專利名稱：：一種發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及利用發(fā)酵與膜分離單元相耦合制備丁二酸的方法。技術(shù)背景丁二酸(SuccinicAcid,ButanedioicAcid)又稱琥珀酸，是一種重要的二元有機(jī)羧酸，可作為合成復(fù)雜有機(jī)化合物的中間體，廣泛用于制藥、食品加工、合成材料、表面活性劑、防護(hù)涂料、染料和其它工業(yè)中。然而，傳統(tǒng)上的化學(xué)合成丁二酸因成本和環(huán)境污染等原因使得丁二酸作為基本化工原料的廣泛應(yīng)用受到限制。發(fā)酵法制備丁二酸以成本較低的可再生的生物質(zhì)和溫室氣體二氧化碳為原料，污染少，能耗低，因此以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的研究與開發(fā)正在美國、日本等國家深入地進(jìn)行著。利用微生物發(fā)酵制備提取丁二酸的專利有US5034105(1991)、US5168055(1992)、US5143834(1992)、US5958744(1999)等，其專利保護(hù)內(nèi)容主要涉及發(fā)酵用菌種、發(fā)酵工藝和提取工藝等。目前國內(nèi)外利用微生物發(fā)酵制備丁二酸多采用傳統(tǒng)的批式發(fā)酵工藝，在發(fā)酵過程中，隨著產(chǎn)品丁二酸及甲酸、乙酸等副產(chǎn)物的大量積累，嚴(yán)重地抑制了丁二酸生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)并進(jìn)而影響丁二酸的合成速度，造成其發(fā)酵生產(chǎn)水平低下，因此在丁二酸發(fā)酵過程中往往需要添加大量的鈣鎂鹽來中和大量產(chǎn)生的有機(jī)酸以保證發(fā)酵的正常進(jìn)行。在上述公開的專利中，經(jīng)實(shí)踐和研究發(fā)現(xiàn)，采用這些工藝存在以下問題鈣鎂鹽中和，給丁二酸發(fā)酵體系帶來了大量雜質(zhì)，增加了后期分離提取的難度，如硫酸鈣過濾過程中產(chǎn)品損失高達(dá)30%以上；高離子強(qiáng)度導(dǎo)致離子交換樹脂污染嚴(yán)重，工作容量迅速下降，樹脂再生困難；高濃度的鈣鎂離子還會(huì)導(dǎo)致溶劑萃取效率低下或污染電滲析膜導(dǎo)致能耗迅速增加。總之采用鈣鎂鹽中和的批式發(fā)酵制備丁二酸，分離工藝步驟多，收率低，酸堿/溶劑消耗量大，生產(chǎn)裝置易被污染，產(chǎn)生的廢液廢渣嚴(yán)重污染環(huán)境，運(yùn)行成本高，最終限制了發(fā)酵法制備丁二酸的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力。因此如何解除丁二酸發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物抑制、提高丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度與收率是生物法制備丁二酸實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。目前將膜分離單元與生物反應(yīng)器進(jìn)行耦合，可較好地實(shí)現(xiàn)菌體細(xì)胞與代謝產(chǎn)物的分離而倍受關(guān)注，在發(fā)酵制備乙醇、丙酮-丁醇、乳酸、丙酸及細(xì)胞高密度培養(yǎng)的研究中均有成功報(bào)道。但目前未見將膜分離單元與發(fā)酵耦合進(jìn)行連續(xù)或半連續(xù)制備丁二酸的專利報(bào)道。但目前基于膜分離技術(shù)的反應(yīng)-分離耦合發(fā)酵制備有機(jī)酸的研究中，多采用基于篩分原理的微濾、超濾膜作為單一的分離組件，此類設(shè)計(jì)只能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與發(fā)酵液的分離，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物與底物的分離，不可避免地造成發(fā)酵液中未消耗底物及其他營養(yǎng)元素的損失，為了解決這一問題，前人在微濾、超濾膜循環(huán)生物反應(yīng)器中結(jié)合離子交換、化學(xué)萃取、電滲析等手段回收未消耗的底物，但這些手段或需消耗大量酸堿再生樹脂，或易造成溶劑殘留對(duì)發(fā)酵不利，或需消耗大量電能。而納濾膜介于反滲透與超濾之間(截留分子量為100-1000道爾頓)，其分離機(jī)理與分子量篩分及膜分離層表面的靜電排斥有關(guān)，對(duì)分子量siooo的生物小分子及高價(jià)離子有較好的分離效果，在抗生素分離濃縮、氨基酸分離純化等方面已有應(yīng)用，目前未見使用納濾等高效膜分離手段從丁二酸發(fā)酵液中回收底物的專利報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用發(fā)酵與膜分離單元的耦合制備丁二酸的方法，以解除丁二酸發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物抑制，提高丁二酸發(fā)酵生產(chǎn)水平，同時(shí)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)-分離耦合過程中未消耗底物的回收與利用，提高底物的利用率。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案如下一種發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，包括如下步驟1、制備產(chǎn)丁二酸菌株的發(fā)酵種子；2、制備發(fā)酵培養(yǎng)基；3、將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，再將發(fā)酵種子接入發(fā)酵罐；4、前期厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；5、使部分發(fā)酵液流出發(fā)酵罐，同時(shí)流加發(fā)酵培養(yǎng)基以保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定；6、發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；同時(shí)流出發(fā)酵罐的發(fā)酵液先經(jīng)過微濾或超濾單元，再經(jīng)過納濾單元，被微濾或超濾單元截留的菌體細(xì)胞與組分返回發(fā)酵罐內(nèi)，被納濾單元截留的發(fā)酵液中未消耗的底物也返回發(fā)酵罐，收集納濾膜滲透液。其中，步驟1中所述的產(chǎn)丁二酸菌株為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌^"/"0toc說M其中，步驟1中所述的制備發(fā)酵種子的方法由如下步驟組成a、種子培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基為pH6.07.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機(jī)鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基；斜面培養(yǎng)時(shí)，種子培養(yǎng)基內(nèi)再添加瓊脂。其中糖類為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖等碳源中的一種或多種；氮源為有機(jī)或無機(jī)含氮化合物，其中無機(jī)含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多種，有機(jī)含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米漿、牛肉膏中的一種或多種；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽中的一種或多種。b.斜面培養(yǎng)將產(chǎn)丁二酸菌株在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱通入含有N2、C02和H2的混合氣體，N2、C02和H2的體積比為8:1:1，溫度為3040。C，培養(yǎng)2448h，用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存。c.發(fā)酵種子培養(yǎng)每100mL血清瓶中種子培養(yǎng)基的用量為2080mL，通入含有N2、C02的混合氣體，N2、C02的體積比為4:l，115121。C滅菌1530min，冷卻后接入產(chǎn)丁二酸菌種，培養(yǎng)溫度為3040°C，轉(zhuǎn)速100200r/min，發(fā)酵時(shí)間為1014h，作為發(fā)酵種子。其中，步驟2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為pH6.07.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機(jī)鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基，并添加維生素。其中糖類為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、生物質(zhì)(如玉米皮、玉米芯、植物秸稈)水解糖液等碳源中的一種或多種；氮源為有機(jī)或無機(jī)含氮化合物，其中無機(jī)含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多種，有機(jī)含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米漿、牛肉膏中的一種或多種；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽中的一種或多種；維生素為葉酸、生物素、維生素B12、硫辛酸、煙酸、泛酸、硫胺素或維生素B6中的一種或多種。其中，步驟3中，每5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為24L，丁二酸發(fā)酵種子的接種體積占培養(yǎng)基體積的37%。其中，步驟4所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法為溫度3540°C，發(fā)酵罐通入C02氣體，通氣量為0.751.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速100300rpm，發(fā)酵過程采用碳酸鈉、氨水、氫氧化鈉、硫酸或鹽酸，控制體系的pH在6.07.5，進(jìn)行前期厭氧發(fā)酵10~15h。其中，步驟5可采用半連續(xù)方式(又稱半連續(xù)發(fā)酵)，即每隔46h,將40~67%發(fā)酵液分離出發(fā)酵罐，同時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基，并保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定。也可采用連續(xù)方式(又稱連續(xù)發(fā)酵)，即以0.10.8h'i的稀釋速度(本發(fā)明中稀釋速度是指單位時(shí)間內(nèi)流加至發(fā)酵罐內(nèi)的溶液體積與初始發(fā)酵液體積之比)流加發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)排出發(fā)酵液，以保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定。其中，步驟6微濾或超濾單元中，所使用的微濾膜孔徑為0.10.2Pm，超濾膜的截留分子量為8000100000道爾頓，其膜組件形式為中空纖維式或管式膜，其膜材質(zhì)為有機(jī)膜或無機(jī)陶瓷膜；對(duì)于有機(jī)膜，使用前可采用1~4%的氫氧化鈉溶液進(jìn)行化學(xué)消毒；對(duì)無機(jī)陶瓷膜，使用前可采用11012(TC的蒸汽濕熱消毒或以1~4%的氫氧化鈉溶液進(jìn)行化學(xué)消毒。納濾單元中，納濾膜的截留分子量為100~200道爾頓，采用巻式納濾膜組件，使用前需經(jīng)1~4%的氫氧化鈉溶液消毒處理。其中，步驟6中，發(fā)酵液在流出微濾或超濾單元之后，先用硫酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.04.5;然后進(jìn)入納濾單元，操作壓力為720bar，溫度為10~30°C;此時(shí)，納濾膜可截留葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、二價(jià)金屬鹽和有機(jī)氮源，并截留料液中的部分色素(降低色度可減少下游工藝的活性炭用量)，而丁二酸、甲酸和乙酸等抑制性代謝產(chǎn)物可透過納濾膜；當(dāng)發(fā)酵液中的糖被納濾濃縮至糖濃度為3060g/L，且甲酸、乙酸濃度均低于2g/L，丁二酸濃度低于5g/L時(shí)，停止納濾；將截留的納濾濃縮液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.0-6.5，再經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾后直接返回至發(fā)酵罐內(nèi)。收集的納濾滲透液可繼續(xù)進(jìn)行丁二酸的下游分離操作。本發(fā)明發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法流程圖見圖1。有益效果本發(fā)明采用膜分離單元與發(fā)酵過程耦合實(shí)現(xiàn)半連續(xù)或連續(xù)發(fā)酵制備丁二酸，不但可以解除發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，顯著提高丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度，而且不需要在生產(chǎn)過程中添加任何鈣、鎂鹽中和；利用納濾回收分離液中未消耗還原糖的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了底物的濃縮及底物與產(chǎn)品的分離，不需要使用任何有機(jī)溶劑及離子交換樹脂。本發(fā)明提供的方法在實(shí)現(xiàn)丁二酸高生產(chǎn)強(qiáng)度的同時(shí)，將細(xì)胞與產(chǎn)物分離、底物回收與濃縮等工藝與發(fā)酵過程緊密耦合，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的步驟繁瑣、酸堿用量大、污染重、能耗高及生產(chǎn)勞動(dòng)強(qiáng)度大的缺陷，生產(chǎn)過程條件溫和、易于自動(dòng)化控制及產(chǎn)業(yè)化，具有顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。圖1為發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法流程圖。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。實(shí)施例h(1)種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP04915g/L，KH2P04412g/L，(斜面培養(yǎng)時(shí)加瓊脂20g/L)，通入N2:C02=4:l的混合氣2min，12rC滅菌20min，冷卻；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，酵母膏1050g/L，蛋白胨1050g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，維生素添加葉酸5mg/L，生物素5mg/L,維生素Bu5mg/L，硫辛酸5mg/L，煙酸5mg/L，泛酸5mg/L，硫胺素5mg/L，維生素B65mg/L，pH7.0;(3)將保藏編號(hào)為CGMCCNo.1716的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H2=8:1:1，培養(yǎng)36h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有50ml種子液體培養(yǎng)基的100ml血清瓶中，轉(zhuǎn)速150r/min，37'C培養(yǎng)12小時(shí)后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種。采用5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基裝液量為3L，接種量為5。/。(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在200rpm,37°C，以250g/L碳酸鈉調(diào)控pH為7.0，發(fā)酵罐二氧化碳的通氣量為0.75L/min。發(fā)酵12h后，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度己達(dá)2.0g/Lh，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，體系中積累的丁二酸及甲酸、乙酸的總濃度已達(dá)30g/L，發(fā)酵液中葡萄糖濃度為10g/L，此時(shí)準(zhǔn)備耦合微濾膜進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵；(4)采用0.1ixm的中空纖維式有機(jī)微濾膜，使用前用P/。的氫氧化鈉溶液浸泡6h進(jìn)行消毒，后用無菌水洗滌至出水pH8.5封閉備用。將微濾膜與發(fā)酵罐連接，在0.5ba的壓力下進(jìn)行微濾，濾出發(fā)酵液，細(xì)胞及截留部分返回罐中繼續(xù)發(fā)酵，濾出液至2.0L(相當(dāng)于罐內(nèi)原體積的67%)時(shí)，停止分離，流加1.5L葡萄糖濃度為60g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基；將收集的濾出液用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.0，選用截留分子量為IOO道爾頓的巻式納濾膜進(jìn)行納濾分離，操作壓力為15bar，料液溫度控制在3(TC，納濾分離過程中葡萄糖截留率達(dá)到90%，丁二酸、甲酸、乙酸的截留率均<8%，收集濃縮液0.5L，葡萄糖濃度達(dá)40g/L，用氫氧化鈉調(diào)至pH6.0，經(jīng)超濾膜過濾后流加至發(fā)酵罐內(nèi)，保持罐內(nèi)體積恒定，繼續(xù)發(fā)酵。此后每隔5h進(jìn)行分離及補(bǔ)料操作，共分離補(bǔ)料6次，持續(xù)30h，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到3.0g/Lh。丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度比相同葡萄糖濃度并加入40g/L碳酸鎂進(jìn)行中和的批式發(fā)酵增加了50%，比不用鈣鎂鹽中和的批式發(fā)酵提高84%。實(shí)施例2:(1)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均與實(shí)施例l相同。(2)將保藏編號(hào)為CGMCCNo.l716的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株制備發(fā)酵種子，方法同實(shí)施例l。釆用5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基裝液量為3L，接種量為4%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在300rpm，37°C，以280g/L碳酸鈉調(diào)控至pH6.8,發(fā)酵罐二氧化碳的通氣量為1.0L/min。發(fā)酵llh后，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度已達(dá)2.2g/Lh，菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，體系中積累的丁二酸及甲酸、乙酸的總濃度已達(dá)29g/L，此時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖濃度為11g/L，此時(shí)準(zhǔn)備耦合超濾膜進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵；(3)采用截留分子量為100000道爾頓的管式陶瓷超濾膜，使用前在121'C滅菌20min，備用。將超濾膜與發(fā)酵罐連接，在2ba的壓力下進(jìn)行超濾，濾出發(fā)酵液，細(xì)胞及截留部分返回罐中繼續(xù)發(fā)酵，濾出液至1.5L時(shí)(相當(dāng)于罐內(nèi)原體積的50%)，停止分離，流加1L葡萄糖濃度為70g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基。將超濾分離得到的1.5L濾液用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.0,選用截留分子量為150道爾頓的巻式納濾膜進(jìn)行納濾分離，操作壓力為10bar，料液溫度控制在15'C，將濾液濃縮至0.5L，納濾分離過程中葡萄糖截留率達(dá)到88%，丁二酸、甲酸、乙酸的截留率均<5%，濃縮液中葡萄糖達(dá)到31g/L，甲酸lg/L、乙酸0.5g/L、丁二酸2g/L。同時(shí)納濾對(duì)透過液的脫色率達(dá)80%。每隔6h進(jìn)行相同的分離操作，在流加培養(yǎng)基同時(shí)，將納濾回收的葡萄糖濃縮液用氫氧化鈉調(diào)至pH6.0,經(jīng)超濾處理后直接返回發(fā)酵罐內(nèi)，保持罐內(nèi)體積恒定。整個(gè)半連續(xù)發(fā)酵過程持續(xù)50h，分離補(bǔ)料5次，發(fā)酵中共消耗葡萄糖470g，產(chǎn)丁二酸325g，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度為2.17g/Lh。在初始葡萄糖40g/L的條件下，丁二酸質(zhì)量收率0.69g/g葡萄糖，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度比相同葡萄糖濃度并加入40g/L碳酸鎂進(jìn)行中和的批式發(fā)酵增加了8.5%，比不用鈣美鹽中和的批式發(fā)酵提高33%。實(shí)施例3:將保藏編號(hào)為CGMCCNo.1716的菌株采用同實(shí)施例1相同的方法制備發(fā)酵罐種子，5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基裝液量為3L，發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為25g/L，其余組分同實(shí)施例l，釆用10N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6.80，通入C02，通氣量為0.75L/min，保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，接種量為5%(v/v)，轉(zhuǎn)速250r/min，培養(yǎng)37'C發(fā)酵培養(yǎng)10.5h后，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度已達(dá)1.7g/Lh，體系中積累的丁二酸及甲酸、乙酸的總濃度已達(dá)23g/L，葡萄糖濃度僅2g/L，準(zhǔn)備耦合微濾膜進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。釆用經(jīng)4%氫氧化鈉消毒處理的0.14um的管式陶瓷微濾膜，將微濾膜與發(fā)酵罐連接，分離發(fā)酵液，細(xì)胞及截留部分返回罐中，同時(shí)流加培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為30g/L)保證罐內(nèi)體積恒定，稀釋速度分別為0.1-0.8h'1，分別流加葡萄糖600g，結(jié)果見表l。表l不同稀釋速度對(duì)丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與半連續(xù)發(fā)酵相比，連續(xù)發(fā)酵過程中丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度最高可達(dá)13.0g/L'h。在0.1h'的稀釋速度下，丁二酸質(zhì)量收率可達(dá)0.82g/g葡萄糖。實(shí)施例4:將半連續(xù)發(fā)酵過程中超濾分離得到的發(fā)酵液(葡萄糖9g/L，丁二酸20~24g/L，甲酸45g/L，乙酸67g/L)作為納濾分離原料，用鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.0，選用截留分子量為150道爾頓的納濾膜分別在720bar的操作壓力下進(jìn)行分離，分離體積為1.5L，操作溫度控制18'C，納濾過程中收集納濾膜滲透液，截留液返回進(jìn)料液中，結(jié)果見表2。表2不同壓力對(duì)納濾分離回收葡萄糖的影響壓力葡萄糖截留率丁二酸截留率甲酸截留率乙酸截留率膜滲透通量脫色率(ba)(%)(%)(%)(%)(L/m2h)(%)783.33.54.30.920.8761087.24.24.41.636.5811289.54.84.81.838.2831591.64.65.02.142.3861892.24.14.72.439.68820卯.33.74.72.637.089可見操作壓力為1520ba時(shí)，納濾膜對(duì)葡萄糖的截留率可達(dá)90%。截留液中甲酸、乙酸濃度均《2g/L、丁二酸濃度《5g/L，脫色率均》85%。實(shí)施例5:將保藏編號(hào)為CGMCCNo.1716的菌株采用同實(shí)施例1相同的方法制備發(fā)酵罐種子，5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基裝液量為3L，發(fā)酵培養(yǎng)基中總還原糖濃度為50g/L(以以玉米皮水解液為碳源，其中葡萄糖20g/L、木糖18g/L、阿拉伯糖12g/L)，其余組分同實(shí)施例l，采用2M碳酸鈉調(diào)節(jié)pH6.70，通入C02，通氣量為0.75L/min，保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，接種量為5。/。(v/v)，轉(zhuǎn)速250r/min，培養(yǎng)37'C發(fā)酵培養(yǎng)15h后，菌株產(chǎn)丁二酸速率已穩(wěn)定在2.5g/Lh，體系中積累的丁二酸及甲酸、乙酸的總濃度已達(dá)30g/L，此時(shí)殘留的還原糖總濃度為12g/L(葡萄糖2.5g/L，木糖3g/L，阿拉伯糖6.5g/L)，準(zhǔn)備耦合微濾膜進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。采用經(jīng)4%氫氧化鈉消毒處理的O.lnm的中空纖維微濾膜，將微濾膜與發(fā)酵罐連接，開始分離發(fā)酵液，細(xì)胞及截留部分返回罐中，將連續(xù)發(fā)酵過程中分離得到的發(fā)酵液分別用鹽酸調(diào)節(jié)至pH3.04.5，選用截留分子量為IOO道爾頓的納濾膜分別在15bar的操作壓力下進(jìn)行分離納濾分離，操作溫度控制20'C，濃縮3倍，納濾分離效果見表3?？梢妏H54.0時(shí)，納濾膜對(duì)還原糖的截留率可達(dá)90%左右。甲酸、乙酸、丁二酸等抑制性代謝產(chǎn)物濃度均^5%，脫色率均^85%。濃縮液中總還原糖濃度約為50g/L，調(diào)至pH6.0。向發(fā)酵罐內(nèi)流加培養(yǎng)基(以玉米皮水解液為碳源，總還原糖濃度為60g/L，其中葡萄糖25g/L、木糖22g/L、阿拉伯糖13g/L)的稀釋速度為O.lh'1，同時(shí)將納濾回收的還原糖濃縮液經(jīng)超濾處理后直接返回發(fā)酵罐內(nèi)，控制稀釋速度為O.lh"，保持發(fā)酵罐內(nèi)體積恒定。整個(gè)連續(xù)發(fā)酵過程持續(xù)40h，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度為2.55g/Lh，與加入鈣鎂鹽中和的批式發(fā)酵相比提高59%，丁二酸質(zhì)量收率達(dá)0.71g/g還原糖，提高了9.2%。表3不同pH對(duì)納濾分離回收葡萄糖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)制備產(chǎn)丁二酸菌株的發(fā)酵種子；(2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基；(3)將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，再將發(fā)酵種子接入發(fā)酵罐；(4)前期厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；(5)使部分發(fā)酵液流出發(fā)酵罐，同時(shí)流加發(fā)酵培養(yǎng)基以保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定；(6)發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；同時(shí)流出發(fā)酵罐的發(fā)酵液先經(jīng)過微濾或超濾單元，再經(jīng)過納濾單元，被微濾或超濾單元截留的菌體細(xì)胞與組分返回發(fā)酵罐內(nèi)，被納濾單元截留的發(fā)酵液中未消耗的底物也返回發(fā)酵罐，收集納濾膜滲透液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(l)中所述的產(chǎn)丁二酸菌株為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌^c""o6acz7/w;ywcdwge"^。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(l)中所述的制備發(fā)酵種子的方法由如下步驟組成a.種子培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基為pH6.07.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機(jī)鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基；斜面培養(yǎng)時(shí)，種子培養(yǎng)基內(nèi)再添加瓊脂；其中糖類為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖或甘露糖中的一種或多種；氮源為有機(jī)或無機(jī)含氮化合物，其中無機(jī)含氮化合物為乙酸銨或氯化銨中的一種或多種，有機(jī)含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米槳或牛肉膏中的一種或多種；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、錳鹽或鐵鹽中的一種或多種；b.斜面培養(yǎng)將產(chǎn)丁二酸菌株在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱通入含有N2、C02和H2的混合氣體，N2、C02和H2的體積比為8:1:1，溫度為304(TC，培養(yǎng)2448h，用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存；c.發(fā)酵種子培養(yǎng)每100mL血清瓶中種子培養(yǎng)基的用量為2080mL，通入含有N2、C02的混合氣體，N2、C02的體積比為4:l，115121'C滅菌1530min，冷卻后接入產(chǎn)丁二酸菌種，培養(yǎng)溫度為3040°C，轉(zhuǎn)速100200r/min，發(fā)酵時(shí)間為1014h，作為發(fā)酵種子。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(2)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為pH6.07.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機(jī)鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基，并添加維生素；其中糖類為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖或生物質(zhì)水解糖液中的一種或多種；氮源為有機(jī)或無機(jī)含氮化合物，其中無機(jī)含氮化合物為乙酸銨或氯化銨中的一種或多種，有機(jī)含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米漿或牛肉膏中的一種或多種；無機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、錳鹽或鐵鹽中的一種或多種；維生素為葉酸、生物素、維生素Bu、硫辛酸、煙酸、泛酸、硫胺素或維生素B6中的一種或多種。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(3)中，每5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為24L，丁二酸發(fā)酵種子的接種體積占培養(yǎng)基體積的37%。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(4)所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法為溫度354(TC，發(fā)酵罐通入C02氣體，通氣量為0.75-1.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速100300rpm，發(fā)酵過程采用碳酸鈉、氨水、氫氧化鈉、硫酸或鹽酸，控制體系的pH在6.07.5，進(jìn)行前期厭氧發(fā)酵10~15h。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(5)采用半連續(xù)方式，每隔46h，將40~67%的發(fā)酵液分離出發(fā)酵罐，同時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基，保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(5)采用連續(xù)方式，以0.10.8h'1的稀釋速度流加發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)排出發(fā)酵液，保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(6)微濾或超濾單元中，所使用的微濾膜孔徑為0.1~0.2nm，超濾膜的截留分子量為8000~100000道爾頓，其膜組件形式為中空纖維式或管式膜，其膜材質(zhì)為有機(jī)膜或無機(jī)陶瓷膜；納濾單元中，納濾膜的截留分子量為100-200道爾頓，采用巻式納濾膜組件。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(6)中，發(fā)酵液在流出微濾或超濾單元之后，先用硫酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.04.5;然后進(jìn)入納濾單元，操作壓力為720bar，溫度為10~30°C;當(dāng)發(fā)酵液中的糖被納濾濃縮至糖濃度為30~60g/L，且甲酸、乙酸濃度均低于2g/L，丁二酸濃度低于5g/L時(shí)，停止納濾;將截留的納濾濃縮液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.06.5，再經(jīng)截留分子量為10000道爾頓的超濾膜過濾后直接返回至發(fā)酵罐內(nèi)。全文摘要本發(fā)明公開了一種發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，該方法先將產(chǎn)丁二酸菌株的發(fā)酵種子接入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，再將微濾或超濾膜分離單元與發(fā)酵罐耦合實(shí)現(xiàn)半連續(xù)或連續(xù)發(fā)酵制備丁二酸，分離出部分發(fā)酵液，解除代謝產(chǎn)物抑制，被膜分離單元截留的菌體細(xì)胞與組分返回罐內(nèi)繼續(xù)發(fā)酵，并通過納濾回收分離的發(fā)酵液中未消耗的底物繼續(xù)用于發(fā)酵，同時(shí)流加發(fā)酵培養(yǎng)基保持罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定。本發(fā)明不但可以解除代謝產(chǎn)物抑制顯著提高丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度，而且利用納濾回收分離液中未消耗還原糖，并同時(shí)進(jìn)行濃縮，工藝條件溫和，環(huán)境污染小，易于自動(dòng)化控制，具有廣泛的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號(hào)C12P7/40GK101215583SQ20081001928公開日2008年7月9日申請(qǐng)日期2008年1月18日優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日發(fā)明者昊吳,忠姚,岷姜,鵬左,陳可泉,丹雷,萍韋申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)