaggctttgcctttgctagtaactgaaacttcatacctgaaatggctc幼agatgactgcttttcatacatccttacta^gaatgttcgggatg3已3tttgga_g3￡L已gctgagtttctgccatggatgaaaatcaaaaaatcccacagctgctg已tcttcctgggcgctgctgagatcctcatgaagaatttaatctgcgctattaggtctcaagaaatgccctgtgaaaacgccaaccatgctttaacattcaccacaaactgcaagctgttatggacctgctttat已已tgacagtatcttctttgcaaaaactttttggaggactgctgtgaacccaaaccg3c已stgaagttttatgccctgccaagctggggaaggcttagagctttcagc已g犯gtttg已tctgcttggattcgatct.tgcattgccgtttgttgaaaatgtttttgtcttgccaagatgctatgccaaaacaaaattgttcgttaca33CCt8gg^gcag犯gax;tgtaagtg已catcagctctggttccatgcagcttgttgagcgatgatttcggccgaggaggagcagtgtcccatgtgttgc已caaattatgtcccccgatt3g3CatttttcggaactcctCtg3t8犯gCcgtctgccaa卿catgggcccaagttagtaatgtgctgaccagtaaact已8gtgg3犯agt已a(bǔ)ggatgtatgaatatgcaagtgttcgagtgagcttttccaags犯gt鄉(xiāng)tgggC3gatctatccgtg3gtc3ccaaaagtcgstgatcgtg犯acacagcttttgtgta_aaa<a_acttgatgagtcacacagttgcaggtgBg3CC已tttctttgcttgcctgcctgacagagactcagtagctxgcgacagatctttgacagggcgg卿g犯tgctgatg卿tgttgcaaaaacaag犯ggcatcactctagagtg已gcagcttaccccaagtgcaaatgttgtggtcctgaacatgctgcacaaacat已cgttactttctgagcaagcccaagag卿agtgctgttgctgca420■5406006607207808409009601020108011401200126013201380144015001560162016801740180018601920198020402067<210>SEQIDNO:4<211>663<212>PRT<213>(Exendin-4)2-HSA融合蛋白氨基酸序列<400>4HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGinMetGlu51015<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>GluArgAlaPhePheProLysAlaLeuThrLysValCysAlaAspAspGinAspSerlieLeuLeuGluLysMetProAlaAspLysAspValCysGlyMetPheLeuValValLeuLeuGluLysCysCysValPheAspGlulieLysGinAsnPheGinAsnAlaValSerThrProValGlySerLysCysAlaGluAspLeuHisGluLysLys290Glu305His320Arg335Ser350Ser365Leu380Lys395Tyr410Leu425Ala440Phe455Cys470Leu485Thr500Cys515Tyr530Thr545AlaPheThrAlaSerHisProAsnGluArgAlaLysGluLeuLeuCysLeuProTrpAlaAlaGluGluCysAspLeuLysLeuCyslieSerLeuTyrAlaTyrAlaLeuAlaAlaAspProLeuLeuPheValArgValGluLysHisSerValValSerValValCysAlaLysAlaAlaGluArgLysProValGluTyrValProValAspAla295Ser310His325Lys340Glu355Glu370Ala385Ala400Arg415Thr430His445Glu460Gin475Thr490Ser505Glu520Leu535Arg550ArgLeuSerLysLeuValGlyAspLeuTyrlieCysCysCysGluValGluAsnAspPheValLysAspValHisProAspTyrGluThrGluCysTyrGluProGinLeuGlyGluLysLysValArgAsnLeuAlaLysArgAsnGinLeuValThrLysGinArg300ThrAsp315LeuGlu330GluAsn345LysPro360AspGlu375GluSer390PheLeu405TyrSer420ThrLeu435AlaLys450AsnLeu465TyrLys■ProGin495GlyLys510MetPro525CysVal540CysCys555ThrGluValAspThrPhelieLysLysAlaAlaPhePheAlaLeuGlySerLeuVal560GluThrTyr575HisAlaAsp590LysGinThr605ThrLysGlu620ValGluLys635GluGluGly650Leu663AsnVallieAlaGinCysLysArgProCysLeuLeuCysLysArgProLysGluThrLeuValGluLysAlaLysAlaLeuValCysPhe565PheAsn580SerGlu595LeuVal610ValMet625AspAsp640AlaAla655SerAlaAlaGluLysGluLysHisAspAspLysGluSerGinLeuGlu570ThrPhe585ArgGin600LysPro615PheAla630ThrCys645AlaAla660權(quán)利要求1.一種促胰島素分泌肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是含有2個(gè)多肽區(qū)，其1區(qū)由多個(gè)促胰島素分泌肽Exendin-4重復(fù)序列組成，其2區(qū)是人血清白蛋白HSA，1區(qū)通過(guò)其C-末端與第2區(qū)的N-末端直接連接，或1區(qū)通過(guò)其N(xiāo)末端與2區(qū)的C-末端直接連接，中間不加入任何連接肽，其結(jié)構(gòu)式是(Exendin-4)n-HSA，n為Exendin-4重復(fù)序列組成的重復(fù)次數(shù)，n為2-8。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，其Exendin-4多肽氨基酸序列與序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(Exendin-化-HSA融合蛋白，其特征是其1區(qū)的優(yōu)選結(jié)構(gòu)為(Exendin-4)2，得到(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，該結(jié)構(gòu)可以增強(qiáng)融合蛋白的生物活性。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(Exendin-4VHSA融合蛋白，其特征是Exendin-4重復(fù)序列各個(gè)序列之間的連結(jié)方式為上一個(gè)Exendin-4的C末端與下一個(gè)Exendin-4的N末端直接連接，中間不加入任何連接肽。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(Exendin-化-HSA融合蛋白，其特征是2區(qū)多肽選自人血清白蛋白HSA，其氨基酸序列與序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其特征是基因核苷酸序列為SEQIDNO:3。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其特征是氨基酸序列為SEQIDNO:4。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其特征是其重組核苷酸序列插入在一種表達(dá)載體和細(xì)胞宿主系統(tǒng)。9.一種權(quán)利要求1-3所述的(Exendin-化-HSA融合蛋白的制備方法，其特征是包括轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白分離和純化，以及鑒定步驟。10.—種利用權(quán)利要求1-3所述(Exendin-化-HSA融合蛋白的應(yīng)用，其特征是使哺乳動(dòng)物血糖水平正?；糜谥苽浞且葝u素依賴(lài)性糖尿病及肥胖者的治療制劑。全文摘要一種促胰島素分泌肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法，屬于長(zhǎng)效重組融合蛋白藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明涉及促胰島素分泌肽(Exendin-4)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其含有2個(gè)多肽區(qū)，其1區(qū)由多個(gè)促胰島素分泌肽Exendin-4重復(fù)序列組成，其2區(qū)是人血清白蛋白HSA，1區(qū)通過(guò)其C-末端與第2區(qū)的N-末端直接連接，或1區(qū)通過(guò)其N(xiāo)末端與2區(qū)的C-末端直接連接，中間不加入任何連接肽，其結(jié)構(gòu)式是(Exendin-4)_n-HSA，n為Exendin-4重復(fù)序列組成的重復(fù)次數(shù)，n為2-8。所述(Exendin-4)_n-HSA融合蛋白的應(yīng)用，使哺乳動(dòng)物血糖水平正常化，用于制備非胰島素依賴(lài)性糖尿病及肥胖者的治療制劑，具有比Exendin-4化合物更好的穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期。文檔編號(hào)C12N15/62GK101240033SQ200810018639公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年3月4日優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日發(fā)明者余傳信,楊健良,王斯靖,琪高申請(qǐng)人:無(wú)錫和邦生物科技有限公司;江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所