本發(fā)明屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多孔磁性銅離子金屬螯合載體及利用該載體固定化酶。

背景技術(shù)：

磁性載體是最近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的用于固定化酶的新型材料載體。以其作載體的各種生物檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)滲透到免疫學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、分子遺傳學(xué)、電化學(xué)以及釀酒發(fā)酵工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。它是指通過(guò)適當(dāng)方法使有機(jī)高分子與磁性材料相結(jié)合所形成的具有一定磁性和特殊結(jié)構(gòu)的微球載體。與非磁性材料相比，其具有一些新的優(yōu)點(diǎn)：(1)磁性材料制得的固定化酶可通過(guò)外加磁場(chǎng)來(lái)控制其在底物中的運(yùn)動(dòng)方向和方式，進(jìn)一步提高催化效率；(2)能進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)，可用于大規(guī)模生產(chǎn)；(3)便于與產(chǎn)物分離，簡(jiǎn)化提純工藝，降低生產(chǎn)成本；(4)固定化酶可以回收重復(fù)利用。

固定化金屬親和層析(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)是利用金屬螯合配體與蛋白質(zhì)表面的供電子氨基酸-組氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，可以與一些過(guò)渡態(tài)的金屬離子Cu²⁺、Zn²⁺等以配位作用的原理形成穩(wěn)定的螯合物，從而可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化。金屬螯合載體和蛋白質(zhì)通過(guò)過(guò)渡金屬離子形成配位鍵結(jié)合，與傳統(tǒng)固定化載體和方法相比，其結(jié)合牢固，不易被洗脫，結(jié)合位點(diǎn)少，可以實(shí)現(xiàn)酶的定向固定，不使用交聯(lián)劑，避免了對(duì)酶分子造成的化學(xué)損傷，很大程度上保持了酶分子的天然構(gòu)象，有效減少酶活的損失。金屬螯合載體對(duì)固定到表面的蛋白質(zhì)構(gòu)象影響較小，若將這種技術(shù)應(yīng)用于固定化酶，有望克服目前常用固定化酶載體和方法的一些不足。

大豆分離蛋白常作為一種食品添加劑應(yīng)用到食品工業(yè)中，是以低溫脫溶大豆粕為原料生產(chǎn)的。其營(yíng)養(yǎng)豐富，不含膽固醇，是植物蛋白中為數(shù)不多的可替代動(dòng)物蛋白的品種之一。蛋白質(zhì)是人體必不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，在人體的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中起著非常重要的作用。然而由于不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成與空間結(jié)構(gòu)不同，在人體內(nèi)的消化吸收率也大不相同。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被水解為小肽和游離氨基酸后，其吸收利用率可以增加。

但目前尚沒有穩(wěn)定合適的載體來(lái)固定化酶，在大豆蛋白的分離水解中達(dá)到很好的反映效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)以上缺點(diǎn)，提供了一種環(huán)氧基密度高，結(jié)構(gòu)合理的磁性載體，以達(dá)到利用該載體固定化酶，酶的催化效率高的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種多孔磁性銅離子金屬螯合載體，所述載體為以殼聚糖粉末為原料，F(xiàn)e₃O₄作為磁性材料，SiO₂為致孔劑，環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)，合成多孔磁性殼聚糖微球；多孔磁性殼聚糖微球以環(huán)氧氯丙烷為活化劑，以亞氨基二乙酸為螯合配基，再與過(guò)渡態(tài)的金屬銅離子進(jìn)行螯合，制備的得到多孔磁性銅離子金屬螯合載體。

本發(fā)明還提供一種多孔磁性銅離子金屬螯合載體的制備方法，所述方法以殼聚糖粉末為原料，F(xiàn)e₃O₄作為磁性材料，SiO₂為致孔劑，環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)，合成多孔磁性殼聚糖微球；然后，以環(huán)氧氯丙烷為活化劑，以亞氨基二乙酸為螯合配基，再與過(guò)渡態(tài)的金屬銅離子進(jìn)行螯合，制備得到多孔磁性銅離子金屬螯合載體。

進(jìn)一步，所述制備方法包括以下步驟：

步驟a，多孔磁性殼聚糖微球載體的制備，向殼聚糖粉末中，加入乙酸溶液，室溫下緩慢攪拌至殼聚糖完全溶解后；加入納米Fe₃O₄，攪拌至均勻，加入致孔劑SiO₂，攪拌幾分鐘后，加入液體石蠟，攪拌后升溫至50℃，滴加Span80作為乳化劑，乳化至形成殼聚糖液滴，隨后升溫70℃至溫度恒定，調(diào)節(jié)溶液pH值為9-11，保持為堿性，緩慢的逐滴滴加環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行洗滌，直至pH值為中性，然后加入NaOH的溶液，80℃的加熱2h，停止加熱后，反復(fù)使用蒸餾水進(jìn)行洗滌，再用稀鹽酸洗滌一次，最后蒸餾水洗至中性，得到多孔磁性殼聚糖微球載體，烘干后備用；

步驟b，多孔磁性殼聚糖微球載體的活化，向步驟a中制得的多孔磁性殼聚糖微球中，加入NaOH溶液和環(huán)氧氯丙烷，以及二甲亞砜和硼氫化鈉，在40℃恒溫反應(yīng)4h；活化反應(yīng)后，用去離子水洗滌，去除未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉；

步驟c，多孔磁性銅離子金屬螯合載體的制備，向活化好的多孔磁性殼聚糖微球載體中，加入Na₂CO₃溶液，再加入亞氨基二乙酸，40℃恒溫反應(yīng)10h；然后將反應(yīng)產(chǎn)物分散于CuCl₂溶液中，25℃恒溫反應(yīng)24h，得到多孔磁性銅離子金屬螯合載體。

進(jìn)一步，步驟a中乙酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％。

進(jìn)一步，步驟b中二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)為6％。

進(jìn)一步，步驟b中氫氧化鈉溶液的濃度為0.6mol/L。

進(jìn)一步，步驟b中環(huán)氧氯丙烷的體積分?jǐn)?shù)為45％。

本發(fā)明還提供一種利用多孔磁性銅離子金屬螯合載體固定化木瓜酶的方法，向多孔磁性銅離子金屬螯合載體中，加入木瓜蛋白酶溶液，室溫下振蕩3h，用PBS洗滌數(shù)次至上清中檢測(cè)不到酶活，得到固定化的木瓜蛋白酶。

本發(fā)明還提供一種利用上述方法制得的固定化木瓜酶在大豆分離蛋白水解中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述應(yīng)用為將大豆分離蛋白溶于水中，形成底物濃度為4％的水分散液，在80℃水浴鍋中保溫20min。迅速冷卻至酶解溫度，攪拌30min，調(diào)節(jié)pH至8，按底物比例加入6000-9000U/g的固定化木瓜蛋白酶，緩慢攪拌反應(yīng)至少4h。

總之，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，利用此載體制得的固定化酶催化效率高，還可用于大規(guī)模生產(chǎn)，制得的固定化酶可以回收重復(fù)利用，大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)本發(fā)明利用該載體制得的固定化木瓜酶在大豆蛋白的分離水解中效果很好。

附圖說(shuō)明

圖1是二甲基亞砜對(duì)環(huán)氧基密度的影響。

圖2是反應(yīng)溫度對(duì)環(huán)氧基密度的影響。

圖3是反應(yīng)時(shí)間對(duì)環(huán)氧基密度的影響。

圖4是環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)對(duì)環(huán)氧基密度的影響。

圖5是NaOH溶液濃度對(duì)環(huán)氧基密度的影響。

圖6是溫度對(duì)木瓜蛋白酶固定化的影響。

圖7是給酶量對(duì)木瓜蛋白酶固定化的影響。

圖8是pH對(duì)木瓜蛋白酶固定化的影響。

圖9是固定化時(shí)間對(duì)酶固定化的影響。

圖10是溫度對(duì)水解度的影響。

圖11是pH對(duì)水解度的影響。

圖12是時(shí)間對(duì)水解度的影響。

圖13是底物濃度對(duì)水解度的影響。

圖14是給酶量對(duì)水解度的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

一、多孔磁性銅離子金屬螯合載體的制備

1.多孔磁性殼聚糖微球載體(PCMM)的制備

稱取1g的殼聚糖粉末于250mL的四頸瓶中，加入25mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液，室溫下緩慢攪拌至殼聚糖完全溶解后，加入0.3g納米Fe₃O₄，攪拌至均勻，加入致孔劑Si0₂，攪拌幾分鐘后，加入100mL的液體石蠟，打開攪拌器(300r/min)，攪拌一段時(shí)間后升溫至50℃，滴加幾滴Span80作為乳化劑，乳化一定的時(shí)間，直至形成細(xì)小的殼聚糖液滴，隨后升溫70℃至溫度恒定，滴加2mol/L的NaOH溶液，使溶液pH調(diào)至9-11的范圍，保持為堿性，緩慢的逐滴滴加4mL的環(huán)氧氯丙烷(ECH)。反應(yīng)5h后，停止反應(yīng)，待溫度冷卻到室溫，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇、丙酮洗滌多次，最后用蒸餾水反復(fù)洗至pH值為中性。加入適量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％NaOH的溶液，放入80℃的水浴鍋中，加熱2h，停止加熱后，反復(fù)使用蒸餾水進(jìn)行洗滌，再用適量的稀鹽酸洗滌一次，最后蒸餾水洗至中性。將制得的多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)放于50℃的真空干燥箱中至恒重、備用。

2.多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)活化工藝研究

稱取0.5g多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)放入錐形瓶中，加入適量的1mol/L的NaOH溶液和一定量的體積分?jǐn)?shù)45％的環(huán)氧氯丙烷(ECH)，以及適量的體積分?jǐn)?shù)為6％的二甲亞砜(DMSO)和一定量的硼氫化鈉，在40℃的恒溫水浴搖床中反應(yīng)4h。

PCMM經(jīng)活化反應(yīng)后，用大量的去離子水進(jìn)行洗滌，去除未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉。洗滌液中殘留的環(huán)氧基和氫氧根用以下方法進(jìn)行檢測(cè)：量取約2mL洗滌液，加入1滴酚酞指示劑，振蕩后溶液不變紅，則氫氧根已清洗干凈；量取約2mL洗滌液，加入1滴酚酞指示劑，再加入2mL 1.3mol/L硫代硫酸鈉溶液，劇烈振蕩后溶液不變紅，則表明殘留的環(huán)氧基已被清洗干凈。

2.1多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)環(huán)氧基活化密度的測(cè)定

多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)的環(huán)氧基活化密度通常采用硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定，將活化好的微球用布氏漏斗抽干，稱取0.5g的微球于25mL的錐形瓶中，并加入適量的1.3mol/L硫代硫酸鈉和酚酞指示劑1-2滴，在室溫下放在恒溫震蕩器中反應(yīng)0.5h，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mol/L)進(jìn)行滴定，直至溶液由紅色變?yōu)闊o(wú)色，停止滴定，并記錄滴定前后消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。根據(jù)環(huán)氧基與硫代硫酸鈉反應(yīng)并釋放出OH^-，以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液中和滴定OH^-，即可得出每克多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)上包含的環(huán)氧基的量，即環(huán)氧基密度。環(huán)氧基活化密度計(jì)算公式如下：

式中：

S-環(huán)氧基修飾密度，mmol·g^-1；

C_HCl-標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液濃度，mol·L^-1；

V_a-滴定前標(biāo)準(zhǔn)HCl的體積，mL；

V_b-滴定后標(biāo)準(zhǔn)HCl的體積，mL；

M-活化微球質(zhì)量，g。

2.2多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)最佳活化工藝條件的確定

(1)二甲基亞砜(DMSO)體積分?jǐn)?shù)對(duì)微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度30℃，NaOH溶液濃度為0.4mol·L^-1，環(huán)氧氯丙烷(ECH)體積分?jǐn)?shù)35％，活化反應(yīng)時(shí)間3h，按上述方法活化后計(jì)算環(huán)氧基密度值，結(jié)果如圖1所示PCMM活化反應(yīng)的最佳二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)為6％。

(2)反應(yīng)溫度對(duì)微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為35％，二甲亞砜(DMSO)體積分?jǐn)?shù)6％，活化時(shí)間為3h，NaOH溶液濃度為0.4mol·L^-1，測(cè)定方法同上，如圖2所示PCMM活化反應(yīng)的最佳溫度為40℃。

(3)活化時(shí)間對(duì)微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度40℃，環(huán)氧氯丙烷(ECH)體積分?jǐn)?shù)為35％，二甲亞砜(DMSO)體積分?jǐn)?shù)6％，NaOH溶液濃度為0.4mol·L^-1，測(cè)定方法同上，結(jié)果如圖3所示PCMM活化反應(yīng)的最佳時(shí)間為4h。

(4)環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)對(duì)微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度40℃，NaOH溶液濃度為0.6mol.L^-1，二甲亞砜(DMSO)體積分?jǐn)?shù)4％，活化反應(yīng)時(shí)間4h，測(cè)定方法同上，結(jié)果如圖4所示PCMM活化反應(yīng)的最佳環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為45％。

(5)氫氧化鈉溶液濃度對(duì)微球環(huán)氧基活化密度的影響

固定活化溫度40℃，環(huán)氧氯丙烷(ECH)體積分?jǐn)?shù)為45％，二甲亞砜(DMSO)體積分?jǐn)?shù)6％，活化反應(yīng)時(shí)間4h，測(cè)定方法同上，結(jié)果如圖5所示PCMM活化反應(yīng)的最佳NaOH溶液濃度為0.6mol·L^-1。

選取上述最優(yōu)條件活化后的多孔磁性殼聚糖微球(PCMM)表面上的環(huán)氧基密度最高0.268mmol·g^-1。

3.PCMM-IDA-Cu²⁺金屬螯合載體的制備

稱取0.5g活化好的PCMM放入錐形瓶里，加入50mL2mol/L Na₂CO₃溶液，再加入0.4g的IDA，放入40℃的恒溫水浴搖床中反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后，用大量的蒸餾水沖洗，浸泡過(guò)夜，再水洗，用磁鐵進(jìn)行分離收集產(chǎn)物，放入50℃的烘箱中烘干、備用。稱取15mg的PCMM-IDA分散于30mL 0.5mg/mL的CuCl₂溶液中，放入25℃ 250r/min的恒溫振蕩器反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用大量的蒸餾水反復(fù)沖洗，即制得PCMM-IDA-Gu²⁺載體。

二、固定化木瓜酶

稱取一定量的PCMM-IDA-Cu²⁺多孔磁性金屬螯合載體，置于50mL的碘量瓶中，加入適量的1mg/mL的木瓜蛋白酶溶液(溶于0.1mol/L磷酸緩沖液，pH＝7.0)，室溫下振蕩4h，用0.1mol/LPBS洗滌數(shù)次至上清中檢測(cè)不到酶活，即得固定化的木瓜蛋白酶，放于4℃的冰箱中保存，備用。

固定化過(guò)程如下：

1.酶蛋白固載量的測(cè)定

用0.1mol/L的PBS緩沖液(pH＝7.0)配制1mg/mL的木瓜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)液，取7支25mL的比色管并編號(hào)，按表3-1加入1mg/mL的木瓜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，配制成不同濃度的木瓜蛋白酶溶液。

表3-1不同濃度的木瓜蛋白溶液

Tab.3-1 Papain solution of different concentration

用蒸餾水定容至25mL，充分搖勻，靜置10min，以0號(hào)比色管為參比，通過(guò)紫外分光光度計(jì)掃描測(cè)得其最佳波長(zhǎng)λ為278nm。在此波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD₂₇₈。以木瓜蛋白酶濃度為橫坐標(biāo)，吸光值OD₂₇₈為縱坐標(biāo)，繪制木瓜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程為y＝1.416x+0.0037(R²＝0.9999)

樣品中木瓜蛋白酶固載量的測(cè)定：酶固載量是原始加入的酶量減去剩余酶液(上清液和洗脫液的混合液)的酶量得到的。取適量的樣品待測(cè)液，在波長(zhǎng)為278nm處用測(cè)其吸光度，通過(guò)木瓜蛋白酶溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測(cè)液中的酶蛋白的濃度。根據(jù)下式計(jì)算木瓜蛋白酶的固載量Q_e：

式中，Q_e：酶固定量(mg/g)；C₀：固定前溶液中酶含量(mg/mL)；

C_e：固定后溶液中酶含量(mg/mL)；C₁：PBS洗滌液中酶含量(mg/mL)；

V₀：固定化所用酶溶液體積(mL)；V₁：所用PBS洗滌液體積(m L)；

m：用于固定化酶多孔磁性金屬螯合載體的質(zhì)量(g，干重)

2.酶活性的測(cè)定方法

游離酶活性的測(cè)定方法：將一定量的木瓜蛋白酶溶于0.1mol/L PBS(pH＝7.0)的緩沖溶液中，配成1mg/mL的酶液。在碘量瓶中加入1mL的木瓜蛋白酶溶液，再加入5mL的酶激活劑(內(nèi)合5mmol/L的L-半胱氨酸和2mmol/L 乙二胺四乙酸)，在37℃水浴中，預(yù)熱10min后，再加入5mL的5％的底物酪蛋白溶液，在37℃水浴中，反應(yīng)10min，然后迅速加入10mL5％的三氯乙酸溶液(TCA)，終止反應(yīng)，劇烈搖動(dòng)混合均勻后，在37℃水浴中放置30min后，進(jìn)行離心分離，然后用紫外分光光度計(jì)在275nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算木瓜蛋白酶活力?？瞻讓?duì)照組在加入木瓜蛋白酶溶液之前，先加入10mL 5％TCA，其余步驟相同。

固定化酶活力測(cè)定方法：取等當(dāng)量的固定化木瓜蛋白酶加入5mL的酶激活劑(內(nèi)含5mmol/L的L-半胱氨酸和2mmol/L 乙二胺四乙酸)，在37℃水浴中，預(yù)熱10min后，再加入5mL的5％的底物酪蛋白溶液，在37℃水浴中，反應(yīng)10min，然后迅速加入10mL 5％的三氯乙酸溶液(TCA)，終止反應(yīng)，劇烈搖動(dòng)混合均勻后，在37℃水浴中放置30min后，進(jìn)行離心分離，然后用紫外分光光度計(jì)在275nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算固定化木瓜蛋白酶活力?？瞻讓?duì)照組在加入木瓜蛋白酶溶液之前，先加入10mL 5％TCA，其余步驟相同。酶活力的計(jì)算公式為：

式中：

A：樣品溶液中的吸光度值；

AO：對(duì)照溶液的吸光度值；

V：反應(yīng)溶液的總體積mL；

t：反應(yīng)時(shí)間min；

N：稀釋倍數(shù)；

K：L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

M：樣品的重量(mg)。

3.固定化條件優(yōu)化

(1)固定化溫度對(duì)酶固定化的影響

平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，在其它固定化條件相同的情況下，改變固定化溫度分別為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，然后制備固定化酶，探討溫度對(duì)酶固定化的影響。

結(jié)果如圖6所示，PCMM-IDA-Cu²⁺載體的最佳酶固定化溫度為30℃。

(2)給酶量對(duì)酶固定化的影響

平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，在其它固定化條件相同的情況下，分別加入不同量的木瓜蛋白酶，使給酶量為0.5mg/15.0mg載體、1.0mg/15.0mg載體、1.5mg/15.0mg載體、2.0mg/15.0mg載體和2.5mg/15.0mg載體，然后制備固定化酶，探討給酶量對(duì)酶固定化的影響。

結(jié)果如圖7所示PCMM-IDA-Cu²⁺載體的最佳給酶量是1.5mg/15mg。

(3)pH對(duì)酶固定化的影響

配置一系列濃度為0.1mg/mL的木瓜蛋白酶溶液，用不同pH緩沖液(pH＝4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，分別加入25mL上述不同pH值的木瓜蛋白酶溶液，在其它固定化條件相同的情況下，然后制備固定化酶，探討pH對(duì)酶固定化效果的影響。

結(jié)果如圖8所示，PCMM-IDA-Cu²⁺載體最佳的緩沖溶液pH值為7。

(4)固定化時(shí)間對(duì)酶固定化的影響

平行取多孔磁性金屬螯合載體15.0mg多份，改變固定化時(shí)間分別為1h、2h、3h、4h、5h和6h，在其它固定化條件相同的情況下，然后制備固定化酶，探討固定化時(shí)間對(duì)酶固定化的影響。

結(jié)果如圖9所示，PCMM-IDA-Cu²⁺載體對(duì)木瓜蛋白酶最佳的固定化時(shí)間為4h。

在如上述最佳的固定化條件下進(jìn)行3次重復(fù)批次試驗(yàn)進(jìn)行酶的固定化活性驗(yàn)證，得到PCMM-IDA-Cu²⁺載體的平均固定化酶活為7.885U/mg，測(cè)得的酶的固載量94.18mg/g，酶活力回收率達(dá)到87.21％。

三、大豆分離蛋白水解的應(yīng)用

將適量的大豆分離蛋白溶于水中，形成不同底物濃度的水分散液，在85℃水浴鍋中保溫20min。迅速冷卻至酶解溫度，攪拌30min，調(diào)節(jié)pH至一定值，加入一定量的固定化木瓜蛋白酶，緩慢攪拌反應(yīng)一定的時(shí)間。反應(yīng)過(guò)程中以0.1

mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，保持溶液pH變動(dòng)范圍在±0.1內(nèi)，同時(shí)記錄水解過(guò)程消耗的堿液量。水解結(jié)束后，酶解液在沸水中維持10min進(jìn)行滅酶，然后迅速冷卻至室溫，在10000r/min下離心分離10min。傾倒出上清液，記錄總體積。

大豆分離蛋白水解度的測(cè)定方法

由于pH-stat法操作簡(jiǎn)單，快速，可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用pH-stat法，測(cè)定大豆分離蛋白的水解度，公式如下^[130]：

式中：V：NaOH消耗量，mL；C：NaOH濃度，mol/L，α：大豆分離蛋白氨基的平均解離度，α＝10pH-pK/(1+10pH-pK)，pK大豆分離蛋白α-氨基的pK值；m：樣品中蛋白質(zhì)的重量；h_tot：每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，大豆分離蛋白h_tot＝7.75。

(1)溫度對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響

先取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％，進(jìn)行預(yù)處理(85℃、20min)，pH 8，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的條件下，進(jìn)行酶解試驗(yàn)，反應(yīng)2h時(shí)間，之后分別對(duì)水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測(cè)定上清液的水解度。結(jié)果如圖10所示。

(2)pH對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響

先取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％，進(jìn)行預(yù)處理(85℃、20min)，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度70℃，pH分別調(diào)至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，進(jìn)行酶解試驗(yàn)，反應(yīng)2h時(shí)間，之后分別對(duì)水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測(cè)定上清液的水解度。結(jié)果如圖11所示。

(3)水解時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響

取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％，進(jìn)行預(yù)處理(85℃、20min)，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度70℃，pH 8.0，水解時(shí)間分別為1h、2h、3h、4h、5h、6h進(jìn)行酶解試驗(yàn)，之后分別對(duì)水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測(cè)定上清液的水解度。結(jié)果如圖12所示。

(4)底物濃度對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響

取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2％、3％、4％、5％、6％，進(jìn)行預(yù)處理(85℃、20min)，固定化木瓜蛋白酶添加量5000U/g，溫度70℃，pH 8.0，水解時(shí)間2h，進(jìn)行酶解試驗(yàn)，之后分別對(duì)水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測(cè)定上清液的水解度。結(jié)果如圖13所示。

(5)給酶量對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響

取適量的大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％，進(jìn)行預(yù)處理(85℃、20min)，溫度70℃，pH 8.0，固定化木瓜蛋白酶添加量分別為3000U/g、4000U/g、5000U/g、6000U/g、7000U/g、8000U/g、9000U/g，水解時(shí)間2h，進(jìn)行酶解試驗(yàn)，之后分別對(duì)水解產(chǎn)物離心分離，取上清液，采用pH-stat法，測(cè)定上清液的水解度。結(jié)果如圖14所示。

本發(fā)明雖然已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并不是用來(lái)限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出可能的變動(dòng)和修改，因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做出的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化及修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。