專(zhuān)利名稱(chēng)：腺伴隨病毒(aav)進(jìn)化支、序列、含有這些序列的載體及它們的應(yīng)用的制作方法
腺伴隨病毒(AAV)進(jìn)化支、序列、含有這些序列的載體及它
們的應(yīng)用本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2004/(^8817，國(guó)際申請(qǐng)日為2004年9月 30日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮椤?00480027905. 2”，發(fā)明名稱(chēng)為“腺伴隨病毒(AAV)進(jìn)化支、序列、含有這些序列的載體及它們的應(yīng)用”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開(kāi)發(fā)的聲明本申請(qǐng)包括由國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的NIDDK P30 DK47757和NHLBI POl HL59407 撥款資助的工作。美國(guó)政府享有本發(fā)明的一定權(quán)力。
背景技術(shù)：
腺伴隨病毒(AAV)是細(xì)小病毒科家族的成員，它是小的無(wú)包膜、二十面體病毒，具有4. 7千堿基(1Λ)到61Λ的單鏈線形DNA基因組。由于該病毒是作為純化的腺病毒原種的污染物被發(fā)現(xiàn)，AAV指定為依賴(lài)病毒屬(D印endovirus)。AAV的生命周期包括潛伏期(AAV 基因組在感染后位點(diǎn)特異性地整合進(jìn)宿主染色體)，感染期(腺病毒或單純皰疹病毒感染后，整合的基因組接著得到拯救、復(fù)制并包裝進(jìn)感染性病毒)。非致病性的特性、感染性的寬宿主范圍(包括非分裂細(xì)胞)與潛在的位點(diǎn)特異性染色體整合使得AAV成為用于基因轉(zhuǎn)移的有吸引力的工具。近來(lái)的研究表明AAV載體是用于基因遞送的優(yōu)選運(yùn)載體。迄今為止，已從人或非人靈長(zhǎng)類(lèi)(NHP)分離了幾種表征良好的不同AAV。已發(fā)現(xiàn)不同血清型的AAV表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率，也表現(xiàn)出對(duì)不同細(xì)胞或組織的向性。然而，以前還未對(duì)這些不同血清型之間的關(guān)系進(jìn)行研究?；贏AV的構(gòu)建物用于遞送異源分子是理想的。發(fā)明概述本發(fā)明提供AAV的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)序列的“超家族”或“進(jìn)化支”。這些AAV進(jìn)化支提供用于將分子靶向和/或遞送至所需靶細(xì)胞或組織的AAV序列源。本發(fā)明一方面提供具有至少三個(gè)AAV成員的AAV進(jìn)化支，這些成員是基于AAV VPl氨基酸序列對(duì)比，使用自引值為至少75% (基于至少1000次復(fù)制)的鄰接啟發(fā)式算法(Neighbor-Joining heuristic)與不大于0. 05的泊松校正距離測(cè)量值(Poisson correction distance measurement)確定為系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的。合適的AAV進(jìn)化支由用于產(chǎn)生載體的AAV序列組成。本發(fā)明還提供以前未知的人AAV血清型，這些血清型在本文中稱(chēng)為克隆觀.4/ hu. 14或AAV血清型9。因此，本發(fā)明另一方面提供一種由AAV衣殼組成的血清型9的AAV， 該衣殼在血清學(xué)上與SEQ ID NO :123的氨基酸1-736的序列的衣殼相關(guān)，在血清學(xué)上與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7 或 AAV8 中的任一衣殼蛋白不同。用該huAAV9的衣殼構(gòu)建的載體表現(xiàn)出的基因轉(zhuǎn)移效率類(lèi)似于肝臟中的AAV8、優(yōu)于肌肉中的AAV并且比肺中的AAV5高200倍。此外，該新的人AAV血清型與以前所述的 AAVl到AAV8的序列同一性小于85%，并且不被任何這些AAV交叉中和。本發(fā)明也提供其它新的AAV序列、含有這些序列的組合物及它們的應(yīng)用。有利的是，這些組合物特別適用于出于治療或預(yù)防目的需要反復(fù)施用的AAV載體。本發(fā)明的這些和其它方面可通過(guò)以下發(fā)明詳述得到明白。附圖簡(jiǎn)述

圖1是使用帶泊松校正距離測(cè)量值的鄰接啟發(fā)式算法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系樹(shù)?；诜蛛x的AAV vpl衣殼蛋白與分組于進(jìn)化支中分離的AAV確定關(guān)系。單個(gè)衣殼克隆的組基于它們共同的祖先分類(lèi)在進(jìn)化支中。進(jìn)化支以A到F命名；亞型以進(jìn)化支字母加上一個(gè)數(shù)值表示。圖2A-2AE對(duì)比了本發(fā)明的AAV vpl衣殼蛋白的氨基酸序列(公布了各個(gè)序列的編號(hào))與以前公布的MVl [SEQ ID NO :219]、AAV2[SEQ ID NO :221]、MV3_3 [SEQ ID NO :217]、 AAV4-4[SEQ ID NO :218]、AAV5[SEQ ID NO :216]、AAV6[SEQ ID NO :220]、AAV7[SEQ ID NO: 222]、AAV8[SEQ ID NO :223]與 rh. 25/42_15、29. 3/bb. 1、cy. 2、29. 5/bb. 2、rh.32、rh. 33、 rh. 34,rh. 10,rh. 24、rhl4、rh. 16,rh. 17,rh. 12,rh. 18,rh. 21 (以前稱(chēng)為 41. 10)、rh. 25 (以前稱(chēng)為 41. 15)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、rh. 37、 rh. 36,rh. 23,rh. 8 和 ch5 [公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2003/0138772 Al (2003 年 7 月 24 日)]。 本發(fā)明的序列包括 hu. 14/AAV9[SEQ ID NO 123]、hu. 17 [SEQ ID NO :83]、hu. 6 [SEQ ID NO: 84]、hu.42[SEQ ID NO :85]、hu.38 [SEQ ID NO :86]、hu.40[SEQ ID NO :87]、hu.37 [SEQ ID NO :88]、rh. 40[SEQ ID NO :92]、rh. 52[SEQ ID NO :96]、rh.53[SEQ ID NO :97]、rh. 49[SEQ ID NO :103]、rh. 51 [SEQ ID NO :104]、rh. 57 [SEQ ID NO :105]、rh. 58 [SEQ ID NO :106]、 rh. 61 [SEQ ID NO : 107]、rh. 50 [SEQ ID NO : 108]、rh. 43 [SEQ ID NO : 163]、rh. 62 [SEQ ID NO :114]、rh. 48[SEQ ID NO :115]、4_9/rh. 54[SEQ ID NO :116]和4-19/rh. 55[SEQ ID NO: 117],hu.31[SEQ ID NO : 121]、hu. 32[SEQ ID NO :122]、hu.34[SEQ ID NO :125]、hu.45[SEQ ID NO :127]、hu. 47 [SEQ ID NO : 128]、hu. 13 [SEQ ID NO : 129]、hu. 28 [SEQ ID NO :130]、 hu. 29 [SEQ ID NO :132], hu. 19 [SEQ ID NO : 133]、hu. 20 [SEQ ID NO :134]、hu. 21 [SEQ ID NO :135]、hu. 23. 2 [SEQ ID NO : 137]、hu. 22 [SEQ ID NO :138]、hu. 27 [SEQ ID NO :140]、 hu. 4[SEQ ID NO :141]、hu. 2 [SEQ ID NO :143]、hu. 1 [SEQ ID NO : 144]、hu. 3 [SEQ ID NO: 145],hu. 25[SEQ ID NO : 146]、hu. 15[SEQ ID N0:147]、hu. 16[SEQ ID NO :148],hu. 18[SEQ ID NO :149]、hu. 7 [SEQ ID NO :150]、hu. 11 [SEQ ID NO : 153]、hu. 9 [SEQ ID NO: 155]、 hu. 10 [SEQ ID NO :156]、hu. 48 [SEQ ID NO : 157]、hu. 44 [SEQ ID NO : 158]、hu. 46 [SEQ ID NO :159]、hu. 43 [SEQ ID NO : 160]、hu. 35 [SEQ ID NO : 164]、hu. 24 [SEQ ID NO :136]、 rh. 64 [SEQ ID NO :99]、hu. 41 [SEQ ID NO :91]、hu. 39 [SEQ ID NO : 102]、hu. 67 [SEQ ID NO: 198],hu.66[SEQ ID NO : 197]、hu. 51[SEQ ID NO : 190]、hu. 52[SEQ ID NO :191]、hu.49[SEQ ID NO :189]、hu. 59 [SEQ ID NO :192]、hu. 57 [SEQ ID NO :193]、hu. 58 [SEQ ID NO :194]、 hu. 63 [SEQ ID NO : 195]、hu. 64 [SEQ ID NO : 196]、hu. 60 [SEQ ID NO : 184]、hu. 61 [SEQ ID NO :185]、hu. 53 [SEQ ID NO : 186]、hu. 55 [SEQ ID NO : 187]、hu. 54 [SEQ ID NO :88]、 hu. 6[SEQ ID NO :84]與rh. 56[SEQ ID NO :152]。這些衣殼序列也見(jiàn)引為參考的序列表中。圖3A-3CN對(duì)比了本發(fā)明的AAV vpl衣殼蛋白的核酸序列(公布了各個(gè)序列的編號(hào))與以前公布的 AAV5(SEQ ID NO 199)、AAV3-3 (SEQ ID NO :200)、AAV4-4 (SEQ ID NO: 201)、AAVl (SEQ ID NO :202)、AAV6 (SEQ ID NO :203)、AAV2 (SEQ ID NO :211)、AAV7 (SEQ ID NO 213)與 AAV8(SEQ ID NO :214)、rh. 25/42_15、29. 3/bb. 1、cy. 2、29. 5/bb. 2、rh. 32、rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前稱(chēng)為 41. 10)、 rh. 25 (以前稱(chēng)為 41. 15 ；GenBank 登錄號(hào) AY530557)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、 cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、rh. 36、rh. 37、rh. 23、rh. 8 與 ch. 5[公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2003/0138772 Al (2003 年 7 月 24 曰)]。本發(fā)明的核酸序列包括 hu. 14/AAV9 (SEQ ID NO: 3)、LG-4/rh. 38 (SEQ ID NO :7)、LG-10/rh. 40 (SEQID NO :14)、N721-8/rh. 43 (SEQ ID NO 43) U-8/rh. 49 (SEQ ID NO :25)、2_4/rh. 50 (SEQ ID NO :23)、2_5/rh. 51 (SEQ ID NO :22)、 3-9/rh. 52(SEQ ID NO : 18)、3_11/rh. 53(SEQ ID NO : 17)、5_3/rh. 57(SEQ ID NO :26)、 5-22/rh. 58(SEQ ID NO :27)、2_3/rh. 61(SEQ ID NO :21)、4_8/rh.64 (SEQ ID NO :15)、 3. 1/hu. 6 (SEQ ID NO :5)、33. 12/hu. 17 (SEQ ID NO :4)、106. 1/hu. 37 (SEQ ID NO: 10)、 LG-9/hu. 39(SEQ ID NO 24),114. 3/hu. 40(SEQ ID NO :11),127.2/hu. 41(SEQ ID NO :6)、 127.5/hu. 42(SEQ ID NO :8)與 hu.66 (SEQ ID NO :173)、2_15/rh. 62(SEQ ID NO :33)、 1-7/rh. 48 (SEQ ID NO :32)、4_9/rh. 54 (SEQ ID NO :40)、4_19/rh. 55 (SEQ ID NO:37)、52/ hu. 19(SEQ ID NO :62)、52.1/hu. 20 (SEQ ID NO :63)、54.5/hu. 23(SEQ ID NO :60)、54. 2/ hu. 22 (SEQ ID NO :67)、54. 7/hu. 24 (SEQ ID NO :66),54. 1/hu. 21 (SEQ ID NO :65)、54. 4R/ hu. 27 (SEQ ID NO 64),46.2/hu.28 (SEQ ID NO 68),46.6/hu.29 (SEQ ID NO :69)、128.1/ hu. 43 (SEQ ID NO :80)、128. 3/hu. 44 (SEQ ID NO :81)與 130. 4/hu. 48 (SEQ ID NO :78)、3. 1/ hu.9 (SEQ ID NO :58)、16. 8/hu. 10(SEQ ID NO :56)、16.12/hu. 11(SEQ ID NO :57)、145. 1/ hu.53 (SEQ ID NO : 176)、145. 6/hu. 55(SEQ ID NO :178)、145. 5/hu. 54(SEQ ID NO :177)、 7. 3/hu. 7 (SEQ ID NO :55)、52/hu. 19 (SEQ ID NO :62)、33. 4/hu. 15 (SEQ ID N0:50)、33.8/ hu.16(SEQ ID NO 51),58.2/hu. 25(SEQ ID NO :49)、161. 10/hu. 60(SEQ ID NO :170)、H_5/ hu. 3 (SEQ ID NO :44),H-1/hu. 1(SEQ ID NO :46)、161.6/hu. 61 (SEQ ID NO :174)、hu.31 (SEQ ID NO 1),hu.32 (SEQ ID NO :2)、hu.46 (SEQ ID NO :82)、hu. 34 (SEQ ID NO :72)、hu.47 (SEQ ID NO :77)、hu. 63 (SEQ ID NO :204)、hu. 56 (SEQ ID NO :205)、hu. 45 (SEQ ID NO :76)、 hu. 57 (SEQ ID NO :206)、hu. 35 (SEQ ID NO :73)、hu. 58 (SEQ ID NO :207)、hu. 51 (SEQ ID NO: 208)、hu. 49 (SEQ ID NO :209)、hu. 52 (SEQ ID NO :210)、hu. 13 (SEQ ID NO :71)、hu. 64 (SEQ ID NO :212)、rh. 56 (SEQ ID NO :54)、hu.2 (SEQ ID NO :48)、hu. 18 (SEQ ID NO :52)、hu.4 (SEQ ID NO 47)與hu. 67 (SEQ IDNO :215)。這些衣殼序列也見(jiàn)引為參考的序列表中。圖4A-4D提供了對(duì)基于AAV的新靈長(zhǎng)類(lèi)載體在體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率的評(píng)價(jià)。 AAV 載體是如[Gao 等，Proc Natl Acad Sci 美國(guó)，“11邪4_11859 O002 年，9 月 3 日)]所述具有 AAV1、2、5、7、8 和 6 與 ch. 5、rh. 34,cy. 5、rh. 20,rh. 8 和 AAV9 衣殼的假型。如圖 4A 所示，為進(jìn)行體外研究，接種于95-孔板的84-32細(xì)胞(表達(dá)腺病毒血清型E4的293細(xì)胞) 以每細(xì)胞1 X IO4GC的感染復(fù)數(shù)(MoI)用假型AAVCMVEGFP載體感染。感染后48小時(shí)使用紫外顯微鏡將相對(duì)EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)效率估計(jì)為綠色細(xì)胞的百分比并顯示在Y軸上。為進(jìn)行體內(nèi)研究，分別經(jīng)門(mén)內(nèi)(intraportal)(圖4B)、氣管內(nèi)(圖4C)和肌肉內(nèi)(圖4D)以每只動(dòng)物 1 X IO11GC的劑量給予NCR裸鼠周齡)的肝(圖4B)、肺(圖4C)和肌肉(圖4D)以表達(dá)分泌的報(bào)道基因AlAT的載體。在基因轉(zhuǎn)移后第觀天比較血清AlAT水平(ng/ml)并示于Y軸上。X軸表示所分析的AAV與它們所屬的進(jìn)化支。發(fā)明詳述在任何用于治療或預(yù)防的載體庫(kù)中，為所需應(yīng)用選擇載體源，需要能將大分子攜帶至靶細(xì)胞的各種不同載體。迄今為止，關(guān)于將AAV用作載體的一個(gè)問(wèn)題是缺乏各種不同的病毒來(lái)源。本發(fā)明通過(guò)提供AAV的進(jìn)化支來(lái)克服該問(wèn)題，所述進(jìn)化支用于選擇系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的(或選擇治療方案所需的)，或系統(tǒng)發(fā)生不同的AAV并用于預(yù)測(cè)功能。本發(fā)明還提供新的AAV病毒。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“基本同源性”或“基本相似性”指核酸或其片段時(shí)意味著當(dāng)合適的核苷酸插入物或缺失物與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳對(duì)比時(shí)，對(duì)比序列中至少約95%到99%的核苷酸序列同一性。優(yōu)選在全長(zhǎng)序列、或其開(kāi)放讀框、或另一至少長(zhǎng)15個(gè)核苷酸的合適片段上具有同源性。合適片段的例子描述于本文。文中用于核酸序列的術(shù)語(yǔ)“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”指當(dāng)對(duì)比最大一致性時(shí)，兩條序列中的殘基相同。序列同一性比較的長(zhǎng)度可是基因組全長(zhǎng)、基因編碼序列的的全長(zhǎng)，或需要至少約500到5000個(gè)核苷酸的片段。然而，較小片段中的同一性也是需要的，例如至少約9個(gè)核苷酸、通常至少約20到M個(gè)核苷酸、至少約28到32 個(gè)核苷酸、至少約36或更多個(gè)核苷酸的片段。類(lèi)似地，氨基酸序列、蛋白全長(zhǎng)、或其片段的 “序列同一性百分比”可容易地確定。合適片段的長(zhǎng)度至少約8個(gè)氨基酸，也可達(dá)約700個(gè)氨基酸。合適片段的例子描述于文中。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“基本同源性”或“基本相似性”指氨基酸或其片段時(shí)意味著當(dāng)合適的氨基酸插入物或缺失物與另一氨基酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳對(duì)比時(shí)，對(duì)比序列中至少約95%到 99%的氨基酸序列同一性。優(yōu)選在全長(zhǎng)序列，或其蛋白質(zhì)(例如，cap蛋白、r印蛋白)，或其至少8個(gè)氨基酸，或更希望至少15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段上具有同源性。合適片段的例子描述于本文。術(shù)語(yǔ)“高度保守的”表示至少80%的同一性、優(yōu)選至少90%的同一性、更優(yōu)選超過(guò) 97%的同一性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可憑借本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的算法和計(jì)算機(jī)程序容易地
確定同一性?！惝?dāng)提及在兩種不同的腺伴隨病毒之間的“同一性”、“同源性”或“相似性”時(shí)， “同一性”、“同源性”或“相似性”是參考“對(duì)比”的序列確定的?！皩?duì)比”的序列或“對(duì)比”指多核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，與參考序列相比，該序列通常含有缺失的或附加的堿基或氨基酸的校正。在實(shí)施例中，使用公開(kāi)的AAV2或AAVl序列作為參考點(diǎn)進(jìn)行AAV對(duì)比。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地選擇另一 AAV序列作為參考?？墒褂萌魏胃鞣N公用或市售可得的多序列對(duì)比程序進(jìn)行對(duì)比。這種程序的例子包括通過(guò)因特網(wǎng)的萬(wàn)維服務(wù)器可得的“Clustal W”、“CAP序列組件，，、"MAP，，和“MEME”。這種程序的其它來(lái)源是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；蛘咭部墒褂肰ector NTI實(shí)用程序。許多本領(lǐng)域已知的算法，包括包含在上述程序中的算法也可用于測(cè)量核苷酸序列同一性。使用 GCG6. 1版中的程序i^asta 來(lái)比較多核苷酸序列是另一個(gè)例子。i^asta 提供在查詢(xún)和檢索序列之間最佳重疊區(qū)域的對(duì)比和序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用GCG6. 1版提供的具有默認(rèn)參數(shù)的i^staTM(字長(zhǎng)為6和用于計(jì)分矩陣的NOPAM 系數(shù))來(lái)確定，該程序納入本文引作參考。多序列對(duì)比程序也可應(yīng)用于氨基酸序列，例如 "Clustal 1”、“嫩卩”、“卩1嫩”、“]\^六”、“811)0(獻(xiàn)詘1 ”、“]\^]\^”和“]\&1切11-8( ”程序。雖然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可視需要改變這些設(shè)置，但通常這些程序以默認(rèn)設(shè)置使用?；蛘撸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可利用另一種算法或計(jì)算機(jī)程序，該算法或程序提供的同一性或算法的水平至少
6同參考的算法和程序提供的一樣。參見(jiàn)，例如J. D. Thomson等，Nucl. Acids. Res.，“多序列對(duì)比白勺綜合比較，，(A comprehensive comparison of multiple sequence alignments), 27(13) :2682-2690(1999) 術(shù)語(yǔ)“血清型”區(qū)分具有在血清學(xué)上不同于其它AAV血清型的一種衣殼的AAV。血清學(xué)特殊性是基于與其它AAV相比，針對(duì)AAV的抗體之間缺乏交叉反應(yīng)性來(lái)確定。交叉反應(yīng)性通常在中和抗體試驗(yàn)中測(cè)定。就該試驗(yàn)而言，使用腺伴隨病毒在家兔或其它合適的動(dòng)物模型中產(chǎn)生抗特異性AAV的多克隆血清。然后在該試驗(yàn)中測(cè)試所產(chǎn)生的抗特異性AAV的血清中和相同(同源)或異源AAV的能力。達(dá)到50%中和作用的稀釋度看作中和抗體滴度。如果就兩種AAV而言，倒數(shù)形式的異源滴度除以同源滴度的商小于16，則此兩種AAV可視為是相同的血清型。相反，如果倒數(shù)形式的異源滴度與同源滴度之比是16 或更大，此兩種AAV視為是不同血清型。如本文所定義，為形成血清型9，所產(chǎn)生針對(duì)所選AAV衣殼的抗體必須與AAVl、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8中任一種不交叉反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在本文中鑒定為人AAV血清型9的新血清型的AAV衣殼。本說(shuō)明書(shū)與權(quán)利要求書(shū)使用的術(shù)語(yǔ)“含有”和“包括”是包括其它成分、元素、整數(shù)、 步驟等在內(nèi)。相反，術(shù)語(yǔ)“由...組成”和其變體不包括其它成分、元素、整數(shù)、步驟等在內(nèi)。1.進(jìn)化支在一方面，本發(fā)明提供了 AAV的進(jìn)化支。進(jìn)化支是基于AAV vpl氨基酸序列對(duì)比， 使用自引值為至少75% (至少1000次復(fù)制)的鄰接啟發(fā)式算法與不大于0.05的泊松校正距離測(cè)量值確定為互相系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的一組AAV。鄰接算法詳細(xì)描述于參考文獻(xiàn)。參見(jiàn)，例如M. Nei與S. Kumar,《分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)生學(xué)》(Molecular Evolution and Phylogenetics)(牛津大學(xué)出版社，紐約 Q000)。計(jì)算機(jī)程序可用于執(zhí)行該算法。例如，MEGA v2.1程序執(zhí)行改進(jìn)的Nei-Gojobori方法。使用這些技術(shù)與計(jì)算機(jī)程序，AAV vpl衣殼蛋白的序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定所選擇的AAV是否包含在文中所鑒定的一種進(jìn)化支內(nèi)、另一種進(jìn)化支內(nèi)、或在這些進(jìn)化支之外。雖然本文所定義的進(jìn)化支主要基于天然的AAV vpl衣殼，這些進(jìn)化支不限于天然的AAV。這些進(jìn)化支可包括非天然AAV，包括(但不限于)重組、修飾、嵌合、雜交、合成、人工的等，基于AAV vpl氨基酸序列對(duì)比，使用自引值為至少75% (至少1000次復(fù)制)的鄰接啟發(fā)式算法與不大于0. 05的泊松校正距離測(cè)量值確定為系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的AAV。本文所述的進(jìn)化支包括進(jìn)化支A(以AAVl和AAV6表示)、進(jìn)化支B(以AAV2表示)、進(jìn)化支C (以AAV2-AAV3雜交體表示)、進(jìn)化支D (以AAV7表示)、進(jìn)化支E (以AAV8表示)與進(jìn)化支F(以人AAV9表示)。這些進(jìn)化支以前文所述AAV血清型的進(jìn)化支的成員代表。前文所述的AAVl和AAV6是單一進(jìn)化支(進(jìn)化支A)的成員，該進(jìn)化支中4種分離物回收自3種人。前文所述AAV3和AAV5血清型明顯相互不同，但在本文所述的篩選中未檢測(cè)到，并且未包括于任何這些進(jìn)化支中。進(jìn)化支B(AAV2)和進(jìn)化支C(AAV2-AAV3雜交體)是在人中發(fā)現(xiàn)的AAV最豐富的 (AAV2有22種分離物來(lái)自12種個(gè)體，進(jìn)化支C有17個(gè)分離物來(lái)自8種個(gè)體)。大量的序列分組于進(jìn)化支D (AAV7)或進(jìn)化支E (AAV8)。有趣的是，這些進(jìn)化支普遍存在于不同物種中。進(jìn)化支D對(duì)恒河猴與南美彌猴是獨(dú)特的，具有分離自10種不同動(dòng)物的15個(gè)成員。由于進(jìn)化支E在人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)，它是令人感興趣的9種分離物回收自 7種人而21種分離物得自9種不同的非人靈長(zhǎng)類(lèi)，包括恒河猴、狒狒和豚尾彌猴(pigtail monkey)。在其它兩種動(dòng)物中證實(shí)了某些序列的雜交特性，雖然在該情況中所有的序列似乎具有起源于兩種協(xié)同感染病毒(在兩種動(dòng)物中是進(jìn)化支D與進(jìn)化支E病毒)的獨(dú)立而不同的重組。這些重組體無(wú)一在其它動(dòng)物或受試對(duì)象中鑒定到。因?yàn)檫M(jìn)化支C(AAV2_AAV3雜交體)在6種不同的人對(duì)象中鑒定到，重組甚至導(dǎo)致了合適的后代。另一方面，就AAV7-AAV8雜交體而言，僅有少數(shù)重組情況涉及AAV進(jìn)化。這些重組情況說(shuō)明AAV能重組，從而產(chǎn)生框內(nèi)基因以及在一些情況中產(chǎn)生可包裝和/或感染性衣殼結(jié)構(gòu)。另一方面，進(jìn)化支C(AAV2-AAV3雜交體進(jìn)化支)是一組通過(guò)重組獲得選擇性?xún)?yōu)點(diǎn)的病毒，這種重組使它們?nèi)淌墉h(huán)境壓力。A.進(jìn)化支A (以AAVl禾Π AAV6表示)在另一方面，本發(fā)明提供進(jìn)化支Α，其特征在于含有前文公開(kāi)的AAVl和AAV6。 參見(jiàn)，例如2000年5月18日的國(guó)際
發(fā)明者G·高, J·M·威爾森, L·H·范登伯格, M·R·阿爾維拉 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會(huì)