專利名稱：人生長(zhǎng)抑素十四肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其編碼基因和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于長(zhǎng)效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人生長(zhǎng)抑素十四肽與人血清白蛋白的融合蛋白。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)抑素(somatostatin, SST)是一種環(huán)狀的多肽類激素，是Brazeau 等在1973年從羊下丘腦分離提純的一種生長(zhǎng)激素釋放抑制因子(somatotropin release-inhibiting factor, SRIF)，主要有 14 肽(SST-14)和沘 Jft(SST28)兩種天然形式。SST通過與靶細(xì)胞膜上的特異性受體(Somatostatin receptors, SSTRs)結(jié)合而發(fā)揮多種生物活性。SSTRs共有5個(gè)分子亞型，SSTRl 5，其中SSTR2又存在SSTR2A和SSTR2B 兩種變異體，它們都以類似的親和力與天然SST-14和SSD8結(jié)合。SST除能抑制生長(zhǎng)激素外，幾乎對(duì)機(jī)體所有的生理性內(nèi)外分泌反應(yīng)均有抑制作用，而且能廣泛抑制細(xì)胞的增殖活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SST及其類似物具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性，它們不僅能抑制內(nèi)分泌腫瘤的增殖，而且對(duì)許多其他實(shí)體腫瘤，如乳腺癌、大腸癌、肝癌、肺癌等也具有抑制作用。SST-14是首先發(fā)現(xiàn)于下丘腦中的活性物質(zhì)，結(jié)構(gòu)為一環(huán)狀14肽，第3位和14位的半胱氨酸之間以二硫鍵相結(jié)合，通常所說的SST是指SST-14。SST-14的作用時(shí)間短暫， 血漿半衰期僅為3分鐘，停藥后易出現(xiàn)激素水平的反跳高分泌現(xiàn)象，因而缺乏臨床藥用價(jià)值。雖然人們?cè)O(shè)計(jì)了一系列具有較好的，機(jī)體可耐受的SST類似物，如奧曲肽、伐普肽、蘭瑞肽等，使其血漿半衰期延長(zhǎng)至120分鐘，但這些類似物僅與部分受體有高親和力，在生理功能的發(fā)揮上遠(yuǎn)不如天然SST。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)作為人體血漿的主要成分，具有無酶活性和免疫原性、分子量大、半衰期長(zhǎng)(大約23天)等優(yōu)點(diǎn)，并且是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體。采用以HSA為載體的融合蛋白技術(shù)，將藥物蛋白與HSA分子融合表達(dá)，一方面增加了藥物蛋白的分子量，降低了腎臟的排泄速率；另一方面，融合的蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，減低血液中蛋白水解酶對(duì)藥物蛋白的水解作用，從而有效地延長(zhǎng)了藥物蛋白分子在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的滁留時(shí)間。通過改變藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性，使得藥物的血漿濃度更加穩(wěn)定，藥物在體內(nèi)維持的時(shí)間更長(zhǎng)，從而達(dá)到提高藥物療效的效果?；虼?lián)技術(shù)是將數(shù)個(gè)目的基因首尾相連隨機(jī)串聯(lián)起來，常常用在需要獲取足夠的DNA片段或基因的表達(dá)產(chǎn)物的情況下，由于SST在人體內(nèi)是通過受體與配體相互結(jié)合的方式產(chǎn)生生理作用，增加藥物分子中配體的數(shù)目，理論上無疑會(huì)使藥物與配體結(jié)合的機(jī)會(huì)增加，活性增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述缺陷，提供了一種人生長(zhǎng)抑素十四肽與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二區(qū)；所述與人生長(zhǎng)抑素十四肽同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85%序列同源的第一區(qū)位于融合蛋白的 C末端，中間不加任何連接肽。所述的人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85%序列同源的第一區(qū)為串聯(lián)體形式。所述的人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85%序列同源的第一區(qū)為單體、二聯(lián)體或三聯(lián)體。所述融合蛋白的第二區(qū)由人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域組成或經(jīng)人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域重排后的人血清白蛋白組成。所述融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)
a)由序列表中序列2或4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；
b)將序列表中序列2或4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了由人生長(zhǎng)抑素十四肽和人血清白蛋白組成的融合蛋白的編碼基因。所述的編碼基因，是如下1)或2)的基因
1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；
2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述的由人生長(zhǎng)抑素十四肽和人血清白蛋白組成的融合蛋白的方法，是將含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，表達(dá)得到融合蛋白；所述宿主為酵母菌，優(yōu)選為畢赤酵母GS115 ；所述用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為PPIC9K。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的由人生長(zhǎng)抑素十四肽和人血清白蛋白組成的融合蛋白中間不加任何連接肽，避免了因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩(wěn)定性(避免針對(duì)連接肽的蛋白酶降解)和免疫原性等方面的問題；并且其在提高和/或維持天然人生長(zhǎng)抑素十四肽的生物活性的基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)了天然人生長(zhǎng)抑素十四肽分子在血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的滁留時(shí)間，改變了其藥代動(dòng)力學(xué)特性，從而使該融合蛋白具有臨床藥用價(jià)值；此種融合蛋白可應(yīng)用于治療因生長(zhǎng)激素分泌過剩所引起的各種疾病，用于治療胃腸道內(nèi)分泌紊亂引起的疾病，用于抑制表達(dá)SSTRs和不表達(dá)SSTRs腫瘤的生長(zhǎng)，用于降低胃腸道輻射損傷導(dǎo)致的死亡率。


圖1為本發(fā)明融合蛋白中人生長(zhǎng)抑素與人血清白蛋白關(guān)聯(lián)示意圖。圖 2 為質(zhì)粒 PPIC9K- (SST-14) 3-HSA/pPIC9K_HSA- (SST-14) 3 結(jié)構(gòu)圖。圖3為(SST-H)3的重疊PCR產(chǎn)物。圖4為HSA的PCR產(chǎn)物。圖 5 為融合蛋白(SST-H)3-HSA 和 HSA-(SST-14) 3 的 SDS-PAGE 分析。
其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1:重組菌GS115/pPIC9K-(SST_14)3-HSA表達(dá)產(chǎn)物；Lane 2:重組菌 GS115/pPIC9K-HSA-(SST_14)3 表達(dá)產(chǎn)物。圖 6 為融合蛋白(SST-H)3-HSA 和 HSA-(SST-H)3 的 Western blot 鑒定。其中，Lane1:融合蛋白(SST-14)3"HSA ；Lane 2:融合蛋白 HSA_(SST_14)3 圖7為融合蛋白(SST-H)3-HSA和(SST-H)3-HSA的分離純化。其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1:緩沖液B洗脫的融合蛋白(SST-14)3_HSA 的透析產(chǎn)物；Lane 2: 50%乙二醇洗脫的融合蛋白(SST-14)3_HSA的透析產(chǎn)物；Lane 3:緩沖液B洗脫的融合蛋白HSA-(SST-H)3的透析產(chǎn)物；Lane 2: 50%乙二醇洗脫的融合蛋白 HSA-(SST-H)3的透析產(chǎn)物。緩沖液B的洗脫液中含高濃度融合蛋白，純度在95%以上，冷凍干燥后作為后續(xù)藥效學(xué)研究的樣品。50%乙二醇的洗脫液中大部分為融合蛋白的降解產(chǎn)物，表明該親和柱有較好的分離效果。圖8為融合蛋白(SST-H)3-HSA和(SST-14)3_HSA在小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法和所用的試劑，如無特別說明，均為常規(guī)方法和常規(guī)試劑。質(zhì)粒抽提試劑盒，DNA膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。pMD19-T Simple Vector, TaKaRa Taq , T4 DNA 連接酶，各種限制性內(nèi)切酶以及 E.coli Competent Cell JM109 均購(gòu)自 TaKaRa 公司。畢赤酵母宿主菌GSl 15及分泌型表達(dá)載體PPIC9K購(gòu)自hvitrogen公司。引物合成及DNA測(cè)序服務(wù)均由上海生工生物工程有限公司提供。胰蛋白胨和酵母提取物為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品，無氨基酸的酵母氮基為美國(guó)BD公司Difco培養(yǎng)基。PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio-fcid公司。兔抗人SST多抗(ab53165)和兔抗人HSA多抗(ab83465)為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色購(gòu)自天根生化科技有限公司。Blue Sepharose 1 gPharmacia ^wJ0小鼠生長(zhǎng)激素(GH)定量檢測(cè)試劑盒為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的主要試劑 1.引物
PSl :5，- TGAGAATTCAAAAGAgctggctgcaagaatttcttctggaagacTTC - 3，；
PS2 :5’ - TAAATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCacaggatgtgaaag - 3’ ；
PS3 5' - GATCCTTAGGCTTAGCTGGCTGCAAGAAT - 3'；
PS4 5' - TTAGCGGCCGCTTATTAACAGGATGTGAAA - 3'；
PHl 5' - AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC - 3'；
PH2 5' - GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT - 3'；
PH3 5' -GCCGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGAT- 3'；PH4 :5’ - CATAAGGCGGCCGCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTG - 3’ ；
2.SST-14三聯(lián)體基因 (SS-H)3-寡核苷酸序列1 :
5’ -GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGTGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGA CTTTCACATCCTGTGCTGGCTGC- 3'；
(SS-14) 3"寡核苷酸序列 2:5，-ACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTGCAGCCAGCACAGG ATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTGCAGCCAGCACAGGATGT - 3'；
3.培養(yǎng)基配方
BMGY培養(yǎng)基 胰蛋白胨，1%酵母提取物，100 mmol/L磷酸鉀(pH 6. 0)，1. 34%無氨基酸的酵母氮基(YNB)，410_、生物素，21甘油。BMMY培養(yǎng)基 胰蛋白胨，1%酵母提取物，100 mmol/L磷酸鉀(pH 6. 0)，1. 34%無氨基酸的酵母氮基(￥他)，410_、生物素，2%甲醇。4、序列說明融合蛋白(SSTH)3-HSA和HSA-(SSTH)3的氨基酸和基因序列。通過定點(diǎn)突變?cè)贖SA的N端引入ClaI酶切位點(diǎn)，用于構(gòu)建(SSTH)3-HSA融合基因；HSA的C端存在SauI酶切位點(diǎn)，用于構(gòu)建HSA-(SSTH)3融合基因；采用EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，插入表達(dá)載體PPIC9K的閱讀框。實(shí)施例
1. SST-14三聯(lián)體基因的克隆 a. (SST-H)3寡核苷酸退火
人工合成二條互補(bǔ)的(SST-H)3寡核苷酸(參見(SS-H)3-寡核苷酸序列1和 (SS-H)3-寡核苷酸序列2)。100M濃度的寡核苷酸序列1和2各取101至701 ddH20中， 同時(shí)加入101 10退火緩沖液，制備IOM (SSH)3-寡核苷酸混合溶液。95C高溫加熱寡核苷酸混合溶液2分鐘后，讓寡核苷酸混合溶液自然冷卻至室溫(25C-30C)。b. (SST-H)3 延伸
30 1退火的寡核苷酸模板，10 110 Klenow緩沖液，101 25 mM dNTPs，混合，37C孵化30分鐘。增加4 1100 mM EDTA終止反應(yīng)。c. (SST-14) 3 PCR 擴(kuò)增
反應(yīng)體系為:10μ mol/L 的 PSl 和 PS2 引物各 0. 51，IOmmol/L 的 dNTP 0. 51，IOpfu 緩沖液 2. 5yl，5U/l 的 pfu DNA 聚合酶 0. 51，(SST-H)3 延伸產(chǎn)物 0. 51 (含 Ing DNA)，加 dd H2O 補(bǔ)齊 251。PCR反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸秒， 循環(huán)25次；72 °C延伸2分鐘。2%瓊脂糖凝膠分析重疊PCR反應(yīng)產(chǎn)物，切割下目的條帶(S卩150bp條帶)，PCR膠回收試劑盒回收，并與PMD19-T Simple vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過菌落鑒定陽性克隆，DNA測(cè)序驗(yàn)證SST-14三聯(lián)體基因序列正確，獲得的陽性重組子命名為 JM109/pMD19T-(SST-14)3。2. HSA基因的克隆
利用PCR從人胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出HSA cDNA。PCR 反應(yīng)體系10 μ mol/L 的 PHl 和 PH2 引物各 1. 5μ 1,2. 5mmol/L 的 dNTP 4μ 1，IOpfU緩沖液5μ1，5υ/μ1的pfu DNA聚合酶0. 5 μ 1，人胎肝cDNA文庫(kù)lng，加ddH20補(bǔ)齊 50 μ 1。PCR反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性1分鐘，60°C退火1分鐘，72°C延伸1 分30秒，循環(huán)25次；72°C延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物，回收并純化1. Skb的目的片斷。對(duì)回收的目的片斷和pBluISP載體進(jìn)行Ml I和Hind III雙酶切，并經(jīng)T4 DNA連接酶將雙酶切的PCR目的片段和雙酶切的pBlMKSP載體相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，通過含有X-gal、IPTG和100 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板的培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增、核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的有無、及DNA序列測(cè)定等方法鑒定陽性克隆。陽性重組子命名為JM109/pBluISP-HSA。3. (SST-H)3和HSA融合基因的克隆
a. (SST-14) 3-1, (SST-14)3-2 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增
以pMD19T-(SST-14)3為模板，以PSl和PS2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為 (SST-14) 3-1，用于構(gòu)建融合蛋白(SST-14) 3-HSA。以pMD19T-(SST-14)3為模板，以PS3和PS4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物為(SST-14)3-2，用于構(gòu)建融合蛋白HSA-(SST-14)3。PCR 反應(yīng)體系為10ymol/L 的引物 PSl 和 PS2(或 PS3 和 PS4)各 1. 5μ 1,2. 5mmol/ L 的 dNTP 4 μ 1，IOPCR 緩沖液 5 μ 1，5U/ μ 1 的 TaKaRa Taq 0. 25 μ 1，質(zhì)粒 DNA 0. 5 μ 1 (含 lng DNA)，力口 ddH20 補(bǔ)齊 50μ1。PCR反應(yīng)程序95°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30 秒，循環(huán)25次；72°C延伸3分鐘。b. HSA基因的PCR擴(kuò)增
以pBluISP-HSA為模板，以PH3和PH4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為10ymol/L的引物 PH3 和 PH4 各 1. 5μ 1，2. 5讓ol/L 的 dNTP 4μ 1, 10PCR 緩沖液 5 μ 1，5U/ μ 1 的 TaKaRa Taq 0. 25 μ 1，質(zhì)粒 DNA 0. 5 μ 1 (含 lng DNA)，加 ddH20 補(bǔ)齊 50 μ I0PCR反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性1分鐘，60°C退火1分鐘，72°C延伸1 分30秒，循環(huán)25次；72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物與pMD19_T載體相連接，陽性重組子命名為 JM109/pMD19T-HSA。c. (SST-H)3和HSA融合蛋白表達(dá)基因的構(gòu)建
PCR 產(chǎn)物(SST-H)3-I 經(jīng) EcoRI-ClaI 雙酶切，PCR 產(chǎn)物(SST_14)3_2 經(jīng) SauI-NotI 雙酶切，并分別與經(jīng)同樣酶切的PMD19T-HSA載體連接，PCR擴(kuò)增反應(yīng)鑒定陽性克隆菌落，陽性重組子命名為 JM109/pMD19T-(SST-H)3-HSA 和 JM109/pMD19T_HSA-(SST-14) 3。4. (SST-H)3-HSA和HSA-(SST-H)3酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá) a.融合蛋白(SST-H)3-HSA和HSA-(SST-H)3酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
(a-1). pMD19T- (SST-14) 3_HSA、pMD19T_HSA_ (SST-14) 3 及酵母表達(dá)載體 pPIC9K，分別經(jīng)EcoRI-NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收酶切(SST-14)3-HSA、HSA-(SST-H)3 以及載體PPIC9K酶切DNA片段，經(jīng)1\ DNA連接酶將載體pPIC9K分別與(SST-14) 3_HSA 和HSA-(SST-H)3相連接，PCR擴(kuò)增反應(yīng)鑒定陽性克隆菌落。陽性重組子命名為JM109/ pPIC9K- (SST-14) 3-HSA 和 JM109/pPIC9K_HSA- (SST-14) 3。
(a-2). pPIC9K-(SST-H)3-HSA 和 pPIC9K_HSA_ (SST-14) 3，經(jīng) Sail 單酶切后， DNA膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。單酶切回收產(chǎn)物通過電擊方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，轉(zhuǎn)化物涂布于含有l(wèi)mol/L山梨醇的MD平板上，于30°C培養(yǎng)4天。陽性克隆命名為GS115/ pPIC9K- (SST-14) 3-HSA 和 GSl 15/pPIC9K_HSA_ (SST-14) 3。b.融合蛋白(SST-14) 3-HSA 和 HSA- (SST-14) 3 的酵母表達(dá)
接種融合蛋白(SST-H)3-HSA和融合蛋白HSA-(SST-H)3陽性單菌落于裝有IOml BMGY 培養(yǎng)基的三角瓶中，200rpm, 30°C培養(yǎng)約24h至OD6tltl為18，靜置池使菌體自然沉降，傾去上清，重懸菌體于:3ml BMMY培養(yǎng)基中，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72h，每對(duì)h補(bǔ)加一次甲醇至終濃度為 2%，離心收集上清，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況，篩選表達(dá)產(chǎn)量最高的重組菌作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。 c.融合蛋白(SST-14) 3-HSA 和 HSA- (SST-14) 3 的鑒定
挑選生產(chǎn)融合蛋白(SST-H)3-HSA和HSA-(SST-H)3最高的重組菌株，其發(fā)酵上清經(jīng) SDS-PAGE電泳后，利用兔抗人SST多抗和兔抗人HSA多抗，經(jīng)flfestern blot鑒定融合蛋白 (SST-14) 3-HSA 和 HSA- (SST-14) 3 的表達(dá)。5. (SST-H)3-HSA 和 HSA-(SST-H)3 融合蛋白的樣品制備 a.融合蛋白在5升(5L)發(fā)酵罐上的表達(dá)
陽性 GSl 15/pPIC9K- (SST-14) 3_HSA 或 GSl 15/pPIC9K_HSA_ (SST-14) 3 克隆菌，接種至裝有50ml BMGY培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，200rpm，30°C培養(yǎng)Mh，制備得到一級(jí)種子。以m 接種量將一級(jí)種子接入裝有150ml BMGY培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，200rpm，30°C培養(yǎng)Mh， 制備得到二級(jí)種子。按5%接種量把二級(jí)種子接入裝有2. 51 BMGY培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中， 設(shè)定發(fā)酵初始條件為溫度30°C，轉(zhuǎn)速500rpm，通氣量2VVM，pH6. 0。發(fā)酵開始24h左右，初始培養(yǎng)基中的碳源(甘油)消耗完畢，溶氧開始反彈，此時(shí)開始流加補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基(5%胰蛋白胨，10%酵母提取物，10%甘油，6. 7% YNB，210_4%生物素)，流速為4ml/min，補(bǔ)料500ml。補(bǔ)料完成后，一次性補(bǔ)加0. 2%甲醇，使其適應(yīng)新碳源。待溶氧再次上升超過40%時(shí)，開啟甲醇脈沖式流加，一次性補(bǔ)加0. 5%甲醇，周期性執(zhí)行，每當(dāng)溶氧上升超過40%時(shí)，一次性補(bǔ)加0. 5% 甲醇，誘導(dǎo)42h。SDS-PAGE電泳檢測(cè)不同時(shí)段融合蛋白的表達(dá)情況。b.融合蛋白發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化
發(fā)酵液下罐后，4 C, 8, 000 r/min離心lOmin，取上清，過0. 45 μπι膜。采用Cogent Ml中試規(guī)模半自動(dòng)超濾裝置，截留分子量為10 kDa，進(jìn)行超濾。原始發(fā)酵液上清3L超濾至 300ml，加入300ml蒸餾水重新超濾至300ml，如此重復(fù)3遍，使電導(dǎo)降至10 ms/cm以下。Blue Sepharose F. F.樹脂 50 ml 裝柱(25/20)，以緩沖液 Α(ρΗ7· 2，0. 02 mol/L 磷酸緩沖液，0.15 mol/L NaCl)平衡，流速10 ml/min。上述樣品解凍后調(diào)pH為7. 2，15，000 r/min離心10 min,以5 ml/min的流速上樣，上樣量為300 ml。上樣結(jié)束后調(diào)節(jié)流速為10 ml/min，繼續(xù)以緩沖液A洗脫至基線水平。以緩沖液B (pH7. 2，0. 02 mol/L磷酸緩沖液， 2 mol/L NaCl)洗脫吸附在親和柱上的蛋白樣品，隨后用50%乙二醇(50%乙二醇，pH7. 2， 0. 02 mol/L磷酸緩沖液，2 mol/L NaCl)洗脫殘余蛋白。收集各洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析。純化樣品在蒸餾水中透析至電導(dǎo)為20 μ s/cm，冷凍干燥后用于后續(xù)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。6.融合蛋白(SST-H)3-HSA和HSA-(SST-H)3在小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究 BALB/c雄性小鼠18只，平均體重約為20g，隨機(jī)分為陽性對(duì)照組，融合蛋白(SST-14) 3-HSA組和HSA- (SST-14) 3組，尾靜脈注射10mg/kg體重融合蛋白，陽性對(duì)照樣品為天然SST-14 ( Cat No. S1763-lmg, Sigma),注射劑量為0. 15mg/kg體重。融合蛋白注射后的0、2、6、M h分鐘別從眼框采血，小鼠血清經(jīng)生長(zhǎng)激素(GH)定量檢測(cè)試劑盒(R&D 公司)檢測(cè)血清中GH的含量。7. SST-14單體融合基因的構(gòu)建
人工合成SST-14單體基因，分別采用EcoRI和ClaI雙酶切構(gòu)建(SST-14) -HSA融合基因，采用SauI和NotI雙酶切構(gòu)建HSA-(SST-H)融合基因，采用EcoRI和Not I雙酶切分別將其插入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K中。其余操作同SST-14三聯(lián)體融合蛋白的制備。8. SST-14 二聯(lián)體融合基因的構(gòu)建
按步驟1所述進(jìn)行SST-14串聯(lián)體的重疊PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，割下 SST-14 二聯(lián)體基因目的條帶(約IOObp條帶)，PCR膠回收試劑盒回收，并與pMD19_T Simple vector連接，測(cè)序驗(yàn)證序列正確。從步驟2開始，其余操作同SST-14三聯(lián)體融合蛋白的制備。
權(quán)利要求
1.一種人生長(zhǎng)抑素十四肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于包括與人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二區(qū)；所述與人生長(zhǎng)抑素十四肽同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85%序列同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85% 序列同源的第一區(qū)為串聯(lián)體形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述的人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85% 序列同源的第一區(qū)為單體、二聯(lián)體或三聯(lián)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第二區(qū)由人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域組成或經(jīng)人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域重排后的人血清白蛋白組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2或4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2或4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5所述的由人生長(zhǎng)抑素十四肽和人血清白蛋白組成的融合蛋白的編碼基因。
7.如權(quán)利要求6所述的編碼基因，其特征在于是如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。
8.含有權(quán)利要求7所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
9.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的由人生長(zhǎng)抑素十四肽和人血清白蛋白組成的融合蛋白的方法，其特征在于將含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，表達(dá)得到融合蛋白；所述宿主為酵母菌；所述用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為PPIC9K。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人生長(zhǎng)抑素十四肽與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85％序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二區(qū)；與人生長(zhǎng)抑素十四肽同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，與人生長(zhǎng)抑素十四肽至少85％序列同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。本發(fā)明的有益效果為延長(zhǎng)了天然人生長(zhǎng)抑素十四肽分子在血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的滁留時(shí)間，可應(yīng)用于治療因生長(zhǎng)激素分泌過剩所引起的各種疾病，用于治療胃腸道內(nèi)分泌紊亂引起的疾病，用于抑制表達(dá)SSTRs和不表達(dá)SSTRs腫瘤的生長(zhǎng)，用于降低胃腸道輻射損傷導(dǎo)致的死亡率。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102391376SQ20111006133
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月15日
發(fā)明者丁月娣, 付強(qiáng), 李文新, 楊潤(rùn)林, 范俊 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所