專利名稱：兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組桿狀病毒及疫苗的制作方法
專利說(shuō)明兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組桿狀病毒及疫苗 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白重組桿狀病毒及基因工程疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
兔病毒性出血癥，又稱兔瘟，是由兔病毒性出血癥病毒(RHDV)引起的一種以急性、高度傳染性、大面積死亡為特征的兔傳染病，感染兔通常48～72h死亡，主要特征為傳染性極強(qiáng)、呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、臟器水腫、淤血和出血等變化，給全世界養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際獸醫(yī)局將該病列為B類傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部96號(hào)令頒布為二類疫病。RHD出現(xiàn)比較突然且流行速度極快，現(xiàn)有研究結(jié)果表明世界范圍內(nèi)的所有RHDV分離株均為同一血清型，無(wú)論是遺傳特性還是抗原性都很穩(wěn)定。目前用兔病毒性出血癥組織滅活疫苗免疫是預(yù)防該病的主要措施，疫苗的制備過(guò)程中必須以RHDV感染致死的兔內(nèi)臟組織為原料。近年來(lái)，隨著兔產(chǎn)品等行業(yè)的興起以及其他動(dòng)物疫苗等對(duì)家兔的需求的增加，市場(chǎng)對(duì)兔病毒性出血癥疫苗的需求量增加了許多，但是用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應(yīng)量卻很不穩(wěn)定，造成傳統(tǒng)的組織滅活苗的成本不斷增加，加之組織滅活苗存在散播強(qiáng)毒的潛在危險(xiǎn)等種種缺點(diǎn)，而RHDV至今沒(méi)有在細(xì)胞上傳代成功，嚴(yán)重制約了更加安全、穩(wěn)定的兔病毒性出血癥疫苗的研制與生產(chǎn)，使人們對(duì)兔病毒性出血癥疫苗的研究轉(zhuǎn)向了既能起到保護(hù)作用，又能解決生物安全問(wèn)題的基因工程疫苗的研制。
近年來(lái)的研究認(rèn)為，RHDV屬杯狀病毒，含有一條單股正鏈RNA，由7437個(gè)核苷酸組成，與一般的杯狀病毒不同，RHDV只有2個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)，并由ORFI的3′端部分序列編碼RHDV衣殼蛋白VP60，其基因片段長(zhǎng)度為1740bp，共編碼580個(gè)氨基酸，VP60是RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，與誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)直接相關(guān)。
桿狀病毒系統(tǒng)具有類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾功能，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白。由于桿狀病毒只能感染非脊椎動(dòng)物，且其感染的宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞也不能寄生于兔體內(nèi)，所以兔體內(nèi)沒(méi)有針對(duì)桿狀病毒蛋白或昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白的抗體，因此，利用該系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白可作為疫苗抗原蛋白免疫家兔從而起到預(yù)防兔病毒性出血癥的作用。


發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建桿狀病毒重組載體，提供一種免疫效果好、工藝簡(jiǎn)便的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因工程疫苗及其制備方法。
技術(shù)方案 本發(fā)明是通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60全基因，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建桿狀病毒重組載體，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，使VP60基因獲得表達(dá)，然后以重組桿狀病毒表達(dá)的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60作為抗原，加上相應(yīng)的佐劑制成預(yù)防兔病毒性出血癥的基因工程疫苗。
一、表達(dá)兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60的重組桿狀病毒的獲得 1)兔病毒性出血癥病毒總RNA的提取 用DEPC處理過(guò)的水按體積比1∶10加入發(fā)生兔病毒性出血癥的兔肝臟組織中，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過(guò)的1.5mL EP管中，于-20℃反復(fù)凍融3次，在高速冷凍離心機(jī)上，以7200r/min，離心20min，取上清200μL，加入Trizol 800μL，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿210μL，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4℃，10000r/min離心15min，取上層水相750μL，加入0.5mL異丙醇，混勻，-20℃放置15min，4℃10000r/min離心10min，去上清，緩緩加入75％乙醇1mL洗滌，4℃8000r/min離心5min，去上清，室溫干燥20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解； 2)設(shè)計(jì)合成以下引物 P15’-ATAGTCGACATGGAGGGCAAAG-3’ Sal I P25’-GCCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCA-3’Xho I 3)擴(kuò)增衣殼蛋白VP60基因 反轉(zhuǎn)錄體系為10×Buffer 2μl、10mM dNTPs 2μl、下游引物1μl、RNA酶抑制劑0.5μl、RNA模板12μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，DEPC水2μl，總體積為20μl，瞬間離心混勻，65℃反應(yīng)15min，42℃孵育1h，95℃5min，-20℃保存?zhèn)溆茫? PCR反應(yīng)體系為10×Reaction buffer 2.5μl、25mM MgCl2 1.5μl、2.5mM dNTPS0.5μl、50mM P1 0.5μl、50mM P2 0.5μl、模板RNA 4.0μl、ddH2O 15μl、EX TaqTMpolymerase 0.5μl，總體積25μl，瞬間離心混勻，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃變性3min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，結(jié)束反應(yīng)；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得的衣殼蛋白VP60基因擴(kuò)增片斷大小為1740bp； 4)重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-VP60的構(gòu)建 將擴(kuò)增的VP60基因先克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1中，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1-VP60，然后將pFastBacTM1-VP60質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有三種抗生素、X-gal和IPTG的LB平板，37℃培養(yǎng)48h后，挑選白色菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，以此為模板，以通用pUCM13上游引物與特異性VP60下游引物進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為Bacmid-VP60； 5)轉(zhuǎn)染將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-VP60轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，經(jīng)鑒定純化獲得重組病毒，并凍存于4℃、-20℃和液氮中； 6)重組病毒的鑒定 (1)RT-PCR鑒定 收集感染重組病毒的細(xì)胞，以目的基因上下游引物進(jìn)行RT-PCR，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示電泳條帶為1740bp，與目的基因大小一致，說(shuō)明目的基因已經(jīng)隨病毒基因組整合入細(xì)胞中。
(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA) 將重組病毒接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，培養(yǎng)至發(fā)生病變時(shí)用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，重組感染的細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而對(duì)照組細(xì)胞無(wú)特異的熒光，說(shuō)明VP60蛋白得到表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)。
血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn) 重組病毒感染細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清均能凝集1％人“O”型紅細(xì)胞懸液。同時(shí)表達(dá)的VP60蛋白的血凝特性可被RHDV高免血清所抑制，表明表達(dá)的VP60蛋白具有與RHDV相似的血凝活性。重組病毒真核表達(dá)的病毒性出血癥病毒衣殼蛋白可用作兔病毒性出血癥的診斷抗原方面。
二、表達(dá)重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白的動(dòng)物免疫保護(hù)效果 測(cè)定重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白的HA效價(jià)，用滅菌生理鹽水稀釋至HA效價(jià)在26-28之間，按比例加入氫氧化鋁膠佐劑，按不同劑量分組免疫非免疫家兔，并設(shè)對(duì)照組，于免疫后第22天以HA效價(jià)大于10的RHDV強(qiáng)毒肝臟懸液1mL攻擊，觀察14天，并記錄結(jié)果，結(jié)果顯示，免疫HA效價(jià)26重組蛋白1毫升的家兔就能抵抗兔病毒性出血癥強(qiáng)毒的攻擊。
三、疫苗制備培養(yǎng)Sf9細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種相應(yīng)重組病毒，等細(xì)胞有病變后5天收毒，測(cè)血凝HA效價(jià)，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液PBS PH 7.2調(diào)整抗原溶液，以2‰甲醛溶液滅活后，按抗原鋁膠佐劑為9∶1比例加入佐劑，混勻，即為獲得的兔病毒性出血癥基因工程疫苗。
有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下本發(fā)明選取兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60全基因作為目的基因進(jìn)行表達(dá)，原因是此蛋白能誘導(dǎo)抗病毒性出血癥病毒感染免疫反應(yīng)，而且此蛋白是病毒性出血癥病毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性；真核表達(dá)系統(tǒng)具有類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾功能，使重組衣殼蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，試驗(yàn)的結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白具有與病毒性出血癥病毒相同的生物活性，同時(shí)真核表達(dá)載體系統(tǒng)是一種表達(dá)、遞呈外源抗原的有效系統(tǒng)，重組病毒可激發(fā)人和多種動(dòng)物特異性體液和細(xì)胞免疫；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)只能感染非脊椎動(dòng)物，且其感染的宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞也不能寄生于兔體內(nèi)。因此，利用此系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白制備成基因工程疫苗具有很好的生物安全性；表達(dá)的重組蛋白無(wú)需特殊處理純化就可用于疫苗配制，操作簡(jiǎn)便。
事實(shí)證明，本發(fā)明表達(dá)的重組蛋白具有良好的抗原性和與兔病毒性出血癥病毒相似的血凝活性，因此是很好的兔病毒性出血癥疫苗抗原。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，用重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白制成的疫苗免疫非免疫家兔，免疫后以RHD強(qiáng)毒攻擊，免疫家兔獲得100％的保護(hù)作用，說(shuō)明本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的免疫效力，在兔病毒性出血癥預(yù)防控制方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)具備良好的生物安全性。



圖1桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)RHDV VP60基因RT-PCR結(jié)果 1.RT-PCR產(chǎn)物；2.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL-2000) 圖2桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定 1.限制性內(nèi)切酶消化重組轉(zhuǎn)移載體(Xho I/Sal I)；2.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL-2000)；3.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL-15000) 圖3桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組Bacmid的PCR鑒定 1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL-15000)；2.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL-2000)；3，4.重組Bacmid PCR鑒定；5.Bacmid PCR鑒定 圖4桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中感染Bacmid-VP60的Sf9細(xì)胞間接免疫熒光結(jié)果
具體實(shí)施例方式 一、兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因的擴(kuò)增和T/A克隆 1、兔病毒性出血癥病毒(RHDV)總RNA的提取 用DEPC(diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯)處理過(guò)的水按體積比1∶10加入發(fā)生兔病毒性出血癥的兔肝臟組織中，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過(guò)的1.5mL EP管中，于-20℃反復(fù)凍融3次，在高速冷凍離心機(jī)上，以7200r/min，離心20min，取上清200μL，加入Trizol(TaKaRa公司)800μL，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿210μL，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4℃，10000r/min離心15min，取上層水相750μL，加入0.5mL異丙醇，混勻，-20℃放置15min，4℃10000r/min離心10min，去上清，緩緩加入75％乙醇1mL洗滌，4℃8000r/min離心5min，去上清，室溫干燥20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解。
2、設(shè)計(jì)合成引物 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的RHDV基因組序列VP60序列(AY523410)，利用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)合成引物 P15’-ATAGTCGACATGGAGGGCAAAG-3’ (Sal I) P25’-GCCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCA-3’(Xho I) 下劃線部分為酶切位點(diǎn) 3、擴(kuò)增衣殼蛋白VP60基因 反轉(zhuǎn)錄體系為10×Buffer 2μl、10mM dNTPs 2μl、下游引物1μl、RNA酶抑制劑0.5μl、RNA模板12μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，H2O(DEPC處理)2μl，總體積為20μl，瞬間離心混勻，65℃反應(yīng)15min，42℃孵育1h，95℃5min，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> PCR反應(yīng)體系為10×Reaction buffer 2.5μl、25mM MgCl2 1.5μl、2.5mM dNTPS0.5μl、50mM P1 0.5μl、50mM P2 0.5μl、模板RNA 4.0μl、ddH2O 15μl、EX TaqTMpolymerase 0.5μl，總體積25μl，瞬間離心混勻，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃變性3min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，結(jié)束反應(yīng)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得的衣殼蛋白VP60基因擴(kuò)增片斷大小為1740bp； 4、T/A克隆與鑒定 電泳后將目的片段切下，采用核酸凝膠回收試劑盒Gel Extraction Kit(TaKaRa公司)進(jìn)行純化PCR產(chǎn)物，然后按照pMD-19T-Vector試劑盒說(shuō)明，將目的片段克隆入pMD-19T-Vector(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)相應(yīng)限制性酶切及電泳鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMD-19T-VP60，陽(yáng)性克隆送至TaKaRa(大連市)進(jìn)行測(cè)序。
5、擴(kuò)增的VP60基因的序列比較與分析利用DNAstar 5.0序列分析軟件對(duì)VP60的測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的VP60基因進(jìn)行核苷酸序列的同源性分析。
二、重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-VP60的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xho I分別消化供體質(zhì)粒pFastBacTM1(購(gòu)自Invitrogen公司)和pMD-19T-VP60，回收目的片段，用T4DNA Ligase 4℃連接12h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽(yáng)性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1-VP60，將pFastBacTM1-VP60質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen公司)和，在LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)4h后，取100μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素、10μg/ml四環(huán)素以及100μg/ml X-gal和20μg/mL IPTG的LB平板，37℃培養(yǎng)48h后，挑選白色菌落，在同樣的含三種抗生素的LB平板上繼續(xù)接種傳代一次，獲得純培養(yǎng)，接種含有三種抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖(180r/min)培養(yǎng)24h，然后用提取高分子量的重組穿梭質(zhì)粒DNA的專用溶液I、II、III按下列步驟提取Bacmid質(zhì)粒(見(jiàn)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)，C版，附錄章，提取重組BacmidDNA節(jié)，第51-52頁(yè)，2002，tech_service@invitrogen.com)。以重組Bacmid DNA為模板，以通用pUCM13上游引物與特異性VP60下游引物進(jìn)行PCR鑒定。同時(shí)設(shè)立未插入外源基因片段的DHl0Bacmid質(zhì)粒對(duì)照組，以pUCM13上下游引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見(jiàn)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)。0.8％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為Bacmid-VP60。
三、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組病毒 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞和純化 以LipofectaminTM2000為共轉(zhuǎn)染試劑，按照說(shuō)明，將Bacmid-VP60轉(zhuǎn)染Sf9單層細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后每12h觀察一次，直到細(xì)胞病變明顯時(shí)，收集細(xì)胞及上清液，作為重組桿狀病毒原液-20℃保存。將含目的基因VP60的重組桿狀病毒命名為Bac-VP60。將第一代病毒液凍融兩次后以1％體積比接種Sf9細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen公司)傳代，得到第2代重組病毒。以第2代重組病毒為毒種進(jìn)行蝕斑純化。
2鑒定 (1)RT-PCR鑒定 收集第2代感染重組病毒的Sf9細(xì)胞，按照前文兔病毒性出血癥病毒(RHDV)總RNA提取方法提取細(xì)胞RNA，以目的基因上下游引物進(jìn)行RT-PCR，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示電泳條帶為1740bp，與目的基因大小一致，說(shuō)明目的基因已經(jīng)隨桿狀病毒基因組整合入Sf9細(xì)胞中。
(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 間接免疫熒光檢測(cè)(IFA) 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將純化的重組病毒接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)至發(fā)生病變時(shí)用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，Bacmid-VP60感染的Sf9細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性熒光，而B(niǎo)acmid感染Sf9對(duì)照細(xì)胞無(wú)特異的熒光，說(shuō)明VP60蛋白得到表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物存在于昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)。
血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn) 分別取感染重組病毒的細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清50μl于圓底大孔血凝板以生理鹽水作2×倍比稀釋后，加入等體積1％人“O”型紅細(xì)胞懸液，振蕩均勻后，置于4℃作用45分鐘，觀察結(jié)果(HA)，同時(shí)以其他重組桿狀病毒作為陰性對(duì)照，以RHD病兔肝臟1∶5勻漿上清作為陽(yáng)性對(duì)照。另外，于圓底大孔血凝板加入50μL RHDV血清，然后以生理鹽水作2×倍比稀釋后，加入4個(gè)血凝單位的表達(dá)蛋白于每孔，將血凝板置37℃作用30分鐘，每孔加1％人“O”型紅細(xì)胞懸液50μl，立即搖勻，置4℃作用45分鐘，觀察結(jié)果(HI)。結(jié)果顯示，重組病毒感染細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清均能凝集1％人“O”型紅細(xì)胞懸液，而其他重組桿狀病毒不能凝集1％人“O”型紅細(xì)胞懸液，陽(yáng)性對(duì)照成立，表明表達(dá)的VP60蛋白具有與RHDV一樣的血凝特性。當(dāng)接種重組病毒后120h收毒，發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞裂解上清和細(xì)胞培養(yǎng)上清血凝效價(jià)均可達(dá)212以上。同時(shí)表達(dá)的VP60蛋白的血凝特性可被RHDV高免血清所抑制。
四免疫保護(hù)試驗(yàn) 1免疫抗原的制備 將重組桿狀病毒接種于Sf9細(xì)胞，120h后收毒，測(cè)表達(dá)蛋白的HA效價(jià)，用無(wú)菌滅菌生理鹽水稀釋至HA效價(jià)28。
2試驗(yàn)動(dòng)物分組、接種及攻毒 將15只非免疫家兔于免疫前采血測(cè)HA效價(jià)，并分成3組，每組5只，第一組注射1mL上述抗原，第二組注射2mL上述抗原，第三組作為對(duì)照組，注射生理鹽水，免疫期間每隔7天采一次血并測(cè)HI效價(jià)，于免疫后第22天以HA效價(jià)大于10的RHD強(qiáng)毒肝臟懸液(肝組織∶滅菌生理鹽水＝1∶9)1mL攻擊，觀察14天，并記錄結(jié)果。
3試驗(yàn)結(jié)果 15只非免疫家兔于免疫前采血測(cè)HI效價(jià)在20～23，第一組于攻毒后14天內(nèi)全部健活，保護(hù)率為100％，第二組于攻毒后14天內(nèi)全部健活，保護(hù)率為100％，這兩組家兔在攻毒前血清HI效價(jià)在25～27之間，第三組攻毒后三天內(nèi)全部死亡，癥狀為典型的兔病毒性出血癥(表1)。
表1 不同劑量免疫后對(duì)RHDV的保護(hù)性 五疫苗制備培養(yǎng)Sf9細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種相應(yīng)重組病毒，等細(xì)胞有病變后5天收毒，測(cè)血凝HA效價(jià)，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液PBS PH 7.2調(diào)整抗原溶液，以2‰甲醛溶液滅活后，按抗原鋁膠佐劑為9∶1比例加入佐劑，混勻，即為獲得的兔病毒性出血癥基因工程疫苗。
動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，用重組兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白制成的疫苗免疫非免疫家兔，免疫后以RHD強(qiáng)毒攻擊，免疫家兔獲得100％的保護(hù)作用，說(shuō)明本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的免疫效力，在兔病毒性出血癥預(yù)防控制方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)具備良好的生物安全性。
序列表
<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120>兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組桿狀病毒及疫苗
<130>說(shuō)明書(shū)
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<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物
<222>(1)..(22)
<223>
<400>1
atagtcgaca tggagggcaa ag 22
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物
<222>(1)..(27)
<223>
<400>2
gcctcgagtc agacataaga aaagcca 2權(quán)利要求
1.兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組桿狀病毒，其特征是，由以下步驟構(gòu)建而成
1)兔病毒性出血癥病毒總RNA的提取用焦碳酸二乙酯DEPC水按體積比1∶10加入發(fā)生兔病毒性出血癥的兔肝臟組織中，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過(guò)的1.5mL EP管中，于-20℃反復(fù)凍融3次，在高速冷凍離心機(jī)上，以7200r/min，離心20min，取上清200μL，加入Trizol 800μL，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿210μL，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4℃，10000r/min離心15min，取上層水相750μL，加入0.5mL異丙醇，混勻，-20℃放置15min，4℃ 10000r/min離心10min，去上清，緩緩加入75％乙醇1mL洗滌，4℃ 8000r/min離心5min，去上清，室溫干燥20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解；
2)設(shè)計(jì)合成以下引物
P15’-ATAGTCGACATGGAGGGCAAAG-3’ Sal I
P25’-GCCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCA-3’Xho I
3)擴(kuò)增衣殼蛋白VP60基因
反轉(zhuǎn)錄體系為10×Buffer 2μl、10mM dNTPs 2μl、下游引物1μl、RNA酶抑制劑0.5μl、RNA模板12μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，DEPC水2μl，總體積為20μl，瞬間離心混勻，65℃反應(yīng)15min，42℃孵育1h，95℃5min，-20℃保存?zhèn)溆茫?br> PCR反應(yīng)體系為10×Reaction buffer 2.5μl、25mM MgCl2 1.5μl、2.5mM dNTPS0.5μl、50mM P1 0.5μl、50mM P2 0.5μl、模板RNA 4.0μl、ddH2O 15μl、EX TaqTMpolymerase 0.5μl，總體積25μl，瞬間離心混勻，采用熱蓋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃變性3min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，結(jié)束反應(yīng)；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的衣殼蛋白VP60基因擴(kuò)增片斷大小為1740bp；
4)重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-VP60的構(gòu)建
將擴(kuò)增的VP60基因先克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1中，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1-VP60，然后將pFastBacTM1-VP60質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有三種抗生素、X-gal和IPTG的LB平板，37℃培養(yǎng)48h后，挑選白色菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，以此為模板，以通用pUCM13上游引物與特異性VP60下游引物進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為Bacmid-VP60；
5)轉(zhuǎn)染將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-VP60轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，經(jīng)鑒定純化獲得重組病毒，并凍存于4℃、-20℃和液氮中。
2.權(quán)利要求1所述兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組桿狀病毒制備的疫苗。
3.權(quán)利要求2所述疫苗的制備方法，包括培養(yǎng)Sf9細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種相應(yīng)重組病毒，等細(xì)胞有病變后5天收毒，測(cè)血凝HA效價(jià)，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液PBS PH7.2調(diào)整抗原溶液，以2‰甲醛溶液滅活后，按抗原鋁膠佐劑為9∶1比例加入佐劑，混勻，即為獲得的兔病毒性出血癥基因工程疫苗。
4.權(quán)利要求1所述重兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因重組桿狀病毒真核表達(dá)的病毒性出血癥病毒衣殼蛋白在制備兔病毒性出血癥診斷抗原方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白重組桿狀病毒及基因工程疫苗，屬于生物制藥領(lǐng)域。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60全基因，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建桿狀病毒重組載體，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，使VP60基因獲得表達(dá)，然后以重組桿狀病毒表達(dá)的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白VP60作為抗原，加上相應(yīng)的佐劑制成兔病毒性出血癥的基因工程疫苗。本發(fā)明可以提供一種免疫效果好、工藝簡(jiǎn)便的兔病毒性出血癥病毒衣殼蛋白基因工程疫苗，用于預(yù)防控制兔病毒性出血癥。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101215576SQ200810019269
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者芳 王, 薛家兵, 范志宇, 波 胡, 徐為中, 張則斌, 何孔旺 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院