專利名稱：過氧化氫酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼過氧化氫酶的基因及其用途，特別是涉及制造香味優(yōu)異的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說，本發(fā)明涉及通過提高釀造酵母的編碼過氧化氫酶Ctalp的基因CTA1、特別是啤酒酵母中特征性的 nonScCTAl基因或&CTA1基因的表達(dá)量，使對產(chǎn)品香味穩(wěn)定化起作用的亞硫酸鹽的生成能力提高的酵母及使用該酵母的酒精飲料的制造方法等。
背景技術(shù)：
亞硫酸鹽作為抗氧化作用強(qiáng)的化合物而為人所知，在食品、飲料、醫(yī)藥品等領(lǐng)域中作為抗氧化劑被廣泛應(yīng)用(例如日本特開平06-040907號公報(bào)、日本特開2000-093096號公報(bào)等)。在酒精飲料中，亞硫酸鹽也被用作抗氧化劑，例如，對需長時間陳釀的葡萄酒的質(zhì)量保證起重要作用，所以，日本國內(nèi)厚生勞動省許可添加到殘留濃度為350ppm以下。而且，在啤酒釀造產(chǎn)品中，保質(zhì)期的變化依賴于產(chǎn)品中含有的亞硫酸鹽濃度，所以提高此化合物的濃度，在香味穩(wěn)定性等方面非常重要。使產(chǎn)品中亞硫酸鹽含量增大的最簡單的方法是添加亞硫酸鹽，但此時亞硫酸鹽會被作為食品添加劑處理，這會帶來商品開發(fā)受到限制以及消費(fèi)者對食品添加劑存在的負(fù)面印象等方面的問題。使釀造過程中發(fā)酵液中的亞硫酸鹽濃度升高的方法，有1)通過過程控制的方法和2)通過酵母育種的方法。通過過程控制的方法，是指由于釀造中亞硫酸鹽的生成與初期氧的供給量成反比，所以減少向發(fā)酵液中的氧供給量，不僅可增加亞硫酸鹽的生成量，同時可抑制其氧化。通過酵母育種的方法利用了基因操作技術(shù)。酵母可生物合成自身生命活動所需的含硫化合物，亞硫酸鹽則作為生物合成含硫化合物的中間產(chǎn)物而生成。因此，利用酵母的此能力，不由外部添加亞硫酸鹽，即可使產(chǎn)品中亞硫酸鹽的量增加。MET3及MET14是編碼如下還原酶的基因，其為參與從培養(yǎng)基中攝入的硫酸根離子生物合成亞硫酸鹽過程的還原酶。C. Korch等進(jìn)行了以下嘗試，通過使此2個基因的表達(dá)量增加提高酵母的亞硫酸鹽生成能力，并證明 MET14 更為有效(C. Korch et al.，Proc. Eur. Brew. Conv. Conger.， Lisbon，201-208，1991)。另外，J. Hansen等進(jìn)行了以下嘗試，通過破壞編碼亞硫酸鹽還原酶 (sulfite ion reductase)的METlO基因，防止生成的亞硫酸鹽還原，而使亞硫酸鹽生成量增加(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)，但同時也出現(xiàn)了發(fā)酵延遲， 以及不受歡迎的香味成分乙醛及1-丙醇的增加的問題。而且，藤村等進(jìn)行了以下嘗試，通過提高編碼酵母的亞硫酸根離子排出泵的SSUl 基因中啤酒酵母中特有的nonScSSUl基因的表達(dá)量，促進(jìn)菌體內(nèi)生成的亞硫酸鹽向菌體外排出，以增加啤酒中的亞硫酸鹽濃度(藤村等，2003年度日本農(nóng)藝化學(xué)會年次大會要旨集， 159，2003。日語原名；藤村^、2003年度日本農(nóng)蕓化學(xué)會年次大會要旨集、159、2003)。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，使產(chǎn)品中亞硫酸鹽含量增大的最簡單的方法是添加亞硫酸鹽，但近年來，消費(fèi)者中對無添加、天然原料的愿望增強(qiáng)，并希望食品添加劑的使用為最低限。因此，利用酵母自身的生命活動，對不由外界添加亞硫酸鹽即可達(dá)到對香味穩(wěn)定性有效的亞硫酸鹽濃度是行之有效的。但是，上述通過過程控制的方法由于供氧不足有時會降低酵母的增殖速度，引起發(fā)酵延遲及品質(zhì)下降，所以不一定實(shí)用。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道利用基因操作技術(shù)進(jìn)行酵母育種，其結(jié)果達(dá)到了親株的10倍以上的亞硫酸鹽濃度(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)，但另一方面， 也出現(xiàn)了發(fā)酵延遲，以及不受歡迎的香味成分乙醛及1-丙醇的增加等問題，所以實(shí)際應(yīng)用的酵母還存在著問題。因此，希望能有既不影響發(fā)酵速度和產(chǎn)品質(zhì)量，又能生產(chǎn)足量亞硫酸鹽的酵母的育種方法。本發(fā)明者為解決上述課題不斷銳意研究的結(jié)果，從啤酒酵母中成功地鑒定、分離了編碼過氧化氫酶的基因。且制備了將所得基因?qū)虢湍覆⑹蛊浔磉_(dá)的轉(zhuǎn)化酵母，確認(rèn)了亞硫酸鹽生成量的增加，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及啤酒酵母中存在的過氧化氫酶基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的表達(dá)得到調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化酵母、通過使用基因表達(dá)得到調(diào)節(jié)的酵母而控制產(chǎn)品中亞硫酸鹽生成量的方法等。具體地說，本發(fā)明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法等。(1)從以下(a) (f)組成的群組中選擇的多核苷酸(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸以及(f)含有與由編碼序列號2氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。(2)上述⑴中所述的多核苷酸，其從以下(g) ⑴組成的群中選擇(g)含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1 10個氨基酸的氨基酸序列組成的、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號2氨基酸序列有90%或90%以上同一性的氨基酸序列、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及
(i)含有與由序列號1堿基序列組成的多核苷酸或序列號1堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(5)上述(1) (4)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其是DNA。(6)蛋白質(zhì)，其由上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。(7)載體，其含有上述⑴ (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(7a)上述(7)中所述的載體，其含有具有以下(χ) (ζ)組成要素的表達(dá)盒(χ)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)上述⑴ (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其與該啟動子以正義方向或反義方向結(jié)合；以及(ζ)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號。(8)載體，其含有從以下(j) ⑴組成的群中組選擇的多核苷酸(j)含有編碼由序列號4的氨基酸序列或序列號4氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1 10個氨基酸的氨基酸序列組成的、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有編碼具有與序列號4氨基酸序列有90%或90%以上同一性的氨基酸序列、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(1)含有與由序列號3堿基序列組成的多核苷酸或序列號3堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。(9)酵母，其中導(dǎo)入了上述(7)或⑶中所述的載體。(10)上述(9)中所述的酵母，其亞硫酸鹽的生成能力提高了。(11)上述(10)中所述的酵母，其亞硫酸鹽的生成能力是通過使上述(6)中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加而獲得。(12)酒精飲料的制造方法，其包括培養(yǎng)上述(9) (11)中任一項(xiàng)所述的酵母。(13)上述(1 中所述的酒精飲料的制造方法，其中所釀造的酒精飲料是麥芽飲料。(14)上述(1 中所述的酒精飲料的制造方法，其中所釀造的酒精飲料是葡萄酒。(15)酒精飲料，其由上述(12) (14)中任一項(xiàng)所述的方法制造。(16) 一種評價(jià)被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，其包括使用基于具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列而設(shè)計(jì)的引物或探針。(16a)利用上述(16)中所述的方法，選擇亞硫酸鹽生成能力增強(qiáng)的酵母的方法。(16b)利用上述(16a)所述的方法所選擇的酵母制造酒精飲料(例如啤酒)的方法。(17)評價(jià)被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；以及測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因的
表達(dá)量。(17a)亞硫酸鹽生成能力高的酵母的選擇方法，其包括利用上述(17)中所述方法，評價(jià)被檢酵母，并且選擇編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)量高的酵母。(17b)使用根據(jù)上述(17a)中所述方法選擇的酵母制造酒精飲料(例如啤酒)的方法。(18)酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母，定量上述(6)中所述的蛋白質(zhì)或測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量，選擇前述蛋白量或前述基因表達(dá)量與目標(biāo)亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的被檢酵母。(19)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因在各酵母中的表達(dá)量；選擇該基因表達(dá)量高于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母。(20)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；定量各酵母中上述(6)所述的蛋白質(zhì)；選擇該蛋白質(zhì)含量高于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母。(21)酒精飲料的制造方法，其包括使用上述(9) (11)中任一所述的酵母或通過上述(18) 00)中任一所述方法所選擇的酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵；調(diào)節(jié)亞硫酸鹽的濃度。使用本發(fā)明的酒精飲料的制造方法，可使產(chǎn)品中具有抗氧化作用的亞硫酸鹽含量增大，因而可制造出香味穩(wěn)定性優(yōu)異、保質(zhì)期更長的酒精飲料。


圖1是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母增殖量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示0D660值。圖2是啤酒試驗(yàn)釀造中浸出物消耗量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間， 縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度Wh0A )。圖3是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母的non-kCTAl基因表達(dá)變動的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示檢測出的信號輝度。圖4是使用non-ScCTAl高表達(dá)株的啤酒試驗(yàn)釀造中酵母增殖量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示0D660值。圖5是使用non-ScCTAl高表達(dá)株的啤酒試驗(yàn)釀造中浸出物消耗量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w% ) ο圖6是表示使用non-ScCTAl高表達(dá)株的啤酒試驗(yàn)釀造在發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中亞硫酸鹽濃度的示意圖。圖7是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母增殖量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示0D660值。圖8是啤酒試驗(yàn)釀造中浸出物消耗量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間， 縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度Wh0A )。圖9是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母的&CTA1基因表達(dá)變動的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示檢測出的信號輝度。
圖10是使用ScCTAl高表達(dá)株的啤酒試驗(yàn)釀造中酵母增殖量經(jīng)時變化的示意圖。 橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示0D660值。圖11是使用ScCTAl高表達(dá)株的啤酒試驗(yàn)釀造中浸出物消耗量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w% ) ο圖12是表示使用&CTA1高表達(dá)株的啤酒試驗(yàn)釀造在發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中亞硫酸鹽濃度的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明者等以用日本特開2004-283169中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎(chǔ)，分離、鑒定了啤酒酵母中特有的編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的 non-ScCTAl基因。此堿基序列如序列號1所示。由此基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號2所示。并且分離、鑒定了啤酒酵母中編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)WkCTAl 基因。此堿基序列如序列號3所示。由此基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號4所
7J\ ο1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)含有由序列號1或序列號3的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；以及(b)含有編碼由序列號2或序列號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。作為本發(fā)明對象的多核苷酸，不只限于來自上述啤酒釀造酵母的編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，還包含編碼與此蛋白質(zhì)具同等功能的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。作為功能相同的蛋白質(zhì)，例如，可例舉為(c)具有由序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的，且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)。此種蛋白質(zhì)，可為由序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/ 或增加了例如1 100個、1 90個、1 80個、1 70個、1 60個、1 50個、1 40 個、1 39個、1 38個、1 37個、1 36個、1 35個、1 34個、1 33個、1 32個、 1 31個、1 30個、1 29個、1 28個、1 27個、1 26個、1 25個、1 24個、 1 23個、1 22個、1 21個、1 20個、1 19個、1 18個、1 17個、1 16個、 1 15個、1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6個(1 數(shù)個)、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個、或1個氨基酸殘基的氨基酸序列組成的，且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)。上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及 /或增加的數(shù)量，一般優(yōu)選較小的數(shù)量。次外，此種蛋白質(zhì)可例舉為(d)具有與序列號2 或序列號4氨基酸序列有約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74% 以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、 83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91% 以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、 99. 以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、 99. 8%以上、或99. 9%以上同一性的氨基酸序列，且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)。上述同一性的數(shù)值一般越大越好。
過氧化氧醇活性，可根據(jù)例如 Osorio et al. , Archives of Microbiology, 181 (3)，231-236 (2004)中所述的方法評價(jià)。另外，本發(fā)明也包含(e)含有與序列號1或序列號3堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼由序列號2或序列號4氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。此處的“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸”，是指以序列號1或序列號3堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸的全部或一部分、或編碼序列號2或序列號4氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。雜交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 等中所述的方法。本說明書中所述的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”可為低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中嚴(yán)謹(jǐn)條件、高嚴(yán)謹(jǐn)條件中的任一種。“低嚴(yán)謹(jǐn)條件”，例如，為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、32°C的條件?！爸袊?yán)謹(jǐn)條件”，例如，為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、42°C的條件?！案邍?yán)謹(jǐn)條件”，例如，為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50 %甲酰胺、50°C的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如 DNA)。影響雜交嚴(yán)謹(jǐn)性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強(qiáng)度、時間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適宜選擇這些因素，可實(shí)現(xiàn)相似的嚴(yán)謹(jǐn)條件。且雜交中使用市售的試劑盒時，例如，可使用Alkphos Direct Labelling Reagents[Amersham Pharmacia公司制]。此時，根據(jù)試劑盒中附帶的說明方案，與標(biāo)記了的探針進(jìn)行一夜培養(yǎng)后，將膜在的條件下，用含有0. 1% (w/v)SDS的第一次洗滌緩沖液洗滌，之后檢測雜交后的多核苷酸(例如DNA)。可雜交的其它多核苷酸包括，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使用默認(rèn)參數(shù)(default parameter)計(jì)算時，與編碼序列號2或序列號4氨基酸序列的多核苷酸具有約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、 77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85% 以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、 94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 以上、99. 2%以上、 99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、或99. 9%以上同一性的多核苷酸。且氨基酸序列、堿基序列的同一性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87，2264-2268，1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90，5873， 1993)確定。開發(fā)了基于 BLAST 算法、被稱為 BLASTN、BLASTX 的程序(Altschul SF, et al J. Mol. Biol. 215 :403，1990)。使用 BLASTN分析堿基序列時，參數(shù)例如為 score = 100,word length = 12。使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score = 50、wordlength = 3。 使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)
本發(fā)明也提供由上述多核苷酸(a) (1)中任一個編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)，包括由序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)。此種蛋白質(zhì)包括由序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了上述數(shù)量的氨基酸殘基的氨基酸序列組成的、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)。且此種蛋白質(zhì)也包括與序列號2或序列號4氨基酸序列具有如上所述同源性的氨基酸序列、且具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)。此種蛋白質(zhì)，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc. Acids. Res. ，10,6487 (1982) '\"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982) ”、"Gene, 34，315 (1985) ”、"Nuc. Acids. Res.，13,4431 (1985) ”、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA，82，488 (1985) ”等中所述的定點(diǎn)誘變法獲得。本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1個或多個氨基酸殘基，是指在同一氨基酸序列中任意1個或多個位置上，缺失、取代、插入及/或增加了 1個或多個氨基酸殘基之意，缺失、取代、插入及增加中的兩種或兩種以上也可同時發(fā)生。以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、ο-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸 (t-butyl alanine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexyl alanine) ；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2_氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid) ；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G 組苯丙氨酸、酪氨酸。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過 Fmoc 法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc 法(t-Butyl Oxy Carbony 1)等的化學(xué)合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃爾默 (Perkin Elmer)公司制、Pharmacia 公司制、Protein Technology Instruments 公司制、 Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、島津制作所公司制的肽合成儀等進(jìn)行化學(xué)合成。3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述(a) (1) 中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)。本發(fā)明的載體通常包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有(χ)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)與該啟動子以正義方向或反義方向結(jié)合的、上述(a) (1)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)；以及(ζ)含有與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號。導(dǎo)入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp 型)中的任一種。例如，YEp 型載體的 YEp24(J.R. Broach et al. ,Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83,1983)、YCp 型載體的 YCp50 (Μ. D. Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型載體的 YIp5 (K. Struhl et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,1035,1979)均已為人所知，且易獲得。用于調(diào)節(jié)酵母中基因表達(dá)的啟動子/終止子，如能在釀造用酵母中起作用，同時對發(fā)酵液中成分沒有影響，可任意組合。例如可利用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(TDH3) 的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的啟動子等。這些基因已被克隆，例如可通過 M-F.Tuite et al.，EMBO J. ,1,603(1982)中詳細(xì)記載的已知方法很容易地獲得。因釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，所以，轉(zhuǎn)化時使用的選擇性標(biāo)記可利用氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因(G418D、銅抗性基因(CUPl) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，3371984)、淺藍(lán)菌素抗性基因(fas2m, PDR4)(分別為豬腰淳嗣等，生化學(xué)，64，660，1992 ；Hussain et al.，gene，101，149，1991。日語原名；豬腰淳嗣 6， 生化學(xué)，64，660，1992 ；Hussain et al.，gene, 101，149，1991)等。如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。宿主酵母為可用于釀造的任意酵母，例如可為啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母屬(Saccharomyces) 等的酵母。在本發(fā)明中，可使用的啤酒酵母例如可為Saccharomyces pastorianus W34/70, Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456 等， 或 Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953 或 NBRC1954 等；。還可使用例如日本釀造協(xié)會葡萄酒用1號、3號、和4號等的葡萄酒酵母；以及例如清酒用酵母7號、和9號等的日本釀造協(xié)會清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，優(yōu)選使用的啤酒酵母例如為巴斯德酵母 (Saccharomyces pastorianus)0酵母的轉(zhuǎn)化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法“Meth. Enzym.，194，182(1990) ”、原生質(zhì)球法(Spheroplast 法)"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 751929(1978)”、醋酸鋰法 “J. Bacteriology，153，pl63(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75pl929(1978)、Methods in yeast genetics,2000 Edition :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實(shí)施，但不限于此。更具體地說，將宿主酵母置于標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基[例如YEPD培養(yǎng)基“Genetic Engineering. Vol. LPlenum Press, New York，117 (1979) ”等]中培養(yǎng)，使0D600nm值為 1 6。將此培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1 2M的堿金屬離子、優(yōu)選鋰離子進(jìn)行預(yù)處理。將此細(xì)胞在約30°C條件、靜置約60分鐘后，與待導(dǎo)入的DNA (約1 20 μ g)同時在約30°C條件下靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4，000道爾頓的聚乙二醇， 使最終濃度約為20% 50%。在約30°C、靜置約30分鐘后，將此細(xì)胞在約42°C條件，加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將此細(xì)胞懸浮液用標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放入預(yù)定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，約30°C下靜置約60分鐘。之后，將其接種到含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素或類似物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化體。其他有關(guān)一般性的克隆技術(shù)可參照(《分子克隆》第 3版)、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)，，等。4.本發(fā)明的酒精飲料的制造方法及根據(jù)其制法獲得的酒精飲料將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造所需酒精飲料的酵母中，并可通過使用其酵母，制造所需要的、且亞硫酸鹽含量增加的、香味穩(wěn)定性優(yōu)異的酒精飲料。而且通過下述本發(fā)明的酵母評價(jià)方法選擇的酵母也可同樣使用。作為制造對象的酒精飲料并不限于此，例如可例舉為啤酒、發(fā)泡飲料(happoushu)(例如啤酒味飲料)、葡萄酒、清酒等。制造上述酒精飲料時，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母代替親株以外，可利用公知的方法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往完全相同，不會因制造亞硫酸鹽含量增加的酒精飲料而增加成本。即根據(jù)本發(fā)明，可在使用已有設(shè)備、不增加成本的情況下， 制造香味穩(wěn)定性等優(yōu)異的酒精飲料。5.本發(fā)明的酵母的評價(jià)方法本發(fā)明涉及使用基于具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因的堿基序列而設(shè)計(jì)的引物或探針，評價(jià)被檢酵母的亞硫酸鹽的生產(chǎn)能力的方法。此種評價(jià)方法的一般方法為公知方法，例如，如WO 01/040514、日本特開平 8-205900號公報(bào)等中所記載。以下，就此評價(jià)方法進(jìn)行簡單說明。首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30(1990)]。以所得到的基因組為對象，使用基于編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因堿基序列(優(yōu)選ORF序列)而設(shè)計(jì)的引物或探針，測定被檢酵母的基因組中是否存在該基因或該基因的特異性序列。引物或探針的設(shè)計(jì)可使用公知的方法進(jìn)行?；蚧蛱禺愋孕蛄械臋z測可使用公知的方法進(jìn)行。例如，將含有特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸作為一個引物使用， 另一個引物為含有此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸，通過PCR法擴(kuò)增酵母的核酸，并測定擴(kuò)增物的有無、擴(kuò)增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數(shù)通常為IObp以上，優(yōu)選為15 25bp。且夾在兩引物間的堿基數(shù)，通常為300 2000bp較適當(dāng)。PCR法的反應(yīng)條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90 95°C、退火溫度 40 60°C、延伸溫度60 75°C、循環(huán)數(shù)10次以上等的條件。所得到的反應(yīng)生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，以測定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。根據(jù)此方法，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量是否是含有特異部分的DNA分子的大小，來預(yù)測、評價(jià)其酵母的亞硫酸鹽生產(chǎn)能力。 且可通過分析擴(kuò)增物的堿基序列，更進(jìn)一步正確地預(yù)測、評價(jià)上述能力。本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量，評價(jià)被檢酵母的亞硫酸鹽生產(chǎn)能力。 在測定編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)量時，可通過培養(yǎng)被檢酵母，然后定量來自編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因的mRNA或蛋白質(zhì)來進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR，蛋白質(zhì)的定量例如可通過 Western ￡口跡法進(jìn)行(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-200 。而且，可通過測定被檢酵母發(fā)酵后所得到的發(fā)酵液中的亞硫酸鹽濃度，預(yù)測被檢酵母中上述基因的表達(dá)量。而且，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量，選擇前述基因表達(dá)量與目標(biāo)過氧化氫酶活性相應(yīng)的酵母，來選擇適合釀造所需酒精飲料的酵母。也可培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定各酵母中前述基因的表達(dá)量，比較標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母的前述基因的表達(dá)量，來選擇所需的酵母。具體地說，例如可通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1或序列號 3的堿基序列、且編碼具有過氧化氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因的表達(dá)高于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母，來選擇適合釀造所需酒精飲料的酵母。或者，可通過培養(yǎng)被檢酵母，選擇過氧化氫酶活性較強(qiáng)的酵母，來選擇適合釀造所需酒精飲料的酵母。此時，被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，例如為使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明載體的酵母、實(shí)施了突變處理的酵母或自發(fā)突變的酵母等。過氧化氫酶活性，例如可用Osorio et al. ,Archives of Microbiology, 181 (3), 231-236 (2004)中所述的方法評價(jià)。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過甲磺酸乙酯(EMS =Ethylmethanesulfonate), N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等藥劑處理的化學(xué)方法等的任何方法進(jìn)行(例如，參照大島泰治編著、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法39酵母分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法、ρ 67-75、學(xué)會出版中心。日語原名；大嶋泰治編著、生物化學(xué)実験法39酵母分子遺伝學(xué)実験法、p67-75、學(xué)會出版七 > 夕一)。作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉為釀造時可使用的任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母[例如，巴斯德酵母(S. pastorianus)、S. cerevisiae、及 S. carlsbergensis)， 本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如 Saccharomyces pastorianus W34/70, Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、 或 NCYC456, 或 Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、 NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。而且還可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；例如日本釀造協(xié)會葡萄酒用1號、3號、和4號等的葡萄酒酵母；例如日本釀造協(xié)會清酒用7號、和9號等的清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母可從上述酵母群中以任意組合選擇。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1 啤酒釀造酵母中編碼過氧化氫酶的基因(nonScCTAl)的克隆使用日本特開2004-283169號公報(bào)中記載的比較數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中特有的編碼過氧化氫酶的基因non-ScCTAl (序列號1)。以所得到的堿基序列信息為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各自全長基因的引物non-kCTAl_for (序列號5)和n0n-kCTAl_ rv( 6),Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70 ^ (有時可簡寫為“W34/70株”)的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有nonlcCTAl全長基因的DNA片段。將如上所述獲得的non-kCTAl基因片段通過TA克隆插入到pCR2. 1-T0P0載體 [invitrogen 公司制]。將 nonlcCTAl 基因的堿基序列用 Sanger 方法(F. Sanger, Science, 214 :1215,1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。實(shí)施例2 啤酒試驗(yàn)釀造中non-kCTAl基因表達(dá)的分析使用啤酒酵母&iccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒試驗(yàn)釀造，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。麥芽汁浸出物濃度麥芽汁容量麥芽汁溶解氧濃度發(fā)酵溫度酵母投入量
8.6ppm 15°C
12.8x10% 胞/mL
12.69% 70L對發(fā)酵液經(jīng)時取樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖幻的經(jīng)時變化。 與此同時對酵母菌體取樣以制備mRNA，對制備后的mRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，使其在啤酒酵母 DNA 微陣列雜交。信號檢測使用 GeneChip Operating System[GC0S ；GeneChip Operating Software 1. 0 AFFYMETRIX公司制]進(jìn)行。Non-ScCTAl基因的表達(dá)模式如圖3所示。由此結(jié)果可確認(rèn)，通常的啤酒發(fā)酵中，non-ScCTAl基因進(jìn)行了表達(dá)。實(shí)施例3 :non-ScCTAl基因高表達(dá)株的制備將實(shí)施例1中所述的non-ScCTAl/pCR2. 1-T0P0用限制性內(nèi)切酶&icl及NotI酶切，制備包含non-kCTAl基因的DNA片段。使此片段與用限制性內(nèi)切酶McI及NotI處理的pUP3GLP2連接，構(gòu)建了 non-ScCTAl高表達(dá)載體pUP-noMcCTAl。pUP3GLP2是指同源重組位點(diǎn)含有乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因URA3的YIp型(染色體整合型)酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過3-磷酸甘油醛脫氫酶基因TDH3的啟動子/終止子高表達(dá)。在半乳糖激酶基因GALl的啟動子/終止子的控制下，導(dǎo)入作為選擇性標(biāo)記的耐藥性基因YAP1，由此在含有半乳糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)。還包括作為大腸桿菌的選擇性標(biāo)記氨芐青霉素抗性基因 Ampr。使用由上述方法制備的高表達(dá)載體，用日本特開平07-303475中所述的方法轉(zhuǎn)化 Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 164 株，用含有 L Omg/L 淺藍(lán)菌素的 YPGal 平板培養(yǎng)基(1%酵母浸出物、2%多聚蛋白胨、2%半乳糖、2%瓊脂)選擇淺藍(lán)菌素抗性菌株。實(shí)施例4 啤酒試驗(yàn)釀造中亞硫酸鹽生成量的解析使用親株及用實(shí)施例3中所述方法獲得的non-kCTAl高表達(dá)株，在以下條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。對發(fā)酵液經(jīng)時取樣，觀察酵母增殖量(0D660)(圖4)、浸出物消耗量(圖5)的經(jīng)時變化。對發(fā)酵終止時亞硫酸鹽濃度的定量，是在酸性條件下，通過蒸餾將亞硫酸鹽收集于過氧化氫水溶液中后，用堿滴定[(財(cái))日本釀造協(xié)會修訂的BCOJ啤酒分析法](日語原名； (財(cái))日本醸造協(xié)會改訂BCOJ e — >分析法)。如圖6所示，可判明non-ScCTAl高表達(dá)株生成了高于親株約2. 5倍的亞硫酸鹽。 且此時，親株與高表達(dá)株之間在增殖速度及浸出物消耗速度上無顯著差異。
麥芽汁浸出物濃度麥芽汁容量麥芽汁溶解氧濃度發(fā)酵溫度酵母投入量
10.5g濕酵母菌體/2L麥芽汁
約 8ppm 15°C,恒定
12.87% 2L
實(shí)施例5 編碼過氧化氫酶的基因(ScCTAl)的克隆使用日本特開2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中特有的編碼過氧化氫酶的基因&07\1(序列號3)。以所得到的堿基序列信息為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各自全長基因的引物ScCTAl_f0r (序列號7)和ScCTAl_rV(序列號8)，以基因組角軍i賣tt Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70 株的染色體 DNA 為模板，通過PCR，獲得了含有&CTA1全長基因的DNA片段。將如上所述得到的ScCTAl基因片段通過TA克隆插入到pCR2. 1-T0P0載體 [invitrogen公司制]。將&CTA1基因的堿基序列用Sanger方法(F. Sanger, Science, 214 :1215,1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。實(shí)施例6 啤酒試驗(yàn)釀造中ScCTAl基因表達(dá)的分析使用啤酒酵母&iccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒試驗(yàn)釀造，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。
權(quán)利要求
1.從以下組中選擇的多核苷酸(a)由序列號3的堿基序列組成的多核苷酸；和(b)編碼由序列號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其是DNA。
3.蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸編碼。
4.載體，其含有權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸。
5.酵母，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求4中所述的載體。
6.權(quán)利要求5所述的酵母，其亞硫酸鹽的生成能力增強(qiáng)了。
7.權(quán)利要求6所述的酵母，其亞硫酸鹽生成能力的增強(qiáng)是通過使權(quán)利要求3中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加而獲得。
8.酒精飲料的制造方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)所述的酵母。
9.權(quán)利要求8所述的酒精飲料的制造方法，其中所釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
10.權(quán)利要求8所述的酒精飲料的制造方法，其中所釀造的酒精飲料是葡萄酒。
11.一種評價(jià)被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，其包括使用由序列號3的堿基序列組成的基因的堿基序列而設(shè)計(jì)的弓I物或探針。
12.—種評價(jià)被檢酵母的亞硫酸鹽生成能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；以及測定由序列號3的堿基序列組成的基因的表達(dá)量。
13.一種酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；定量權(quán)利要求3中所述的蛋白質(zhì)或測定由序列號3的堿基序列組成的基因的表達(dá)量；選擇前述蛋白量或前述基因表達(dá)量與目標(biāo)亞硫酸鹽生成能力相應(yīng)的被檢酵母。
14.權(quán)利要求13所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；測定由序列號3的堿基序列組成的基因在各酵母中的表達(dá)量；以及選擇基因表達(dá)量高于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母。
15.權(quán)利要求13所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；定量各酵母中權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)；以及選擇所述蛋白質(zhì)含量高于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母。
16.酒精飲料的制造方法，其包括使用權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)所述的酵母或通過權(quán)利要求13 15中任一項(xiàng)所述的方法選擇的酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵；以及調(diào)節(jié)亞硫酸鹽的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼過氧化氫酶的基因及其用途，特別是涉及制造亞硫酸鹽生成能力強(qiáng)的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說，本發(fā)明涉及通過提高釀造酵母的編碼過氧化氫酶Cta1p的基因CTA1、特別是啤酒酵母中特征性的non-ScCTA1基因或ScCTA1基因的表達(dá)量，使對產(chǎn)品香味穩(wěn)定性起作用的亞硫酸鹽的生成能力提高的酵母及使用該酵母的酒精飲料制造方法等。
文檔編號C12C11/02GK102174544SQ20111005999
公開日2011年9月7日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者下永朋子, 中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子, 大村文彥 申請人:三得利控股株式會社