專利名稱：兔出血癥病毒rt-pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種兔出血癥病毒的分子檢測方法，具體地說，涉及一種兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，其屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbithemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一種高度接觸烈性傳染病,傳播快,發(fā)病急,發(fā)病率和致死率都很高，以呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、實質(zhì)臟器水腫、淤血及出血性變化為特征，是兔的一種毀滅性傳染病，目前所有已測的兔的品種都表現(xiàn)出易感性。自然條件下，RHDV主要侵害成年兔，2月齡以下的仔兔自然感染時一般不發(fā)病。該病對養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，也嚴(yán)重威脅瀕臨滅絕的野兔品種。由此，RHDV引起了國內(nèi)外學(xué)者高度重視，從形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等各個方面系統(tǒng)的研究該病毒。RHDV在國際病毒分類委員會(ICTV)2000年最新的第七次報告中被列入新成立的杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)。RHDV為單股正鏈RNA病毒，其基因組由7437個核苷酸組成，分子量為2.4X 106-2.6X 106，5’端沒有帽狀結(jié)構(gòu)，而是共價結(jié)合與感染相關(guān)的Vpg (virion protein, genome linked)蛋白，3’末端具有一個短的PolyA尾。第l_9nt為5’非編碼區(qū)，最后59nt為3’非編碼區(qū)，含有兩個開放閱讀框架(ORF)，第10-7044nt為ORFl編碼的一個含有2344個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白經(jīng)蛋白水解酶加工成主要衣殼蛋白VP60以及包括RNA聚合酶和蛋白酶在內(nèi)的三個非結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)分析，該病毒的RNA基因組結(jié)構(gòu)與同科的貓嵌杯樣病毒不一樣,僅含有兩個開放閱讀框。

RHDV的免疫原性蛋白、衣殼蛋白VP60，在誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)中起重要作用，是病毒免疫保護(hù)性抗原。VP60基因全長1740bp，在病毒誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)中起主要作用，其核苷酸極端保守。RHDV是一種急性、高度致死性RNA病毒，在兔體內(nèi)停留時間短，沒有足夠的時間讓病毒發(fā)生有利于進(jìn)化的變異，因此幾十年中RHDV仍然能保持高序列同源性。目前，已有將分子生物學(xué)應(yīng)用到RHDV診斷中的研究，其主要包括玻片凝集試驗(SHA)檢測RHDV、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測RHDV、RT-PCR檢測RHDV等，但上述這些方法存在敏感性低、可重復(fù)性差、結(jié)果判定易受多種因素影響、處理耗時多等問題。突光定量 PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction),又稱實時定量(real-time quantitative)PCR。這種技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的高度靈敏的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR體系中引入了熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，使PCR擴增和終產(chǎn)物檢測全處在封閉的條件下進(jìn)行，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析方法，具有實時監(jiān)測、無污染、快速、靈敏、精確、特異等特點，極大的克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)普遍存在的假陽性及不能定量等問題，其最主要的優(yōu)勢是能對待測樣本起始PCR反應(yīng)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，擴大了 PCR的應(yīng)用范圍，使得PCR技術(shù)更廣泛的應(yīng)用于臨床，在監(jiān)測患者病情、預(yù)后、指導(dǎo)用藥等方面。目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。TaqMan探針技術(shù)是由美國Perkin Elmer (PE)公司研發(fā)的一種實時PCR技術(shù),它在一條20bp左右的寡核苷酸探針的5’端標(biāo)記突光報告基團(Reporter, R), 3’端標(biāo)記突光淬滅基團(Quencher，Q)，其序列與兩引物包含序列內(nèi)的一段DNA模板完全互補。當(dāng)這條探針保持完整時，Q和R基團由于距離很近(7-10nm)，Q基團將淬滅R基團發(fā)出的熒光信號，即報告基團發(fā)出的熒光能被淬滅基團所吸收。PCR反應(yīng)后，隨著鏈的延伸，Taq酶沿著DNA模板移動到熒光標(biāo)記探針結(jié)合位置，發(fā)揮其5’ -3’外切核酸酶活性，將熒光探針切斷，Q基團由于距離較遠(yuǎn)而失去對報告熒光的淬滅作用，R基團的熒光信號得以釋放而被檢測儀所捕獲。如果在PCR過程中，探針序列與模板序列不能互補，探針仍然是游離的，未雜交的探針仍然保持完整，熒光信號也就不能被檢測到，從而保證了擴增的特異性。常用的熒光報告基團有 FAM、JOE、HEX、Texas-Red 等，淬滅基團有 TAMRA、Eclipse 等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物和TaqMan探針。本發(fā)明的另一目的在于提供用于兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的用于兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1和2所示；本發(fā)明的用于兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測的TaqMan探針(熒光探針VP60p)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，本發(fā)明所述的TaqMan探針，其5’端的熒光基團為FAM，3’端的熒光猝滅基團為TAMRA0本發(fā)明根據(jù)GenBank (GenBank注冊號:FJ794180) RHDV VP60衣殼蛋白基因序列設(shè)計篩選出PCR引物，并確認(rèn)了各引物的特異性。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。該引物對的擴增片段長度為96bp。本發(fā)明還提供含有如權(quán)利要求1所述的引物和TaqMan探針的兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。所述試劑盒還包括擴增緩沖液、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和dNTPs。本發(fā)明還提供兔出血癥病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，其采用一步法RT-PCR方法進(jìn)行檢測，包括如下步驟:I)提取待測樣品的RNA ；

2)以步驟I)提取的RNA作為模板，用上述核苷酸序列如SEQ ID N0.1和2所示的引物和TaqMan探針VP60p，采用一步法RT-PCR方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測，根據(jù)熒光定量擴增曲線判定樣品檢測結(jié)果。其中，步驟I)中所述樣品為兔的肝組織、血液、分泌物或排泄物，所述樣品還可以是用福爾馬林固定或石蠟包埋的兔的肝組織。
步驟2)中的RT-PCR反應(yīng)體系為:每25 μ L反應(yīng)液中含有:2 X Quant —步法熒光定量RT-PCR試劑盒12.5 μ L、2.5U/μ L Hotmaster DNA 聚合酶 I μ L、4U/μ L Quant 反轉(zhuǎn)錄酶 0.35 μ L、10 μ mol/L 的上下游引物各0.5μ L、10ymol/L 的探針0.5μ L、RNA模板 I μ L，不含RNA酶的水(RNase-free ddH20)補足至25 μ L0RT-PCR 反應(yīng)條件為:50 °C >30min, 92 °C >3min, 92 °C > IOs, 56 °C >20s, 68 °C >20s, 40
個循環(huán)。為了便于分析檢測結(jié)果，可在RT-PCR擴增步驟中使用陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照，所述陰性對照是以DEPC處理的水代替RNA模板；所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品按如下步驟得到:I)提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQ ID N0.4和5所示的引物，進(jìn)行一步法RT-PCR擴增，得到目的片段；然后將該目的片段克隆到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5ci，提取白斑陽性質(zhì)粒；2)對提取的質(zhì)粒進(jìn)行Sac I酶切，使質(zhì)粒DNA線性化，然后在T7RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄RNA，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。上述PCR引物是根據(jù)GenBank (GenBank注冊號:FJ794180) RHDV VP60衣殼蛋白基因序列設(shè)計篩選、經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司合成得到的，使用BLAST檢索，確認(rèn)各引物的特異性。該引物對的擴增出的目的片段長度為240bp，位于RHDV的VP60基因內(nèi)部，該序列為保守序列，240bp的片段與預(yù)期大小一致，且包含上述用核苷酸序列如SEQ ID N0.1和2所示的引物擴增出的96bp的片段。此外，將切膠回收的目的片段與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑搖菌后送公司測序，經(jīng)測序表明VP60重組質(zhì)粒序列正確，為陽性重組`質(zhì)粒，可用于后續(xù)試驗。本發(fā)明中檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為:對樣品進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測時，出現(xiàn)擴增曲線，即表明樣品感染了兔出血癥病毒；沒有擴增曲線的擴增，則說明沒有感染該病毒。本發(fā)明的優(yōu)點在于:1、采用一步法RT-PCR檢測技術(shù)，在一管內(nèi)連續(xù)完成反轉(zhuǎn)錄和定量PCR擴增，完全閉管擴增和檢測，提高臨床診斷依據(jù)的可靠性，減少多重操作污染的可能性，易于操作，減少加樣過程中的體積損耗，保證結(jié)果的可信性，反轉(zhuǎn)錄得到的所有cDNA樣品都用來擴增，靈敏度更高。2、在熒光PCR儀上進(jìn)行擴增和檢測，無需電泳或是其他PCR后處理，有效的防范了PCR擴增產(chǎn)物的污染，避免假陽性結(jié)果，避免了溴化乙錠或同位素對人體及環(huán)境的危害。只需2小時即可完成PCR過程，有利于提高報告數(shù)據(jù)的速度，無人為判斷，儀器自動收集和分析數(shù)據(jù)。3、本發(fā)明的RHDV TaqMan熒光定量RT-PCR方法對VP60具有高特異性；且操作簡單、快速，穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，結(jié)果一目了然；實現(xiàn)了實時檢測，能夠直觀的了解整個PCR過程的動態(tài)變化。4、本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測方法除能從病毒含量最高的肝組織中檢測到RHDV,還能從感染RHDV致死兔的其它組織中擴增出特異性片段，可用于檢測RHDV在兔體內(nèi)各組織中的動態(tài)分布。該方法還可以用于檢測活兔的血液、分泌物、排泄物，以及福爾馬林固定或石蠟包埋樣品等是否含有病RHDV ;國外有報道蒼蠅、跳蚤、蚊子等可能起著機械傳播RHDV的作用，故該方法還可檢測蒼蠅、跳蚤、蚊子等媒介體內(nèi)是否含有RHDV。本發(fā)明建立的檢測RHDV的熒光定量RT-PCR方法為兔出血癥的早期確診和分子流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明目的片段240bp序列PCR擴增電泳結(jié)果；其中，M:標(biāo)記、I:目的產(chǎn)物；2:陰性對照。圖2為本發(fā)明目的片段347bp序列PCR擴增電泳結(jié)果；其中，M:標(biāo)記、1:目的產(chǎn)物；2:陰性對照。圖3為本發(fā)明不同質(zhì)?？截?數(shù)的熒光檢測結(jié)果。圖4為本發(fā)明的熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為本發(fā)明的兔肝組織樣品的熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果。圖6為本發(fā)明的對活兔血液樣品的熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果。圖7為不同引物用量時的熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果圖8為本發(fā)明的熒光定量RT-PCR特異性檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備1)RHDV病毒提取RNA，用核苷酸序列如SEQ ID N0.4和5所示的引物，進(jìn)行一步法RT-PCR擴增，得到240bp目的片段(如圖1所示)；PCR反應(yīng)體系為:每25 μ L反應(yīng)液中含有:10XRT-PCR緩沖液2.5 μ L、超純dNTP混合物(各IOmM)I μ L、5XRT-PCR 增強劑 5μ L、40U/y L RNA 酶抑制劑 0.25μ L,2.5U/μ L Hotmaster DNA 聚合酶1.25 μ L、Quant反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μ L、IOmmoI/L的上下游引物各0.5 μ URNA模板I μ L、RNase-free ddH20 補至 25 μ L ；PCR 反應(yīng)條件為:50°C、30min，94°C、2min，94°C、lmin，51.7°C、lmin，65°C、lmin，擴增35個循環(huán)，65 °C、IOmin ；2)然后將該目的片段克隆到PGEM-T Easy載體(購自Promega公司)上，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌DH5 α (購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后測序，測序結(jié)果表明為目標(biāo)序列。將鑒定正確的基因片段抽提質(zhì)粒DNA ；3)對提取的質(zhì)粒進(jìn)行Sac I酶切，使質(zhì)粒DNA線性化，然后在T7RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄RNA ；Sac I序列為5’ -GAGCTC-3’，反應(yīng)體系為:RElO X緩沖液2 μ L、乙?；腂SA0.2μ L、質(zhì)粒 DNA2.3μ LUOU/μ L Sac I 0.5 μ L、ddH20 補加至 20 μ L ;反應(yīng)條件為:37°C溫度下孵育lh。T7 啟動子序列為 5’ -TAATACGACTCACTATA-3’ ；反應(yīng)體系為:Transcription0ptimized5X Buffer (5 倍優(yōu)化轉(zhuǎn)錄緩沖液)4 μ L ；DTT2 μ L、Recombinant RNasill Ribonuclease Inhibitor (RNasin 重組核糖核酸酶抑制劑)0.5 μ L ;rATP、rGTP、rUTP 和rCTP混合物4 μ L ;線性化DNA8 μ L ； 19U/ μ L T7RNA聚合酶I μ L ；DEPC水補加至20 μ L ；反應(yīng)條件為:37°C溫度下孵育lh，然后加入RQ10.5 μ L，37°C溫度下孵育15min ；4)經(jīng)RNA Marker檢測上述體外轉(zhuǎn)錄RNA長度為347bp(如圖2所示)，用紫外分光光度計測得上述體外轉(zhuǎn)錄RNA濃度為908.1ng/μ L，計算出拷貝數(shù)；稀釋其拷貝數(shù)為1.0X IO12拷貝/μ L，然后根據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒10倍倍比稀釋成含IO6-1O1拷貝/μ L，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。RNA純度=A26Q/A28Q (1.8-2.0之間，小于1.8提示有殘余蛋白質(zhì)，大于2.0提示有RNA降解)。實施例2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制根據(jù)GenBank (GenBank注冊號:FJ794180) RHDV VP60衣殼蛋白基因序列設(shè)計篩選出PCR引物，并確認(rèn)了各引物的特異性，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和2。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。該引物對的擴增片段長度為96bp。以實施例1得到的陽性標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，用核苷酸序列如SEQ ID N0.1和2所示的引物和熒光探針VP60p，采用一步法RT-PCR方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖3所示。上述RT-PCR中反應(yīng)體系為:每25 μ L 反應(yīng)液中含有:2XQuant One Step Probe qRT-PCR Master Mix (Quant一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(探針法))12.5 μ L、2.5U/ μ LHotmaster DNA聚合酶I μ L、4U/y L Quant反轉(zhuǎn)錄酶0.35 μ L、10 μ mol/L的上下游引物各0.5 μ LUO μ mol/L的探針各
0.5 μ L、RNA模板I μ L，不含RNA酶的水補足至25L。RT-PCR 反應(yīng)條件為:50 0C >30min, 92 °C >3min, 92 °C > IOs, 56 °C >20s, 68 °C >20s,擴 增40個循環(huán)。上述RT-PCR中反應(yīng)模板濃度依次為KTlO1拷貝/ μ L，反應(yīng)的靈敏度為IO1拷貝/y L，在IO6IO1拷貝/ μ L濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系。結(jié)果如圖4所示。實施例3對兔肝組織樣品的檢測1、提取兔肝組織樣品的RNA取RHDV分離株(購自江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院)100倍稀釋液0.2mL，肌肉注射3月齡未免疫兔。3日后部分兔出現(xiàn)死亡,取10只死亡兔的肝臟組織,分別使用RNApr印pure動物組織總RNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)提取兔肝組織樣品。(I)將200mg肝組織加300 μ L裂解液RL，徹底研磨成勻衆(zhòng)，加入590 μ LRNase-free ddH20 和 10 μ L 蛋白酶 K，混勻后 56°C處理 IOmin。(2)將所得液體12000rpm離心5min,取上清。(3)上清液緩慢加入200μ L無水乙醇，混勻，得到溶液和沉淀一起放入吸附柱中，12000rpm離心Imin，棄去廢液，將吸附柱放回收集管中。(4)向吸附柱中加入350 μ L去蛋白液RWl，12000rpm離心Imin，棄廢液，將吸附柱
放回收集管中。(5)吸附柱中加入80 μ L的DNase I工作液，室溫放置15min。(6)吸附柱中加入350 μ L去蛋白液RW1，12000rpm離心lmin，棄廢液，將吸附柱放
回收集管中。(7)向吸附柱中加入50(^1^票洗液1^，室溫靜置21^11，12000印111離心lmin，棄廢
液，將吸附柱放回收集管中，并重復(fù)此步驟一次。
(8)12000rpm離心2min,棄廢液，吸附柱室溫放置5min,轉(zhuǎn)入新的RNase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加40 μ L的RNase-free ddH20,室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到RNA溶液。2、以上述RNA作為模板，以DEPC處理的水代替RNA模板作為陰性對照，采用一步法RT-PCR方法進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例2相同，根據(jù)熒光定量擴增曲線判定樣品檢測結(jié)果。結(jié)果如圖5所示。來自10只死亡兔的肝組織樣品的RNA都呈現(xiàn)出擴增曲線，檢出率為100%，說明該熒光定量RT-PCR方法可以準(zhǔn)確檢測兔出血癥病毒。實施例4對活兔血液樣品的檢測1、提取兔血液樣品的RNA取RHDV分離株100倍稀釋液0.2mL，肌肉注射3月齡未免疫兔。3日后部分兔出現(xiàn)死亡，對未死亡的12只兔采 血,使用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)分別對12份兔血液提取血液樣品。(I)將200 μ L血液樣品加1000 μ L的I X紅細(xì)胞裂解液，冰上孵育20min，在孵育過程中，渦旋振蕩混勻2次。(2)將所得液體4°C 2IOOrpm離心IOmin,留沉淀。(3)向白細(xì)胞沉淀中，加入IX紅細(xì)胞裂解液，重懸細(xì)胞。(4)所得液體4°C 2IOOrpm離心lOmin，留沉淀。(5)向白細(xì)胞沉淀中，加入500 μ L裂解液RL，混勻。(6)將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱中，12000rpm離心2min，棄去過濾柱，收集濾液。(7)向濾液中加入500 μ L的70%乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱中，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。(8)向吸附柱中加入35(^1^去蛋白液，12000印111離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。(9)向吸附柱中央加入80μ L的DNase I，室溫放置15min。(10)向吸附柱中央加入350μ L去蛋白液，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。(11)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心lmin，倒掉收
集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)此步驟一次。(12) 12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫放置5min，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。(13)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個新的RNase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴力口 40 μ L 的 RNase-free ddH20,室溫放置 2min，12000rpm 離心 2min，得到 RNA 溶液。2、以上述RNA作為模板，以DEPC處理的水代替RNA模板作為陰性對照，采用一步法RT-PCR方法進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例2相同，根據(jù)熒光定量擴增曲線判定樣品檢測結(jié)果。結(jié)果如圖6所示。血液樣品的RNA都呈現(xiàn)出擴增曲線，檢出率為100%，說明該熒光定量RT-PCR方法可以準(zhǔn)確檢測兔出血癥病毒。試驗例I RT-PCR中弓I物用量的優(yōu)化
引物的濃度是影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，若濃度太低，會使反應(yīng)不完全；若引物太多，則發(fā)生錯配及產(chǎn)生非特異產(chǎn)物的可能性會大大增加，還會使背景熒光值增加。非特異性產(chǎn)物和引物二聚體也多與靶序列競爭DNA聚合酶、dNTP底物，從而使靶序列的擴增量降低。本試驗例按下述方法對引物終濃度(引物用量)進(jìn)行優(yōu)化。按實施例1方法制得濃度為908.1ng/ μ I的體外轉(zhuǎn)錄RNA，計算得到4.6X1012copy，然后倍比稀釋。取IO4Copy的體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，用核苷酸序列如SEQ ID N0.1和2所示的引物和熒光探針VP60p，采用一步法-熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測。上述RT-PCR中反應(yīng)體系為:將核苷酸序列如SEQ ID N0.1和2所示的引物(10 μ mol/L)按體積比1:1混合，依次向反應(yīng)體系中加入0.5μ L、ly L、l.5μ L、2y L、4y L ;其余試劑及用量與實施例2中的反應(yīng)體系相同，用實施例2的反應(yīng)條件進(jìn)行一步RT-PCR檢測，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)最大熒光信號強度和最小Ct值綜合考慮，確定最佳引物用量為Ι.Ομ 1，即引物的終濃度分別為0.4 μ mol/L。試驗例2特異性考核分別用4種菌液作為模板，在實施例2相同的條件下進(jìn)行一步法RT-PCR檢測，每次擴增設(shè)陰陽性對照，鑒定探針法熒光定量方法的特異性，結(jié)果如圖8所示。這4份菌液分別為兔水皰性口炎病毒細(xì)胞毒、輪狀病毒細(xì)胞毒、仙臺病毒、RHDV。(兔水皰性口炎病毒細(xì)胞毒、輪狀病毒細(xì)胞毒、仙臺病毒均購自江蘇省農(nóng)科院)
結(jié)果表明:RHDV有擴增，呈陽性，而兔水皰性口炎病毒細(xì)胞毒、輪狀病毒細(xì)胞毒、仙臺病毒沒有擴增，均呈陰性，表明特異性很好，可以用于兔出血癥病毒的檢測。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方案及試驗例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.用于兔出血癥病毒RT-PCR檢測的引物，其核苷酸序列如SEQID N0.4和5所示。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的檢測試劑盒。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為: 每25 μ L反應(yīng)液中含有:10 X RT-PCR緩沖液2.5 μ L、超純dNTP混合物I μ L，各10mM、5 X RT-PCR 增強劑 5 μ L、40U/μ L RNA 酶抑制劑 0.25 μ L、2.5U/μ L Hotmaster DNA 聚合酶1.25 μ L、Quant反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μ L、IOmmoI/L的上下游引物各0.5 μ L、RNA模板I μ L、RNase-free ddH20 補至 25 μ L。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:50°C、30min;94°C、2min, 94°C、lmin, 51.7°C、lmin, 65°C、lmin,擴增 35 個循環(huán)；65°C、IOmin0
5.權(quán)利要求1所述引物在制備用于檢測兔出血癥病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)品中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQID N0.4和5所示的引物，進(jìn)行一步法RT-PCR擴增，得到目的片段；然后將該目的片段克隆到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5 α，提取白斑陽性質(zhì)粒； 2)對提取的質(zhì)粒進(jìn)行SacI酶切，使質(zhì)粒DNA線性化，然后在T7RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄RNA，得到陽性標(biāo)準(zhǔn)品。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)酶切的反應(yīng)體系為=RElOX緩沖液2 μ L、乙?；?BSA0.2 μ L、質(zhì)粒 DNA2.3 μ L、IOU/ μ L Sac I 0.5 μ L、ddH20 補加至 20 μ L。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)酶切的反應(yīng)條件為:37°C溫度下孵育Iho
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，體外轉(zhuǎn)錄RNA的反應(yīng)體系為:5倍優(yōu)化轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μ L ；DTT2 μ L、重組核糖核酸酶抑制劑0.5 μ L ;rATP、rGTP、rUTP和rCTP混合物4 μ L ;線性化 DNA8 μ L ； 19U/ μ L T7RNA 聚合酶 I μ L ；DEPC 水補加至 20 μ L。
10.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，體外轉(zhuǎn)錄RNA的反應(yīng)條件為:37 °C溫度下孵育Ih,然后加入RQl 0.5 μ L，37°C溫度下孵育15min。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于兔出血癥病毒RT-PCR檢測的引物。本發(fā)明還提供了含有上述引物的試劑盒，以及使用上述引物一步法RT-PCR檢測兔出血癥病毒的方法。本發(fā)明方法準(zhǔn)確、可靠，靈敏度和特異性高，具有較好的臨床應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/11GK103146842SQ20131005227
公開日2013年6月12日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月15日
發(fā)明者賈廣樂, 蘇國清, 林祥梅, 武昱孜, 孫衛(wèi)東 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院