專利名稱：一種用于兒童哮喘檢測的標志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于兒童哮喘輔助診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用于兒童哮喘檢測的標志物。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘是當前世界威脅公共健康最常見的慢性肺部疾病，哮喘的發(fā)生可影響人類各年齡層，可在嬰幼兒起病，并以兒童多發(fā)。在最近的幾十年，兒童哮喘的患病率呈明顯上升的趨勢，有些國家甚至在短短10年間患病率就上升了 1倍多[1]。我國1990和2000年進行的全國兒童哮喘發(fā)病調(diào)查結(jié)果顯示，10年間兒童哮喘患病率由0.91%上升到1.50%， 患病率上升了 64. 84% [2] 哮喘不僅嚴重危害兒童的健康成長，對其整個一生的生存質(zhì)量產(chǎn)生遠期影響，而且給我國帶來沉重的經(jīng)濟損失和社會負擔，影響社會穩(wěn)定和國民經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。哮喘的病因和發(fā)病機制十分復(fù)雜，是免疫、遺傳和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果。一般認為哮喘在兒童5歲左右有兩個發(fā)病高峰。臨床上大多數(shù)患者是從隱匿發(fā)病開始，逐漸加重的。如果所有的哮喘患者都能在早期得到及時地診斷與治療，其預(yù)后將大為改觀，同時也會節(jié)約大量的醫(yī)療衛(wèi)生資源。兒童因年齡、生理解剖、免疫功能、變應(yīng)原接觸量、環(huán)境情況等因素致喘，致喘因素復(fù)雜，故童哮喘在發(fā)作誘因、頻度、輕重上不同于成人[3]。兒童哮喘診斷主要有以下幾點難點1、兒童哮喘的診斷需除外其他疾病，但要除外的疾病種類相當龐大，需要臨床工作者豐富的工作經(jīng)驗和審慎的工作態(tài)度。2、5歲以下的兒童肺功能測定及支氣管激發(fā)試驗難于開展，加大了兒童哮喘的診斷難度。3、對反復(fù)喘息的認識有一定難度，如對患兒既往喘息次數(shù)的正確掌握應(yīng)該依據(jù)醫(yī)療病歷記載而并非家長主訴，但在我國許多家長特別是來自農(nóng)村的家長對醫(yī)療病歷保管不當經(jīng)常遺失，因此對患兒既往喘息情況不得而知。診斷主要依據(jù)癥狀、體征，缺乏診斷方法和指標的金標準。特應(yīng)性變應(yīng)原檢測、總IgE和特異性IgE的檢測、肺功能的檢測、支氣管舒張試驗和支氣管激發(fā)試驗(后3項檢查尤其適用于5歲以上兒童)對兒童哮喘的診斷具有重要的作用，但并非所有患兒均具有上述指標異常。因此，迫切需要更好的早期檢測兒童哮喘的方法。TRPV2是 TRP(transientreceptor potential)陽離子通道超家族V亞家族的成員[4]，是非選擇性陽離子通道，在體內(nèi)可被傷害性熱刺激(> 52攝氏度)和TRP激動劑激活。TRPV2廣泛分布在所有脊髓、腦和非神經(jīng)細胞[5_8]，在脾、肺、腸組織及淋巴細胞中均有表達[9_1(1]，其表達分布表明TRPV2除了可感傷有害的熱刺激外，還可能具有廣泛的生物學功能。研究表明，TRPV 家族成員可以被刺激性空氣污染物等激活；同時它的激活，可引起感覺神經(jīng)C纖維激活，刺激沿軸索上行傳遞，在它的軸索神經(jīng)反射范圍內(nèi)的其它神經(jīng)原亦會激活，可以使局部組織出現(xiàn)血管擴張、通透性增加、炎性滲出、黏膜水腫、黏液分泌亢進、支氣管收縮，即所謂的“氣道神經(jīng)源性炎癥”，是引起哮喘發(fā)作的重要原因。因此TRPV2作為TRPV家族成員之一，與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于兒童哮喘檢測的標志物。一種用于兒童哮喘檢測的標志物，其特征在于，所述標志物為采用半定量RT-PCR 或?qū)崟r定量PCR的擴增產(chǎn)物，擴增引物為針對TRPV2基因序列(Genbank登錄號匪 016113. 3)的特異性引物，擴增模板為兒童外周血淋巴細胞中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成的 cDNA。所述半定量RT-PCR擴增產(chǎn)物的序列如SEQ ID No. 1所示，長度為578bp，實時定量 PCR擴增產(chǎn)物的序列如SEQ ID No. 2所示，長度為95bp。所述特異性引物包括針對半定量RT-PCR的特異性引物和針對實時定量PCR的特異性引物。所述針對半定量RT-PCR的特異性引物為引物fl具有序列表中SEQ ID No. 3的核苷酸序列，引物rl具有序列表中SEQ ID No. 4的核苷酸序列；針對實時定量PCR的特異性引物為引物f3具有序列表中SEQ ID No.5的核苷酸序列，引物r3具有序列表中SEQ ID No. 6的核苷酸序列。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過標志物檢測哮喘組兒童外周血淋巴細胞中TRPV2 基因表達水平，與檢測總IgE相比，其敏感性更高。本發(fā)明采用半定量RT-PCR和實時定量 PCR的方法能夠精確、快速檢測TRPV2基因的表達水平。


圖1 :TRPV_2在哮喘組(A)與正常組(B)半定量RT-PCR結(jié)果；其中標號33-38代表哮喘組實驗標號，48、58、59、62、63代表正常組實驗標號。圖2 :TRPV-2在哮喘組與正常組實時定量PCR結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1 哮喘患兒及對照的選擇按照兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2008年修訂)的診斷標準，在兒童醫(yī)院呼吸科，由臨床醫(yī)生選擇符合標準的哮喘患兒，年齡彡15歲，共60例患兒。選取與哮喘組兒童年齡、性別、相匹配的健康兒童60例作為對照組。病例的判定依據(jù)兒童年齡選擇不同的判定標準嬰幼兒哮喘診斷標準⑴年齡< 3歲，喘息發(fā)作彡3次；⑵發(fā)作時雙肺聞及呼氣相哮鳴音，呼氣相延長；(3)具有特應(yīng)性體質(zhì)，如過敏性濕疹、過敏性鼻炎等；(4)父母有哮喘病史或其他過敏史；(5)除外其他引起喘息的疾病。凡具有(1)、(2)、(5)條即可診斷哮喘。如喘息發(fā)作2次，并具有第(2)、(5)條，診斷為可疑哮喘或喘息性支氣管炎(< 3歲)。 如同時具有第(3)和/或第(4)條時，可考慮給予哮喘治療性診斷。兒童哮喘的診斷標準(1)年齡彡3歲，喘息呈反復(fù)發(fā)作者(如發(fā)作1次，若可追溯與某種變應(yīng)原或刺激因素有關(guān)，亦可考慮)；(2)發(fā)作時雙肺聞及以呼氣相為主的哮鳴音， 呼氣相延長；(3)支氣管擴張劑有明顯的療效；(4)除外其他引起喘息的疾病。實施例2 血樣的收集及生物指標的檢測
抽取研究對象靜脈血檢測血清中總IgE，該部分檢測工作由醫(yī)院協(xié)助完成。分析方法采用免疫印跡法定量檢測血清中總IgE水平。具體操作方法抽取病人靜脈血1ml，分離血清，取250 μ L與吸附有特異性過敏原的硝酸纖維素膜于反應(yīng)槽內(nèi)室溫孵育45min，洗滌后加入標記了生物素的抗人IgE抗體，室溫孵育45min，洗脫未結(jié)合的二抗，加入結(jié)合有堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，再室溫孵育 20min，洗去未結(jié)合酶，加入底物顯色。所有孵育在混勻器(120次振/min)上完成。顯色深淺與血清中slgE含量成正比，通過C⑶相機照相，將結(jié)果導入軟件系統(tǒng)，并計算出總IgE的分級和濃度數(shù)值(IU/ml)。

實施例3 提取RNA抽取研究對象靜脈血3ml，EDTA抗凝用以提取RNA。RNA的提取方法，具體見蓋寧生物科技有限公司生產(chǎn)的超純總RNA快速提取試劑盒說明書。每份血樣提取RNA后都分別對提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，利用紫外分光光度儀檢測其濃度。計算 3微克所需反轉(zhuǎn)錄用量。實施例4:引物設(shè)計在GeneBank中下載登錄的TRPV2基因的mRNA序列。根據(jù)已報道的TRPV2 基因序列，運用生物信息學分析，選擇針對半定量RT-PCR的靶序列(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示)，設(shè)計并合成針對半定量RT-PCR檢測TRPV2序列的特異性引物，上游引物:fl 5 ‘ -AGGGCGAGGACCGGAAATTC-3 ‘ (SEQ ID No. 3)，下游弓丨物:rl 5 ‘ -GGCGGGCTGGTGTGGGTT-3 ‘ (SEQ IDNo. 4)，上下游引物間的 TRPV2 片段長578bp。將hGAPDH磷酸甘油醛脫氫酶設(shè)為內(nèi)參照物，上下游引物間的hGAPDH片段長 445bp。具體為上游引物f2 :5 ‘ -CATCATCCCTGCCTCTACTG-3 ‘，下游引物r2 5' -GGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3‘。選擇針對實時定量PCR的靶序列(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示)，設(shè)計并合成針對實時定量PCR檢測TRPV2序列的特異性引物，上游引物f3 5' -CTTCCTTTTC GGCTTCGCTGTAG-3‘ (SEQ ID No. 5)下游引物r3 :5‘ -GCACTGACTCTGTGGCATTGG-3‘ (SEQ ID No. 6)。上下游引物間的TRPV2片段長95bp。將hGAPDH磷酸甘油醛脫氫酶設(shè)為內(nèi)參照物,上下游引物間的hGAPDH片段長87bp。上游引物f4 5' -TGCACCACCAACTGCTTAGC-3‘ 下游引物r4 5' -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3‘。對TRPV2基因預(yù)期產(chǎn)物進行BLAST分析。 結(jié)果證實所設(shè)計的目的片段與TRPV2基因的同源率為100%，而與其它因子的同源率均小于 40%。實施例5 半定量RT-PCR檢測TRPV2基因的表達采用半定量RT-PCR方法，操作步驟如下RT-PCR方法以提取的RNA為模板，模板濃度為3 μ g，反應(yīng)體系如下RNA 3 μ gOligo dT primer (50 μ Μ) 1 μ LdNTP (IOmM) 1 μ LddH20 力口至丨J 10 μ L65°C保溫5min后，迅速在冰上冷卻2min。離心數(shù)秒，在管中加下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液5 X AMV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2 μ L
AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(5U) 1uLRNA 酶抑制劑(40U) 1uLddH20 力口至Ij 20 μ L42°C，30min，75°C，15min，4°C，冷卻。取1 μ L反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)，用相應(yīng) TRPV2基因引物(fl和rl)及GAPDH引物(f2和r2)進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(20 μ L)如
下
權(quán)利要求
1.一種用于兒童哮喘檢測的標志物，其特征在于，所述標志物為采用半定量RT-PCR或?qū)崟r定量PCR的擴增產(chǎn)物，擴增引物為針對TRPV2基因序列的特異性引物，擴增模板為兒童外周血淋巴細胞中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。
2.一種用于兒童哮喘檢測的標志物，其特征在于，所述半定量RT-PCR擴增產(chǎn)物的序列如SEQ ID No. 1所示，長度為578bp，實時定量PCR擴增產(chǎn)物的序列如SEQ ID No. 2所示，長度為％bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于兒童哮喘檢測的標志物，其特征在于，所述特異性引物包括針對半定量RT-PCR的特異性引物和針對實時定量PCR的特異性引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種用于兒童哮喘檢測的標志物，其特征在于，所述針對半定量RT-PCR的特異性引物為引物fl具有序列表中SEQ ID No. 3的核苷酸序列，引物rl具有序列表中SEQ ID No. 4的核苷酸序列；針對實時定量PCR的特異性引物為引物f3具有序列表中SEQ ID No. 5的核苷酸序列，引物r3具有序列表中SEQ ID No. 6的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于兒童哮喘輔助診斷領(lǐng)域的一種用于兒童哮喘檢測的標志物。該標志物為采用半定量RT-PCR或?qū)崟r定量PCR的擴增產(chǎn)物，擴增引物為針對TRPV2基因序列的特異性引物，擴增模板為兒童外周血淋巴細胞中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成的cDNA，擴增產(chǎn)物的長度分別為578bp和95bp。采用本發(fā)明標志物檢測哮喘組兒童外周血淋巴細胞中TRPV2基因表達水平，與檢測總IgE相比，其敏感性更高。
文檔編號C12Q1/68GK102154494SQ20111006051
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月14日
發(fā)明者付文亮, 徐東剛, 徐東群, 朱澤軼, 蔡欣, 鄒民吉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所, 中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所