本發(fā)明涉及一種以脂質(zhì)體作為介質(zhì)，快速對界面進(jìn)行親和素修飾的方法。本發(fā)明屬于納米界面材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

以單個(gè)酶分子為研究對象的單分子酶學(xué)領(lǐng)域是科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。通常情況下，單分子酶學(xué)研究采取某種方法將單分子酶進(jìn)行固定，并利用單分子熒光顯微鏡實(shí)時(shí)記錄酶在催化過程中產(chǎn)生的熒光信號的強(qiáng)度變化，從而重構(gòu)出單個(gè)酶分子催化過程中的獨(dú)特的動(dòng)態(tài)過程。單分子酶學(xué)以微觀的視角，揭示了隱藏在整體平均水平下，單個(gè)酶分子與底物作用時(shí)的動(dòng)態(tài)波動(dòng)，加深了人們對不同反應(yīng)體系的理解，因而自誕生以來受到生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

在單分子酶學(xué)研究中，需要對所研究對象進(jìn)行長期觀察得到足夠豐富的催化信息，因而酶在界面上的固定十分重要。通常情況下，最簡便的方法是采用將界面進(jìn)行親和素修飾（streptavidin）后，將生物素化的酶分子進(jìn)行固定。如將帶有生物素的牛血清蛋白（biotin-BSA）或聚乙二醇（biotin-PEG）與界面進(jìn)行孵育后，固定親和素（avidin），進(jìn)而固定生物素化的酶分子。以上方法已在單分子研究中進(jìn)行廣泛的應(yīng)用，然而，該方法費(fèi)時(shí)繁瑣，并且由于BSA及PEG易于團(tuán)聚，在修飾過程中容易出現(xiàn)修飾不均勻、界面封閉不完全的現(xiàn)象。同時(shí)在用生物素化聚乙二醇進(jìn)行修飾時(shí)，需提前對玻璃進(jìn)行硅烷化修飾，易造成玻璃表面的雜質(zhì)團(tuán)聚，影響對單分子熒光的觀測。因而需要開發(fā)一種簡便、均勻并且背景干凈的界面修飾方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種基于脂質(zhì)體的對界面快速修飾親和素的方法，以脂質(zhì)體作為介質(zhì)，在玻片表面進(jìn)行親和素修飾的方法。該方法具有快速、簡便、修飾均勻且界面干凈平整的特點(diǎn)。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，以1，2-二油酰基磷脂酰膽堿（DOPC）為主，加入生物素化的磷脂酰乙醇胺，合成帶有生物素的脂質(zhì)體，以此脂質(zhì)體孵育玻片，并隨后再孵育親和素，即得到修飾好親和素的玻片。

一種基于脂質(zhì)體的對界面快速修飾親和素的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將一定量的磷脂與生物素化的磷脂酰乙醇混合，加入氯仿攪拌均勻后超聲，通入流通的氮?dú)獯蹈?，并真空干燥除去殘余的有機(jī)溶劑；隨后加入中性溶液促使磷脂膜重新水化，利用擠壓器配以不同尺寸孔徑的膜擠壓多次后可形成尺寸不等的脂質(zhì)體；

（2）玻片分別用洗劑、超純水、丙酮、氫氧化鈉溶液和超純水清洗干凈后，放入1%氫氟酸溶液中浸泡數(shù)十秒后，用純水洗凈，氮?dú)獯蹈?；玻片放于干凈的器皿中，滴加一定量合成的脂質(zhì)體，以高于相變溫度孵育若干分鐘后，用超純水洗凈過量的脂質(zhì)體；隨后，加入親和素孵育若干分鐘后，用超純水或溶液洗去過量的親和素，即可得到表面修飾有親和素的玻璃界面。

所用的磷脂為1，2-二油?；字Ｄ憠A（DOPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（DMPC）、二亞油酰磷脂酰膽堿（DLPC）、二花生?；字Ｄ憠A（DAPC）磷脂酰膽堿中的一種或其組合。

合成的脂質(zhì)體粒徑大小為50~200 nm。

所用的親和素為鏈霉親和素。

磷脂與生物素化的磷脂酰乙醇的比例在80:1-120:1。

根據(jù)所修飾的玻璃尺寸，一般滴加合成的脂質(zhì)體的體積在50-300微升。

脂質(zhì)體高于相變溫度與玻片孵育5-10 min，孵育期間脂質(zhì)體不能干燥。

該方法通過控制條件可以制備不同尺寸的帶有生物素的脂質(zhì)體，在孵育親和素后，可得到修飾有親和素的界面。該方法修飾步驟簡便、快速，修飾均勻、封閉完全，并且由于修飾過程中不引入硅烷化等試劑，背景干擾較小。所制備的界面能滿足單分子酶學(xué)研究的要求。

本發(fā)明的特點(diǎn)在于：本發(fā)明以脂質(zhì)體作為介質(zhì)在玻璃界面修飾親和素，所用材料生物相容性好，且僅在界面表面只鋪一層脂質(zhì)體，界面修飾均勻，封閉完全。本發(fā)明修飾方法簡便，操作簡單，節(jié)省時(shí)間，背景干凈，降低了背景信號對靶標(biāo)單分子熒光的干擾。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1所制備的脂質(zhì)體的粒徑圖。

圖2為實(shí)施例1所制備的脂質(zhì)體的原子力顯微鏡成像圖。

圖3為實(shí)施例1所制備的親和素玻璃界面的熒光顯微鏡成像圖。

圖4為實(shí)施例1所制備的親和素修飾的界面孵育生物素標(biāo)記Cy5熒光分子后的熒光顯微鏡成像圖。

圖5為實(shí)施例2所制備的脂質(zhì)體的粒徑圖。

圖6為實(shí)施例2圖4 實(shí)施案例2所制備的親和素修飾的界面孵育標(biāo)記綠色熒光及生物素納米小球后的熒光顯微鏡成像圖。

圖7為實(shí)施例3所制備的脂質(zhì)體的粒徑圖。

圖8為實(shí)施例1所制備的親和素修飾的界面孵育atto-488熒光及生物素標(biāo)記的DNA后的熒光顯微鏡成像圖。

具體實(shí)施方式

通過以下具體的實(shí)施案例對本發(fā)明的技術(shù)作進(jìn)一步描述。以下的實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：

將 DOPC與生物素化的磷脂酰乙醇以100:1的比例溶解于5 mL氯仿中，混合均勻后，加入流動(dòng)的氮?dú)獯蹈桑S后真空干燥3 hr除去殘余的有機(jī)溶劑。在所得的磷脂中1 mL加入PBS（pH=7.4）使單層磷脂水化，終濃度達(dá)到 5 mg/mL。采用帶有50 nm孔徑濾膜的擠壓器擠壓20次，即可得到帶有生物素的脂質(zhì)體。玻片分別用洗劑、超純水超聲10分鐘，隨后丙酮、氫氧化鈉溶液超聲30分鐘后，超純水沖洗干凈后，放入1%氫氟酸溶液中浸泡約30秒后，用超純水洗凈，氮?dú)獯蹈纱谩２ＡП砻尜N上圍欄，將100 μL所制備的脂質(zhì)體加入圍欄里，隨后在45℃孵育10分鐘。隨后，采用PBS置換20次，洗凈過量的脂質(zhì)體。在圍欄中加入0.2 mg/mL親和素孵育10分鐘后，用PBS置換20次，洗去過量的親和素，即可得到表面修飾有親和素的玻璃界面。將100 pM生物素化的熒光分子Cy5與修飾了親和素的玻璃孵育10分鐘后，采用PBS置換20次洗去溶液中游離的熒光分子，利用熒光顯微鏡觀測。圖1為所制備的脂質(zhì)體的粒徑分布圖，由圖可見，脂質(zhì)體粒徑大概為75 nm。同時(shí)圖2表明脂質(zhì)體在界面上可形成平整均勻的膜。由圖3可見，561 nm激光照射下，單純只修飾了親和素的玻璃界面背景非常干凈。同時(shí)由圖4可見，親和素玻璃界面可以觀測到界面修飾的cy3熒光分子，因而可以被利用進(jìn)行對單分子酶或底物的固定并進(jìn)行單分子研究。

實(shí)施例2：

將 DOPC與生物素化的磷脂酰乙醇胺以100:1的比例溶解于5 mL氯仿中，混合均勻后，加入流動(dòng)的氮?dú)獯蹈桑S后真空干燥3 hr除去殘余的有機(jī)溶劑。在所得的磷脂中加入 1 mL PBS（pH=7.4）使單層磷脂水化，終濃度達(dá)到 5 mg/mL。采用帶有100 nm孔徑濾膜的擠壓器擠壓20次，即可得到帶有生物素的脂質(zhì)體。玻片分別用洗劑、超純水超聲10分鐘，隨后丙酮、氫氧化鈉溶液超聲30分鐘后，超純水沖洗干凈后，放入1%氫氟酸溶液中浸泡約30秒后，用超純水洗凈，氮?dú)獯蹈纱?。玻璃表面貼上圍欄，將100 μL所制備的脂質(zhì)體加入圍欄里，隨后在45℃孵育10分鐘。隨后，采用PBS置換20次，洗凈過量的脂質(zhì)體。在圍欄中加入0.2 mg/mL親和素孵育10分鐘后，用PBS置換20次，洗去過量的親和素，即可得到表面修飾有親和素的玻璃界面。將稀釋10⁶倍生物素標(biāo)記的綠色熒光小球與修飾了親和素的玻璃孵育3分鐘后，采用PBS置換20次洗去溶液中游離的熒光小球，利用熒光顯微鏡觀測。圖5為實(shí)施案例2所制備的脂質(zhì)體的粒徑分布圖，由圖可見，脂質(zhì)體粒徑大概為100 nm。同時(shí)由圖6可見，親和素玻璃界面可以進(jìn)一步結(jié)合生物素修飾的綠色熒光小球，因而可以被利用進(jìn)行對單分子酶或底物的固定并進(jìn)行單分子研究。

實(shí)施例3：

將 DOPC與生物素化的磷脂酰乙醇胺以100:1的比例溶解于5 mL氯仿中，混合均勻后，加入流動(dòng)的氮?dú)獯蹈?，隨后真空干燥3 hr除去殘余的有機(jī)溶劑。在所得的磷脂中加入PBS（pH=7.4）使單層磷脂水化，終濃度達(dá)到 5 mg/mL。采用帶有200 nm孔徑濾膜的擠壓器擠壓20次，即可得到帶有生物素的脂質(zhì)體。玻片分別用洗劑、超純水超聲10分鐘，隨后丙酮、氫氧化鈉溶液超聲30分鐘后，超純水沖洗干凈后，放入1%氫氟酸溶液中浸泡約30秒后，用超純水洗凈，氮?dú)獯蹈纱?。玻璃表面貼上圍欄，將100 μL所制備的脂質(zhì)體加入圍欄里，隨后在45℃孵育10分鐘。隨后，采用PBS置換20次，洗凈過量的脂質(zhì)體。在圍欄中加入0.2 mg/mL親和素孵育10分鐘后，用PBS置換20次，洗去過量的親和素，即可得到表面修飾有親和素的玻璃界面。將10 pM 同時(shí)標(biāo)記atto-488熒光分子與生物素的DNA與修飾了親和素的玻璃孵育10分鐘后，采用PBS置換20次洗去溶液中游離的熒光分子，利用熒光顯微鏡觀測。圖7為實(shí)施案例3所制備的脂質(zhì)體的粒徑分布圖，由圖可見，脂質(zhì)體粒徑大概為200 nm。由圖8可見，親和素玻璃界面可以進(jìn)一步結(jié)合生物素及atto-488修飾的DNA，因而可以被利用進(jìn)行對單分子酶或底物的固定并進(jìn)行單分子研究。