本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及針對(duì)融合表達(dá)標(biāo)簽谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶(siGST)活性位點(diǎn)的不可逆親和標(biāo)記試劑，及將此親和標(biāo)記試劑偶聯(lián)到微納米材料表面后對(duì)GST融合蛋白實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)選擇性固定化的應(yīng)用。此GST親和標(biāo)記試劑的設(shè)計(jì)，是針對(duì)GST活性中心的H位點(diǎn)設(shè)計(jì)大體積疏水配基并在合適位置添加高反應(yīng)活性的基團(tuán)，使其與GST活性位點(diǎn)結(jié)合后與活性位點(diǎn)附近特定官能團(tuán)形成共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)不可逆親和標(biāo)記；將此親和標(biāo)記試劑偶聯(lián)到微納米材料表面且保留其親和標(biāo)記活性則能實(shí)現(xiàn)GST融合表達(dá)蛋白活性位點(diǎn)之外的位點(diǎn)選擇性固定化，制備蛋白功能化的微納米材料。

背景技術(shù)：

蛋白功能化材料包括固定化蛋白的微整列芯片、微納米材料等，在蛋白質(zhì)生物技術(shù)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，如生物分子高通量篩選、蛋白pull-down、微流體催化等[Nat Chem.2016，8：103-113]。相對(duì)于DNA固定化，蛋白固定化面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)主要在于如何控制其連接反應(yīng)的位點(diǎn)選擇性和蛋白取向一致性從而盡可能保留被固定蛋白的活性。顯然，必須蛋白位點(diǎn)選擇性固定化，而且為了形成穩(wěn)定的加合物，位點(diǎn)選擇性共價(jià)固定化的思路更有吸引力。

微納米材料是指直徑在1nm～100μm的微球(微囊)和厚度在1nm～100μm的薄膜，包括但不限于微納米磁珠和蛋白共價(jià)加合物/蛋白聚合物顆?！，F(xiàn)有在微納米材料表面的蛋白位點(diǎn)選擇性固定化策略包括：1)基于標(biāo)簽的固定化如GST標(biāo)簽、HaloTag標(biāo)簽、His標(biāo)簽等與親和標(biāo)記試劑反應(yīng)[Bioconjug Chem.2014，25(10)：1902-1909]；2)靶酶工程化氨基酸經(jīng)酶催化或高選擇性化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鏈接，如點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)；3)基于生物素鏈親和素高親和力結(jié)合等非共價(jià)固定化[Nat Commun.2016，7：13128；Molecules.2016，21(10)：1370；Chem Rev.2015，115(5)：2174-2195；Pharm Res.2011，28(7)：1480-1499；Biomacromolecules.2007，8(6)：1775-1789]。不同應(yīng)用常需不同固定化方法?；诖胖楣潭ɑ械鞍?，“聯(lián)用磁分離與色譜分析測(cè)定混合物中配體親和力的方法”[中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL200810237298.2]，有望用于液相組合合成混合物庫(kù)和天然藥物提取物中發(fā)現(xiàn)高親和力配體為先導(dǎo)配體，但需特殊的蛋白質(zhì)固定化策略。

GST融合表達(dá)標(biāo)簽(sjGST)適于親和純化靶蛋白并具有一定的增溶能力，被廣泛應(yīng)用于真核靶蛋白在原核系統(tǒng)大量低成本可溶表達(dá)及純化。基于sj GST的自催化或化學(xué)固定化策略均有報(bào)道[Bioconjug Chem.2014，25(11)：1911-1915；Bioconjug Chem.2014，25(10)：1902-1909；Bioconjug Chem.2013，24(4)：571-577；Bioconjug Chem.2013，24(8)：1295-1301；J Org Chem.2013，78(19)：9647-9658；J Am Chem Soc.2004，126(38)：12047；J Am Chem Soc.2003，125(26)：7810-7811；Bioconjug Chem.2005，16(4)：1009-1018]。但值得注意的是，GST是二聚體，有兩個(gè)大體積的疏水結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)配體選擇性低；目前所見(jiàn)基于sjGST的固定化方法中，并未實(shí)現(xiàn)完全封閉其疏水結(jié)合位點(diǎn)，所得功能材料將面臨疏水小分子的非特異性結(jié)合，不適用于篩選小分子配體庫(kù)。本發(fā)明設(shè)計(jì)sjGST不可逆親和標(biāo)記試劑并盡可能封閉二聚體中雙活性中心的疏水位點(diǎn)，使基于sjGST的磁珠固定化靶蛋白也適用于小分子配體庫(kù)篩。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明設(shè)計(jì)標(biāo)簽GST的疏水大體積親和標(biāo)記試劑，偶聯(lián)到微納米材料表面后用于親和標(biāo)記固定化GST融合蛋白，同時(shí)采用特殊策略封閉其二聚體中兩個(gè)活性中心的疏水位點(diǎn)以避免功能化材料對(duì)疏水小分子的結(jié)合。本發(fā)明內(nèi)容如下：

1.N-(對(duì)甲氧基苯氧乙基)-(N-對(duì)位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸類(lèi)標(biāo)簽GST的單價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，其與標(biāo)記活性對(duì)應(yīng)的顯著結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是包括至少四種功能基，其對(duì)應(yīng)作用在于：

(1)引導(dǎo)親和標(biāo)記試劑進(jìn)入活性位點(diǎn)疏水腔的對(duì)甲氧基苯氧乙基，也稱(chēng)為疏水定位基；

(2)與活性中心附近巰基、胺基發(fā)生親核取代反應(yīng)的修飾基團(tuán)，包括但不限于1-鹵代乙酰基、丙烯?；?、N-烷基馬來(lái)酰亞胺基、乙烯磺?；?；

(3)將親和標(biāo)記試劑偶聯(lián)到微納米材料表面的偶聯(lián)功能基，包括但不限于甘氨酸、β-氨基丙酸，γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸，以其羧基與材料表面氨基偶聯(lián)；

(4)疏水定位、修飾功能基及偶聯(lián)功能基之間的連接骨架功能基，包括但不限于對(duì)氨基苯甲酰基、6-氨基己酰基、γ-谷氨?；⒓皩?duì)氨基苯甲?；陌被c所述氨基酸形成的酰胺衍生物，以其氨基與修飾基團(tuán)相連而酰基與偶聯(lián)基團(tuán)的氨基相連；

2.據(jù)權(quán)利要求1所述(N-對(duì)甲氧基苯氧乙基)-(N-對(duì)位取代酰胺基苯甲?；?甘氨酸類(lèi)標(biāo)簽GST單價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，其應(yīng)用特征在于經(jīng)微納米材料表面氨基與單價(jià)標(biāo)記試劑偶聯(lián)功能基中羧基成酰胺鍵偶聯(lián)后用于親和標(biāo)記固定化GST融合蛋白，使親和標(biāo)記試劑疏水定位基進(jìn)入GST活性位點(diǎn)疏水腔，借助連接基團(tuán)的柔韌性，使修飾基團(tuán)能對(duì)活性中心附近巰基或氨基能實(shí)現(xiàn)共價(jià)修飾，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)GST不可逆親和標(biāo)記；

3.據(jù)權(quán)利要求1所述(N-對(duì)甲氧基苯氧乙基)-(N-對(duì)位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸類(lèi)標(biāo)簽GST的單價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，其特征在于：所述單價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，通過(guò)偶聯(lián)功能基中羧基與二乙基三胺或二丙基三胺的末端伯氨基縮水成雙酰胺，轉(zhuǎn)變成能同時(shí)結(jié)合到GST兩個(gè)活性中心的二價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，以其亞氨基為偶聯(lián)基團(tuán)或該亞胺基與丁二酸酐或戊二酸酐反應(yīng)所得羧基為偶聯(lián)基團(tuán)對(duì)應(yīng)與材料表面羧基或氨基偶聯(lián)；

4.據(jù)權(quán)利要求1所述(N-對(duì)甲氧基苯氧乙基)-(N-對(duì)位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸類(lèi)標(biāo)簽GST的單價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，及其衍生的二價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，與微納米材料偶聯(lián)過(guò)程有如下特征：非蛋白類(lèi)微納米材料與相對(duì)于表面可反應(yīng)基團(tuán)過(guò)量的標(biāo)記試劑在包括但不限于N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙腈中經(jīng)脫水縮合成酰胺偶聯(lián)得親和標(biāo)記試劑偶聯(lián)微納米材料；對(duì)蛋白類(lèi)微納米材料，先將親和標(biāo)記試劑在所述溶劑中用水溶性活化劑包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺加N-羥基琥珀酰亞胺活化，再加蛋白微納米材料偶聯(lián)；

5.據(jù)權(quán)利要求1所述(N-對(duì)甲氧基苯氧乙基)-(N-對(duì)位取代酰胺基苯甲?；?甘氨酸類(lèi)標(biāo)簽GST的單價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，及其衍生的二價(jià)不可逆親和標(biāo)記試劑，與微納米材料偶聯(lián)后，對(duì)GST或其融合蛋白的固定化及封閉過(guò)程有如下特征：在緩沖液中加入相對(duì)于親和標(biāo)記試劑偶聯(lián)微納米材料表面反應(yīng)官能團(tuán)過(guò)量的GST或其融合蛋白進(jìn)行不可逆親和標(biāo)記；再用過(guò)量單價(jià)標(biāo)記試劑封閉固定化GST中的未修飾活性中心；最后用過(guò)量半胱氨酸、谷胱甘肽、巰基乙醇、巰基乙酸、巰基乙磺酸之一或其混合物，將偶聯(lián)在微納米材料表面的剩余親和標(biāo)記試劑轉(zhuǎn)變成親水基團(tuán)；以避免功能化材料對(duì)疏水小分子的結(jié)合。

附圖說(shuō)明

附圖1標(biāo)記試劑合成路線

附圖2標(biāo)記試劑(Br-I)和(Br-II)對(duì)sjGST的半抑制濃度(IC₅₀)

附圖3 sjGST和標(biāo)記試劑(Br-I)和(Br-II)等當(dāng)量結(jié)合的k_inact

附圖4 sjGST與100倍當(dāng)量標(biāo)記試劑(Br-I)和(Br-II)結(jié)合的k_inact

附圖5 sjGST自催化100倍當(dāng)量?jī)煞N標(biāo)記試劑與GSH加合物的結(jié)合速率常數(shù)k

附圖6單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)與sjGST的結(jié)合比

附圖7二價(jià)標(biāo)記試劑(Br-II)與sjGST的結(jié)合比

附圖8氨基磁珠與單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)偶聯(lián)前后對(duì)sjGST固定化動(dòng)力學(xué)及容量

附圖9氨基磁珠與單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)偶聯(lián)前后對(duì)sjGST自催化固定動(dòng)力學(xué)及容量

附圖10單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)偶聯(lián)磁珠固定化sjGST后對(duì)堿性磷酸酶(ECAP)的非特異結(jié)合

附圖11 SDS-PAGE驗(yàn)證單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)偶聯(lián)磁珠對(duì)siGST的不可逆結(jié)合

附圖12單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)偶聯(lián)磁珠固定化sjGST再處理后對(duì)熒光小分子ANS的非特異結(jié)合

附表1標(biāo)記試劑及其原位生成產(chǎn)物對(duì)sjGST的半抑制濃度(IC₅₀)

附表2標(biāo)記試劑及其原位生成產(chǎn)物對(duì)sjGST的抑制常數(shù)K_i

應(yīng)用實(shí)施例1

(N-對(duì)甲氧基苯氧乙基)-(N-鹵代乙酰胺基苯甲?；?甘氨酸及其二乙基三胺雙酰胺的合成(附圖1)

1.1對(duì)甲氧基苯氧乙基溴(化合物1)的合成

對(duì)甲氧基苯酚(5g，40mmol)，1，2-二溴乙烷(15.04g，80mmol)懸浮于水(24mL)中，加入40％-NaOH水溶液(12mL，75mmol)，置于80℃油浴中反應(yīng)24h。冷卻至室溫，加入水(100mL)，乙酸乙酯萃取(50mL*3)，合并有機(jī)層，用10％-NaOH洗滌(50mL*2)和水洗(50mL*2)，硅膠柱層析純化，石油醚洗脫。得白色固體6.5g，產(chǎn)率70.3％；

1.2 N-對(duì)甲氧基苯氧乙基甘氨酸乙酯(化合物2)的合成

化合物(1)(5.78g，25mmol)，甘氨酸乙酯鹽酸鹽(6.98g，50mmol)，碳酸鉀(6.9g，50mmol)溶于乙腈(100mL)中，回流反應(yīng)24h。冷卻至室溫，過(guò)濾收集濾液，減壓干燥，得黃色液體溶于乙酸乙酯(100mL)，水洗(50mL*2)，干燥濃縮得粗品黃色液體6g，直接用于下一步；

1.3 Boc保護(hù)對(duì)氨基苯甲酸的合成

對(duì)氨基苯甲酸(6.85g，50mmol)，三乙胺(7.57g，75mmol)溶于1，4-二氧六環(huán)(100mL)和水(50mL)中，加入Boc₂O(16.35g，75mmol)室溫反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)溶劑減壓干燥，得無(wú)色液體，加入3M HCl酸化，析出大量白色固體，過(guò)濾得固體，固體用水洗(50mL*3)至中性，烘干得白色固體Boc保護(hù)對(duì)氨基苯甲酸10.7g，產(chǎn)率90％；

1.4 N-對(duì)甲氧基苯氧乙基-N’-叔丁氧甲酰胺基苯甲酸甘氨酸乙酯及其酸(化合物3和4)的合成

在三頸燒瓶中加入Boc保護(hù)對(duì)氨基苯甲酸(4.74g，20mmol)，EDCI(5.75g，30mmol)，4-N，N-二甲氨基吡啶(0.24g，2mmol)，溶于DMF(20mL)，在冰浴下反應(yīng)10分鐘，加入化合物(2)(4.9g，20mmol)室溫反應(yīng)過(guò)夜。加入水(150mL)，乙酸乙酯萃取(30mL*3)，有機(jī)層分別用1M HCl(20mL*3)，飽和NaHCO₃(20mL*3)，水(20mL*3)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得化合物3粗品直接用于下一步；

上一步所得化合物(3)溶于乙醇(20mL)，加入NaOH(2g，50mmol)溶于水(20mL)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)溶劑減壓除去，加入水(50mL)，乙酸乙酯洗滌(20mL*2)，水層用1M HCl酸化(pH＝1～2)，乙酸乙酯萃取(40mL*3)，有機(jī)層水洗(20mL*2)，無(wú)水硫酸鈉干燥。硅膠柱層析純化，洗脫系統(tǒng)為v(石油醚)：v(乙酸乙酯)＝1∶1～1∶2。得化合物4的無(wú)色粘稠狀液體5.1g，產(chǎn)率57.4％；

1.5單價(jià)標(biāo)記試劑(N-對(duì)甲氧基苯氧乙基-N’-溴乙酰酰胺基苯甲酸)甘氨酸(Br-I)的合成

化合物(4)(4.44g，10mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，加入三氟乙酸(7mL)，室溫反應(yīng)4h，反應(yīng)溶劑減壓除去，加入水(20mL)，用飽和NaHCO₃調(diào)節(jié)至中性，析出大量白色固體，過(guò)濾得固體，烘干，溶于四氫呋喃(20mL)置于三頸燒瓶，加入三乙胺(3.03g，30mmol)，置于冰浴下反應(yīng)10分鐘，溴乙酰溴(4.04g，20mmol)溶于四氫呋喃(5mL)，在冰浴下緩慢滴加，滴加完后在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。減壓除去反應(yīng)溶劑，硅膠柱層析純化，洗脫系統(tǒng)為v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1～1∶2，得單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)白色固體2.4g，產(chǎn)率71％；

¹³C NMR(600MHz，CDCl₃)δ175.42(s，1C)，170.31(s，1C)，168.24(s，1C)，159.15(s，2C)，126.01(s，4C)，114.52(s，2C)，105.21(s，2C)，104.15(s，2C)，74.44(s，1C)，59.33(s，1C)，58.74(s，1C)，34.97(s，1C)，22.23(s，1C)；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ10.3(s，1H)，7.6-7.9(m，4H)，6.7(m，4H)，4.88(s，2H)，4.29(s，2H)，3.92(s2H)，3.73(s，3H)，3.5(m，2H)。MS：[M+H]＝466.17(理論值466.30)

1.6二價(jià)標(biāo)記試劑雙(N-對(duì)甲氧基苯氧乙基-N’-溴乙酰酰胺基苯甲酸)甘氨酰二乙基三胺二酰胺(Br-II)合成

化合物(I)(0.93g，2mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(0.25g，2.2mmol)溶于四氫呋喃(10mL)，置于冰浴下反應(yīng)10分鐘，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(0.45g，2.2mmol)溶于四氫呋喃(5mL)，冰浴下緩慢滴加，滴加完后室溫反應(yīng)過(guò)夜。過(guò)濾除去不溶物，濾液減壓除去溶劑，加入二氯甲烷(10mL)溶解，置于冰浴下冷卻，二乙基三胺(0.103g，1mmol)溶于二氯甲烷(5mL)冰浴下緩慢滴加，滴加完后室溫反應(yīng)3小時(shí)。減壓除去反應(yīng)溶劑，硅膠柱層析純化，洗脫系統(tǒng)為v(二氯甲烷)∶v(甲醇)＝100∶1～100∶10，得二價(jià)標(biāo)記試劑(Br-II)的白色固體0.22g，產(chǎn)率22％。

¹³C NMR(600MHz，DMSO)δ172.56(s，2C)，169.61(s，2C)，165.71(s，2C)，153.95(s，4C)，128.07(s，8C)，119.37(s，2C)，119.14(s，2C)，115.67(s，4C)，115.02(s，4C)，75.36(s，2C)，66.21(s，2C)，55.80(s，4C)，35.63(s，2C)，30.73(s，2C)，25.89(s，2C)。¹H NMR(600MHz，DMSO)δ10.54(s，1H)，10.27(s，1H)，8.43(s，2H)，8.17(s，2H)，7.3-7.6(m，8H)，6.76.8(m，8H)，4.7(s，4H)，3.6-3.7(s，10H)，3.5(s，10H)，2.5(s，4H).2.3(s，1H)MS：[M+H]＝998.45(理論值998.72)

應(yīng)用實(shí)施例2

單價(jià)和二價(jià)親和標(biāo)記試劑及其GSH加合物對(duì)sjGST的抑制作用

2.1 sjGST的重組表達(dá)

參照文獻(xiàn)(重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2012；37(9)：791-795)，經(jīng)GSH-Sepharose 4B親和純化。

2.2連續(xù)跟蹤sjGST催化顯色底物CDNB和GSH反應(yīng)生成加合物測(cè)定活性

用Bradford方法測(cè)定蛋白含量。用Habig法測(cè)定sjGST活性，緩沖液用20mM pH 6.5磷酸鹽緩沖液；在1.0mL反應(yīng)體系中，GSH和CDNB終濃度均為1.0mM，sjGST終濃度為10nM，有機(jī)溶劑含量控制在5％以下；340nm波長(zhǎng)下測(cè)定其初速度。產(chǎn)物消光系數(shù)為9.6(mM)^-1.cm^-1，每分鐘生成1徽摩爾產(chǎn)物酶量為1個(gè)單位。測(cè)得比活性約為10.0±1U/mg。

2.3標(biāo)記試劑(Br-I)和(Br-II)及其與GSH酶催化原位生成加合物對(duì)sjGST半抑制濃度(IC₅₀)的測(cè)定

在1.0mL的反應(yīng)體系中，固定CDNB和GSH終濃度為1.0mM。分別測(cè)定標(biāo)記試劑自身及其與GSH酶催化加合物的IC_a0：a)標(biāo)記試劑自身IC₅₀：先后間隔約5秒依次加入CDNB、標(biāo)記試劑和sjGST，再加入終濃度為1.0mM GSH啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定340nm波長(zhǎng)下吸收隨著時(shí)間的變化；b)原位生成GSH加合物IC_5o：將sjGST、GSH和標(biāo)記試劑預(yù)先反應(yīng)10min，再加入CDNB到終濃度為1.0mM，測(cè)定340nm波長(zhǎng)下吸收隨著時(shí)間的變化。測(cè)定不同濃度抑制劑下初速度對(duì)無(wú)抑制劑時(shí)初速度的比值為剩余活性比例，其與1.0之差為抑制率；回歸分析抑制率約35％～65％的數(shù)據(jù)測(cè)定抑制劑的半抑制濃度。(附圖2和附表1)

2.4標(biāo)記試劑(Br-I)和(Br-II)與GSH加合物對(duì)sjGST抑制常數(shù)(K_i)的計(jì)算

對(duì)于不可逆標(biāo)記過(guò)程考慮其結(jié)合位點(diǎn)的逐漸占有，參照文獻(xiàn)(Methods Enzymol.1979，63：437-467；Anal Biochem.2004，327(1)：61-67.)，用方程(1)經(jīng)Matalab 6.5內(nèi)嵌CFtool程序擬合初速度對(duì)抑制劑濃度響應(yīng)曲線使R²＞0.98所得表觀K_i即可近視為真實(shí)K_i。(附表2)。

P₀：為GST亞基總濃度I_t：為抑制劑總濃度

v：無(wú)抑制劑時(shí)的初速率v₀：存在某濃度抑制劑時(shí)的初速率

2.5標(biāo)記失活速率常數(shù)k_inact的測(cè)定

在250μL20mM pH 6.5磷酸鹽緩沖液中，siGST的終濃度為1μM，分別與終濃度為200μM和3μM的單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)和終濃度為100μM和1.5μM的二價(jià)標(biāo)記試劑(Br-II)孵育0、5、10、15、20min，取10μL，加入終濃度1.0mM的CDNB和GSH，測(cè)定340nm吸收隨著時(shí)間的變化。用單指數(shù)函數(shù)模型對(duì)響應(yīng)曲線非線性擬合可得100倍和1倍單價(jià)標(biāo)記試劑濃度下標(biāo)記失活速率常數(shù)k_inact分別約為0.20min^-1、0.11min^-1(附圖3)，100倍和1倍二價(jià)標(biāo)記試劑濃度下標(biāo)記失活速率常數(shù)k_inact分別約為0.23min^-1、0.0078min^-1，R-square均大于0.995。(附圖4)。

在250μL的20mM pH 6.5磷酸鹽緩沖液反應(yīng)體系中，siGST的終濃度1μM，加入終濃度為200μM的單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)或終濃度為100μM的二價(jià)標(biāo)記試劑(Br-II)，終濃度為1mM的GSH，孵育不同時(shí)間后，取出10μL，再加入終濃度1.0mM的CDNB和GSH，測(cè)定340nm波長(zhǎng)下吸收隨著時(shí)間的變化。通過(guò)單指數(shù)函數(shù)模型對(duì)響應(yīng)曲線非線性擬合得100倍單價(jià)標(biāo)記試劑生成的加合物結(jié)合速率常數(shù)k_inact約為0.619min^-1，100倍二價(jià)標(biāo)記試劑加合物速率常數(shù)k_inact約為0.729min^-1，R-square可達(dá)到0.99。(附圖5)

2.6紫外分光光度法檢測(cè)剩余酶活性測(cè)定標(biāo)記試劑結(jié)合比

在250μL的反應(yīng)體系中，sjGST終濃度為1μM，分別與不同濃度的單價(jià)和二價(jià)標(biāo)記試劑孵育10h后，取出10μL，再加入終濃度1.0mM的CDNB和GSH，測(cè)定340nm吸收隨著時(shí)間的變化，沿結(jié)合曲線分別作飽和結(jié)合相和非飽和結(jié)合相的兩條歸一化直線的交點(diǎn)近視為結(jié)合當(dāng)量點(diǎn)，單價(jià)標(biāo)記試劑結(jié)合比約為2(附圖6)，二價(jià)標(biāo)記試劑結(jié)合比約為1。(附圖7)

應(yīng)用實(shí)施例3：磁珠偶聯(lián)不可逆標(biāo)記試劑對(duì)sjGST的固定化及表征

3.1磁珠偶聯(lián)標(biāo)記試劑

直接法制備單價(jià)標(biāo)記試劑偶聯(lián)磁珠(M-MSP)：25mg氨基磁珠(FBD-MSP-NH₂，重慶博藍(lán)鷹生物技術(shù)有限公司)用4mL DMF重懸，加入0.3g DCC，取1mL單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)的2mM DMF溶液，250r/min攪拌室溫反應(yīng)12h，DMF 5mL*3次洗滌得偶聯(lián)單價(jià)標(biāo)記試劑的磁珠(M-MSP)；

直接法二價(jià)標(biāo)記試劑偶聯(lián)磁珠(D-MSP)：25mg氨基磁珠(FBD-MSP-NH₂，重慶博藍(lán)鷹生物技術(shù)有限公司)用4mL DMF重懸，加入0.3g DCC，及表面可反應(yīng)氨基1.5倍的丁二酸酐，250r/min室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，磁分離洗滌得羧基磁珠；25mg制備所得羧基磁珠用4mL DMF重懸，加入0.3g DCC，取1mL二價(jià)標(biāo)記試劑(Br-II)的2mM DMF溶液，250r/min攪拌室溫反應(yīng)12h，DMF5mL*3次洗滌得偶聯(lián)二價(jià)標(biāo)記試劑的磁珠(D-MSP)；

酶自催化偶聯(lián)單價(jià)、二價(jià)標(biāo)記試劑：與直接偶聯(lián)相同操作，但與標(biāo)記試劑同時(shí)加入10倍量GSH，反應(yīng)30min。

3.2磁珠偶聯(lián)不可逆標(biāo)記試劑對(duì)sjGST的固定化動(dòng)力學(xué)及其固定化容量

在六組200μL 20mM pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，分別加入單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)偶聯(lián)磁珠(M-MSP)和sjGST 10μg，二價(jià)標(biāo)記試劑(Br-II)偶聯(lián)磁珠(D-MSP)100μg和sjGST 10μg；設(shè)sjGST空白對(duì)照樣品。分別孵育30min、60min、120min、240min、360min、480min后，小心磁分離取上清，磁珠用緩沖液(100μL*2)洗滌合并上清。各組取400μL，轉(zhuǎn)移到石英測(cè)量杯中，調(diào)節(jié)Carry Eclipse熒光分光光度計(jì)的激發(fā)和發(fā)射狹縫/帶寬為10nm，光電倍增管的電壓調(diào)節(jié)到“中”，280nm激發(fā)測(cè)定340nm熒光信號(hào)，計(jì)算其熒光信號(hào)與空白對(duì)照樣品熒光信號(hào)之比與1的差值，按下述方法測(cè)定磁珠非特異結(jié)合并校正，得GST特異性固定化百分比約32±2.8％，GST特異性飽和固定化容量為32±2.8μg/g磁珠(附圖8)；

磁珠對(duì)sjGST的非特異性結(jié)合：在200μL20mM pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，加入氨基磁珠(FBD-MSP-NH₂，重慶博藍(lán)鷹生物技術(shù)有限公司)100μg和sjGST 10μg，以sjGST為空白對(duì)照樣品。與固定化反應(yīng)平行操作，取洗滌上清400μL，測(cè)定280nm激發(fā)340nm熒光信號(hào)，計(jì)算其熒光信號(hào)與空白對(duì)照樣品熒光信號(hào)之比與1的差值，得480min對(duì)sjGST非特異性吸附小于2％，即小于2μg/g。(附圖8)

3.3磁珠自催化固定化sjGST時(shí)間及其固定化飽和容量

在六組200μL的在20毫摩爾pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，各加入M-MSP 100μg，sjGST 10μg，同時(shí)加入終濃度為100μM的GSH，以sjGST空白對(duì)照樣品。分別孵育5min、10min、20min、30min、45min、60min后，小心地磁分離取上清，磁珠用緩沖液(100μL*2)小心洗滌，合并液體。各組樣品取400μL，轉(zhuǎn)移到石英測(cè)量杯中，調(diào)節(jié)Carry Eclipse熒光分光光度計(jì)的激發(fā)和發(fā)射狹縫/帶寬為10nm，光電倍增管的電壓調(diào)節(jié)到中，280nm激發(fā)測(cè)定340nm熒光信號(hào)，計(jì)算其熒光信號(hào)與空白對(duì)照樣品熒光信號(hào)之比與1的差值，同法測(cè)定磁珠自催化固定非特異性吸附并校正，得GST特異性固定化百分比約31±2.1％。(附圖9)

3.4標(biāo)記試劑偶聯(lián)磁珠對(duì)堿性磷酸酶(ECAP)的非特異性吸附

在四組200μL10mM pH 7.4的HEPES緩沖液中，分別取NH₂-MSP 100μg和ECAP 10μg、取M-MSP100μg和ECAP 10μg、取M-MSP 100μg和sjGST 10μg與ECAP 10μg、取M-MSP 100μg加sjGST 10μg及GSH終濃度1mM和ECAP 10μg；各組平行反應(yīng)6h，小心磁分離得磁珠，磁珠用緩沖液(100μL*2)小心洗滌。測(cè)定磁珠上堿性磷酸酶活性，以此計(jì)算各組堿性磷酸酶的吸附量：每組磁珠分別取出1ng，加入對(duì)硝基苯磷酸酯(PNPP，10mM)200μL，同時(shí)取ECAP 2ng加入PNPP(10mM)200μL作為陽(yáng)性對(duì)照，PNPP(10mM)200μL作為陰性對(duì)照，反應(yīng)30min后加入NaOH(1mM)50μL淬滅反應(yīng)，取出200μL經(jīng)酶標(biāo)儀讀取其在405nm處的吸光度；

NH₂-MSP對(duì)ECAP的吸附量為0.036μg/g，M-MSP對(duì)ECAP的吸附量為0.052μg/g，M-MSP在sjGST存在下對(duì)ECAP的吸附量為0.11μg/g，M-MSP在sjGST及GSH存在下對(duì)ECAP的吸附量為0.10μg/g，證明各組對(duì)ECAP的吸附量均小于12％。(附圖10)

3.5 SDS-PAGE檢測(cè)標(biāo)記試劑偶聯(lián)磁珠siGST的不可逆固定化

在三組200μL20毫摩爾pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，分別取NH₂-MSP 200μg和sjGST 20μg(非特異固定組4)；M-MSP 200μg和sjGST 20μg(不可逆特異固定組3)；M-MSP 200μg和sjGST 20μg及GSH終濃度1mM(可逆特異固定組5)；各組平行反應(yīng)6h，小心地磁分離得磁珠，磁珠用緩沖液(100μL*2)小心洗滌，磁珠用SDS-PAGE loading buffer煮沸10min后，取上清進(jìn)行SDS-PAGE。與氨基磁珠非特固定組4相比，直接固定化組3為不可逆固定化，自催化固定化組5為可逆固定。(附圖11)。

3.6標(biāo)記試劑偶聯(lián)磁珠及其固定化GST經(jīng)再處理后對(duì)小分子的非特異性結(jié)合

在兩組200μL的20mM pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，一組取偶聯(lián)磁珠M-MSP 100μg(示為a)；一組取偶聯(lián)磁珠M-MSP 100μg加入終濃度為1mM半胱氨酸(Cys)，反應(yīng)6h后小心地磁分離，磁珠用緩沖液(200μL*3)小心洗滌得再處理偶聯(lián)磁珠M-MSP(示為b)，各加入終濃度為25μM的小分子熒光物質(zhì)8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，孵育30min后小心磁分離得磁珠，用緩沖液(200μL*3)小心洗滌；

在另兩組200μL的20mM pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，均取M-MSP 100μg加入sjGST 10μg反應(yīng)6h，小心地磁分離得sjGST固定化磁珠，用緩沖液(200μL*3)小心洗滌；第一組加入緩沖液(示為c)，第二組加入50μM的單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)處理20分鐘后加入1mM的Cys，再反應(yīng)30min后小心地磁分離得再處理sjGST固定化磁珠(示為d)，用緩沖液(200μL*3)小心洗滌，各加入終濃度為25μM的ANS，孵育30min后小心地磁分離得磁珠，用緩沖液(200μL*3)小心洗滌；

各組磁珠分散于200μL緩沖液中，取少量涂于載玻片置于熒光顯微鏡40倍觀察拍照，曝光時(shí)間為1s。結(jié)果顯示，用Cys對(duì)標(biāo)記試劑偶聯(lián)磁珠M-MSP處理前后對(duì)小分子ANS的非特異結(jié)合均不明顯(a，b)，標(biāo)記試劑偶聯(lián)磁珠固定化GST對(duì)小分子ANS的非特異結(jié)合明顯(c)，但再依次用單價(jià)標(biāo)記試劑(Br-I)和Cys處理后顯著減少對(duì)小分子ANS的非特異結(jié)合(a)(附圖12)。