專利名稱：兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重pcr快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兔病毒和病菌的檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重 PCR快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
兔病毒性出血癥(俗稱兔瘟，Rabbit hemorrhagic disease，簡(jiǎn)稱RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，簡(jiǎn)稱RHDV)引起的一種烈性傳染病，其傳染性強(qiáng)、病程短，發(fā)病率和死亡率都很高，在急性爆發(fā)的兔場(chǎng)，發(fā)病率和死亡率可達(dá)100 %。
EKff(Rabbit pasteurellosis) ^￠^#: ^ ^ ‘ (Pasteurellamultocida) 引起的一種急性傳染病，常引起大批兔發(fā)病和死亡。這兩種疫病給養(yǎng)兔業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展。由于兔病毒性出血癥和兔巴氏桿菌病臨床癥狀和病理變化相似，常規(guī)的診斷方法很難快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行診斷，且容易造成誤診耽誤治療。1985年K. Mullis等發(fā)明的PCR技術(shù)，掀起了一場(chǎng)生物學(xué)革命，如今PCR技術(shù)已成為診斷應(yīng)用的一種重要科學(xué)手段。多重PCROmiltiplex-PCR，簡(jiǎn)稱MPCR)，是指同一反應(yīng)管 (或反應(yīng)體系)中包含兩對(duì)或兩對(duì)以上引物，在同一時(shí)間進(jìn)行多個(gè)核酸序列擴(kuò)增的PCR反應(yīng)。與普通PCR相比，MPCR具有省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、高效的優(yōu)點(diǎn)，還可減少交叉污染。經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、特異、敏感、穩(wěn)定的兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法。為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重 PCR快速檢測(cè)方法，從待檢兔的肺臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)等組織中提取總RNA，并用兔出血癥病毒靶基因特異性下游引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA，同時(shí)從待檢兔病變組織中分離培養(yǎng)疑似兔巴氏桿菌，從培養(yǎng)液中提取DNA模板，然后將獲得的CDNA和DNA模板，以及針對(duì)兔出血癥病毒VP60基因和兔巴氏桿菌kmt基因設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)特異性引物加入到同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，最后根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定；其中， PCR反應(yīng)的引物序列和擴(kuò)增序列分別為引物 VP60P1 序列 5' -CTCCTGGCAGCATACTTTAC-3 ‘弓丨物 VP60P 2 序列 5 ‘ -CTCTTCGGTGGTCAATGT-3 ‘VP60擴(kuò)增序列為序列表SEQ. ID. No. 3的堿基序列，引物 kmt Pl 序列 5' -GATGTCGGCATGAATTTCTC-3‘引物 kmt P2 序列 5 ‘ -ATTGACTGGCAGGATGTGAT-3 ‘kmt擴(kuò)增序列為序列表SEQ. ID. No. 6的堿基序列。PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序分別為
反應(yīng)體系Mg2+離子濃度2. Om mol/L ；dNTP濃度0. 8mmol/L ；Taq DNA聚合酶濃度 0. 08U/L ；引物濃度 0. 4 μ mol/L ；擴(kuò)增程序:94°C4min -MV 30s，57°C 40s, 72°C lmin，28 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0本發(fā)明根據(jù)兔出血癥病毒VP60基因和兔巴氏桿菌kmt基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)可擴(kuò)增 VP60基因和kmt基因的特異性引物，建立了兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法。電泳圖譜中出現(xiàn)6^bp的特異性條帶為兔出血癥病毒陽性；出現(xiàn)2Mbp的特異性條帶為兔巴氏桿菌陽性。研究表明，本發(fā)明可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)兔出血癥病毒和兔巴氏桿菌進(jìn)行檢測(cè)，具有快速、特異、敏感、穩(wěn)定的特點(diǎn)，克服了常規(guī)診斷方法的不足，可用于兔病毒性出血癥和兔巴氏桿菌病的快速鑒別診斷，對(duì)有效防控這兩種疫病具有重要意義。


圖1是本發(fā)明兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)的 PCR電泳圖，圖中M是2000bp Marker，1是兔巴氏桿菌，2是兔出血癥病毒，3是兔巴氏桿菌-兔出血癥病毒，4是兔大腸桿菌，5是兔葡萄球菌，6是兔魏氏梭菌，7是兔鏈球菌。圖2是本發(fā)明兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)的 PCR電泳圖，圖中M是2000bp Marker，1至6兔巴氏桿菌DNA濃度分別為620ng/μ l、62ng/ μ 1、6. 2ng/ μ 1,0. 62ng/ μ 1,0. 062ng/ μ 1,0. 0062ng/ μ 1，1 至 6 兔出血癥病毒 CDNA 濃度分別為 700ng/μ 1、70ng/μ 1、7ng/μ 1,0. 7ng/μ 1,0. 07ng/μ 1,0. 007ng/μ 1。圖3是本發(fā)明兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)的 PCR電泳圖，圖中M是2000bp Marker, 1至3是三次平行試驗(yàn)結(jié)果。圖4是實(shí)施例1的臨床樣品一的檢測(cè)結(jié)果圖，圖中M是2000bp Marker, 1是陽性對(duì)照，2是陰性對(duì)照，3是臨床樣品一。圖5是實(shí)施例1的臨床樣品二至六的檢測(cè)結(jié)果圖，圖中M是2000bp Marker, 1是陽性對(duì)照，2是陰性對(duì)照，3至7是臨床樣品二至六。
具體實(shí)施例方式兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法的研究1、引物設(shè)計(jì)針對(duì)兔出血癥病毒VP60基因和兔巴氏桿菌kmt基因的保守區(qū)域，結(jié)合DNAstar、 oligo6. 69、Primer Express 2. 0及NCBI-blast生物學(xué)軟件的綜合分析結(jié)果，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，引物由北京博邁德科技有限公司合成，引物序列參數(shù)如表1 表1特異性引物參數(shù)表
權(quán)利要求
1.一種兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于從待檢兔的肺臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)等組織中提取總RNA，并用兔出血癥病毒靶基因特異性下游引物將總 RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA，同時(shí)從待檢兔病變組織中分離培養(yǎng)疑似兔巴氏桿菌，從培養(yǎng)液中提取 DNA模板，然后將獲得的CDNA和DNA模板，以及針對(duì)兔出血癥病毒VP60基因和兔巴氏桿菌 kmt基因設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)特異性引物加入到同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，最后根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定；其中，PCR反應(yīng)的引物序列和擴(kuò)增序列分別為引物 VP60 P1 序列 5 ‘ -CTCCTGGCAGCATACTTTAC-3 ‘ 弓丨物 VP60 P2 序列 5 ‘ -CTCTTCGGTGGTCAATGT-3 ‘ VP60擴(kuò)增序列為序列表SEQ. ID. No. 3的堿基序列， 引物 kmt P1 序列 5 ‘ -GATGTCGGCATGAATTTCTC-3 ‘ 弓丨物 kmt P2 序列 5 ‘ -ATTGACTGGCAGGATGTGAT-3 ‘ kmt擴(kuò)增序列為序列表SEQ. ID. No. 6的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序分別為反應(yīng)體系Mg2+離子濃度2. Om mol/L ;dNTP濃度0. 8mmol/L ;Taq DNA聚合酶濃度 0. 08U/L ；引物濃度 0. 4 μ mol/L ；擴(kuò)增程序:94°C 4min ；94°C 30s, 57°C 40s, 72°C lminJ8 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兔出血癥病毒、兔巴氏桿菌雙重PCR快速檢測(cè)方法，該方法根據(jù)兔出血癥病毒VP60基因和兔巴氏桿菌kmt基因序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)可擴(kuò)增VP60基因和kmt基因的特異性引物。電泳圖譜中出現(xiàn)645bp的特異性條帶為兔出血癥病毒陽性；出現(xiàn)215bp的特異性條帶為兔巴氏桿菌陽性。研究表明，本發(fā)明可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)兔出血癥病毒和兔巴氏桿菌進(jìn)行檢測(cè)，具有快速、特異、敏感、穩(wěn)定的特點(diǎn)，克服了常規(guī)診斷方法的不足，可用于兔病毒性出血癥和兔巴氏桿菌病的快速鑒別診斷，對(duì)有效防控這兩種疫病具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102251058SQ20111019353
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者劉梅, 吳健敏, 白安斌, 覃紹敏, 黃紅梅 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所