本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
斑重唇魚Diptychus maculates Steindachner，又名斑黃瓜魚，隸屬于鯉科Cyprinidae，裂腹魚亞科Schizothoracinae，重唇魚屬Diptychus，為冷水雜食性魚類，常棲息于有沙礫的河流及山間支流中。斑重唇魚具有懷卵量少、生殖力較低、生長(zhǎng)速度緩慢、性成熟晚等繁殖生物學(xué)特性，一旦過度捕撈，資源將難以恢復(fù)。近年來(lái)由于受到環(huán)境變化和人類活動(dòng)影響，斑重唇魚分布區(qū)域正在逐漸縮小，種群數(shù)量急劇下降，已被列為新疆維吾爾自治區(qū)II級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物。關(guān)于斑重唇魚的研究，多集中于繁殖生物學(xué)和資源生物學(xué)領(lǐng)域，而采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)斑重唇魚的研究不多，且多集中在線粒體部分序列的比較研究，關(guān)于其線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法未見報(bào)道?？紤]到目前斑重唇魚遺傳學(xué)尤其是線粒體基因組方面的信息量有限，開展其線粒體基因組全序列的研究就顯得十分必要。
目前擴(kuò)增線粒體基因組全序列的方法大多采用引物步移法，即參考同源序列在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列并測(cè)序，在測(cè)出的序列兩端繼續(xù)設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增測(cè)序，如此循環(huán)重復(fù)，最后將獲得的序列片段進(jìn)行拼接，獲得線粒體全序列。為保證準(zhǔn)確性和可讀性，常規(guī)PCR每次擴(kuò)增序列長(zhǎng)度在500-600bp左右，而脊椎動(dòng)物線粒體基因組多在15kb以上，因此至少需要設(shè)計(jì)20-30多對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，這種方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在后期凌亂的序列拼接過程中也容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。而本專利涉及的LA-PCR方法，具有擴(kuò)增片段長(zhǎng)、高保真性等特點(diǎn)，采用該方法對(duì)斑重唇線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增國(guó)內(nèi)尚屬首次。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴(kuò)增方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供的斑重唇魚線粒體基因組全序列擴(kuò)增方法包括以下步驟：
(1)斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因片段的擴(kuò)增.
(2)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴(kuò)增。
所述的斑重唇魚線粒體基因組Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因片段的擴(kuò)增方法，包括以下幾個(gè)步驟：
(1)用于擴(kuò)增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因片段引物的篩選，選取了擴(kuò)增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因的引物分別為：
Cyt b：上游引物為5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物為5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；
COI：上游引物為5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物為5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；
ND4：上游引物為5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物為5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；
16S rRNA：上游引物為5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物為5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’。
(2)四個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×buffer 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)4μL，Taq聚合酶2units，引物(10μM)各2μL，斑重唇魚基因組DNA 2μL(1μg)，加滅菌水至終體積50μL。
PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后是35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，57℃(Cyt b和16S rRNA)、54℃(COI)、56℃(ND4)退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：稱量0.7g瓊脂糖加入70mL 1×TAE緩沖液的錐形瓶中，微波爐加熱至瓊脂粉完全溶解且無(wú)泡沫，冷卻至50-60℃左右加入7μL核酸染料Gelview，輕輕搖勻避免產(chǎn)生氣泡。待冷卻至不燙手時(shí)將膠緩緩倒入膠槽內(nèi)，待瓊脂糖凝膠完全凝固后豎直拔掉梳子，將2μL斑重唇魚DNA樣本與0.5μL 6×DNA loading buffer混合后依次上樣，最后點(diǎn)上6μL DL2000Marker后開始電泳。電泳電壓設(shè)定為120V，電流400mA，時(shí)間30min。電泳完畢在凝膠成像系統(tǒng)照相，通過調(diào)節(jié)光圈和曝光時(shí)間，選擇合適的濾光片，得到成像清晰、背景較低的照片。
所述的斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴(kuò)增。包括以下幾個(gè)步驟：
(1)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)：以獲得的Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因序列片段為模板，在其兩端分別設(shè)計(jì)4對(duì)LA-PCR引物，用于擴(kuò)增斑重唇魚線粒體基因組剩余部分序列；
以16S rRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第一對(duì)引物P1，上游引物為5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物為5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；
以COI基因片段為起點(diǎn)、ND4基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第二對(duì)引物P2，上游引物為5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物為5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；
以ND4基因片段為起點(diǎn)、Cyt b基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第三對(duì)引物P3，上游引物為5’-CGCTGCGGTATGGTGATTCGT-3’，下游引物為5’-ATGATGCTCCGTTGGCGTGTA-3’；
以Cyt b基因片段為起點(diǎn)、16S rRNA基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第四對(duì)引物P4，上游引物為5’-TGACCTACCAGCACCATCCAACAT-3’，下游引物為5’-GACAGTTAAGCCCTCGTTTAGCCA-3’。
(2)根據(jù)設(shè)計(jì)的4對(duì)LA-PCR引物擴(kuò)增斑重唇魚線粒體基因組全序列，使用寶生物工程(大連)有限公司的LA Taq聚合酶；
LA-PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×LA PCR buffer II 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)8μL，LA Taq聚合酶2units，引物(20μM)各1μL，斑重唇魚基因組DNA2.5ng(50ng/μL)，加滅菌水至終體積50μL。
LA-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，然后是30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，57℃(P1)、60℃(P2)、58℃(P3)、59℃(P4)退火30s，72℃延伸4(P1)、6(P2)、3(P3)、5(P4)min，最后72℃再延伸10min。
4對(duì)LA-PCR引物擴(kuò)增分別獲得目的序列片段長(zhǎng)度分別為4kb、6kb、3.1kb和4.5kb。
(3)采用引物步移法，分別以擴(kuò)增的4個(gè)大片段序列為模板，每隔大約500bp左右，設(shè)計(jì)一條測(cè)序引物對(duì)其進(jìn)行分段擴(kuò)增，28條測(cè)序引物序列信息如下：
以16S rRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域6條測(cè)序引物為：
5’-TCAACGAACCAAGTTACCCT-3’
5’-TACGGGCTTCTACAACCTAT-3’
5’-GCCCCTTCGCACTATTTTTC-3’
5’-GGAACCACTTTGACTTTTGC-3’
5’-CCACCTTACACTGCTTGCCC-3’
5’-GTGAAAATCTTCTAGCCCCT-3’
以COI基因片段為起點(diǎn)、ND4基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域10條測(cè)序引物為：
5’-CGGCAAAAAAGAACCATTCG-3’
5’-GCCTATGCCCTATGAAACAC-3’
5’-GTGAACTATTTTACCAGCCG-3’
5’-AAAGATTGGTGCCTCCCGAC-3’
5’-CCGTGATTATTGGAATGCGA-3’
5’-CGTGACATTATCCGAGAAGG-3’
5’-CCACTTTACATCTGACCACC-3’
5’-AGGGAGTTAGTCCAAAGCAA-3’
5’-CACCCCTCTTTTAGTGCTCT-3’
5’-TAGCAGCGGTCCTACTAAAG-3’
以ND4基因片段為起點(diǎn)、Cyt b基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域5條測(cè)序引物為：
5’-CACCTCCCTCCTCGTAGTTT-3’
5’-TCGGGTAGGGGACATTGGAT-3’
5’-GTAAGATGGGAGGCTTGTTT-3’
5’-GGCTTCTTTCCCTCAACTAT-3’
5’-GCAAAGACTACCAACATTCC-3’
以Cyt b基因片段為起點(diǎn)、16S rRNA基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域7條測(cè)序引物為：
5’-TTGGATTGAACTCGGACGCA-3’
5’-AAGCATCGGTCTTGTAATCC-3’
5’-CCAAAGCCAGGATTCTGAAC-3’
5’-GGCTCAAATACTGACTAAGG-3’
5’-GCTCTAACCCGACTTACACA-3’
5’-CCCGTCTAACCTCACCACTT-3’
5’-GTATGGGAGACAGAAAAGGT-3’。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明擴(kuò)增了斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因片段，根據(jù)獲得序列設(shè)計(jì)了4對(duì)LA-PCR引物進(jìn)行大片段序列擴(kuò)增，然后通過引物步移的方法，用28條測(cè)序引物對(duì)斑重唇魚線粒體基因組其余部分進(jìn)行PCR擴(kuò)增從而獲得斑重唇魚長(zhǎng)度為16895bp的線粒體全基因組序列。從分子水平研究斑重唇魚的遺傳與進(jìn)化，特別是以mtDNA作為分子標(biāo)記，為斑重唇魚物種鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化研究提供了基礎(chǔ)資料和技術(shù)支持。
具體實(shí)施方式
下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供的斑重唇魚線粒體基因組全序列擴(kuò)增方法包括以下步驟：
(1)斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因片段的擴(kuò)增。
(2)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴(kuò)增。
所述的斑重唇魚線粒體基因組Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因片段的擴(kuò)增方法，包括以下幾個(gè)步驟：
(1)用于擴(kuò)增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因片段引物的篩選，選取了擴(kuò)增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因的引物分別為：
Cyt b：上游引物為5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物為5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；
COI：上游引物為5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物為5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；
ND4：上游引物為5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物為5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；
16S rRNA：上游引物為5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物為5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’。
(2)四個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×buffer 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)4μL，Taq聚合酶2units，引物(10μM)各2μL，斑重唇魚基因組DNA 2μL(1μg)，加滅菌水至終體積50μL。
PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后是35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，57℃(Cyt b和16S rRNA)、54℃(COI)、56℃(ND4)退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：稱量0.7g瓊脂糖加入70mL 1×TAE緩沖液的錐形瓶中，微波爐加熱至瓊脂粉完全溶解且無(wú)泡沫，冷卻至50-60℃左右加入7μL核酸染料Gelview，輕輕搖勻避免產(chǎn)生氣泡。待冷卻至不燙手時(shí)將膠緩緩倒入膠槽內(nèi)，待瓊脂糖凝膠完全凝固后豎直拔掉梳子，將2μL斑重唇魚DNA樣本與0.5μL 6×DNA loading buffer混合后依次上樣，最后點(diǎn)上6μL DL2000Marker后開始電泳。電泳電壓設(shè)定為120V，電流400mA，時(shí)間30min。電泳完畢在凝膠成像系統(tǒng)照相，通過調(diào)節(jié)光圈和曝光時(shí)間，選擇合適的濾光片，得到成像清晰、背景較低的照片。
所述的斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴(kuò)增。包括以下幾個(gè)步驟：
(1)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)：以獲得的Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個(gè)基因序列片段為模板，在其兩端分別設(shè)計(jì)4對(duì)LA-PCR引物，用于擴(kuò)增斑重唇魚線粒體基因組剩余部分序列；
以16S rRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第一對(duì)引物P1，上游引物為5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物為5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；
以COI基因片段為起點(diǎn)、ND4基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第二對(duì)引物P2，上游引物為5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物為5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；
以ND4基因片段為起點(diǎn)、Cyt b基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第三對(duì)引物P3，上游引物為5’-CGCTGCGGTATGGTGATTCGT-3’，下游引物為5’-ATGATGCTCCGTTGGCGTGTA-3’；
以Cyt b基因片段為起點(diǎn)、16S rRNA基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域設(shè)計(jì)第四對(duì)引物P4，上游引物為5’-TGACCTACCAGCACCATCCAACAT-3’，下游引物為5’-GACAGTTAAGCCCTCGTTTAGCCA-3’。
(2)根據(jù)設(shè)計(jì)的4對(duì)LA-PCR引物擴(kuò)增斑重唇魚線粒體基因組全序列，使用寶生物工程(大連)有限公司的LA Taq聚合酶；
LA-PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×LA PCR buffer II 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)8μL，LA Taq聚合酶2units，引物(20μM)各1μL，斑重唇魚基因組DNA 2.5ng(50ng/μL)，加滅菌水至終體積50μL。
LA-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，然后是30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，57℃(P1)、60℃(P2)、58℃(P3)、59℃(P4)退火30s，72℃延伸4(P1)、6(P2)、3(P3)、5(P4)min，最后72℃再延伸10min。
4對(duì)LA-PCR引物擴(kuò)增分別獲得目的序列片段長(zhǎng)度分別為4kb、6kb、3.1kb和4.5kb。
(3)采用引物步移法，分別以擴(kuò)增的4個(gè)大片段序列為模板，每隔大約500bp左右，設(shè)計(jì)一條測(cè)序引物對(duì)其進(jìn)行分段擴(kuò)增，28條測(cè)序引物序列信息如下：
以16S rRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域6條測(cè)序引物為：
5’-TCAACGAACCAAGTTACCCT-3’
5’-TACGGGCTTCTACAACCTAT-3’
5’-GCCCCTTCGCACTATTTTTC-3’
5’-GGAACCACTTTGACTTTTGC-3’
5’-CCACCTTACACTGCTTGCCC-3’
5’-GTGAAAATCTTCTAGCCCCT-3’
以COI基因片段為起點(diǎn)、ND4基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域10條測(cè)序引物為：
5’-CGGCAAAAAAGAACCATTCG-3’
5’-GCCTATGCCCTATGAAACAC-3’
5’-GTGAACTATTTTACCAGCCG-3’
5’-AAAGATTGGTGCCTCCCGAC-3’
5’-CCGTGATTATTGGAATGCGA-3’
5’-CGTGACATTATCCGAGAAGG-3’
5’-CCACTTTACATCTGACCACC-3’
5’-AGGGAGTTAGTCCAAAGCAA-3’
5’-CACCCCTCTTTTAGTGCTCT-3’
5’-TAGCAGCGGTCCTACTAAAG-3’
以ND4基因片段為起點(diǎn)、Cyt b基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域5條測(cè)序引物為：
5’-CACCTCCCTCCTCGTAGTTT-3’
5’-TCGGGTAGGGGACATTGGAT-3’
5’-GTAAGATGGGAGGCTTGTTT-3’
5’-GGCTTCTTTCCCTCAACTAT-3’
5’-GCAAAGACTACCAACATTCC-3’
以Cyt b基因片段為起點(diǎn)、16S rRNA基因片段為終點(diǎn)的環(huán)形區(qū)域7條測(cè)序引物為：
5’-TTGGATTGAACTCGGACGCA-3’
5’-AAGCATCGGTCTTGTAATCC-3’
5’-CCAAAGCCAGGATTCTGAAC-3’
5’-GGCTCAAATACTGACTAAGG-3’
5’-GCTCTAACCCGACTTACACA-3’
5’-CCCGTCTAACCTCACCACTT-3’
5’-GTATGGGAGACAGAAAAGGT-3’。
通過本實(shí)施例提供的方法，獲得的斑重唇魚線粒體基因組結(jié)構(gòu)如下：
斑重唇魚線粒體基因組全序列序列表如下：
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大學(xué)
<120> 一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴(kuò)增方法
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Cyt b：上游引物
<400> 1
GACTTGAAAAACCACCGTTG 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Cyt b：下游引物
<400> 2
CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> COI：上游引物
<400> 3
TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> COI：下游引物
<400> 4
TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> ND4：上游引物
<400> 5
GCKTTTTCTGCKTGTGARGC 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> ND4：下游引物
<400> 6
CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> 16S rRNA：上游引物
<400> 7
CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT 25
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> 16S rRNA：下游引物
<400> 8
CCGGTCTGAACTCAGATCACGT 22