本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶(GAD)突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然的功能性非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，具有降血壓、抗驚厥、預(yù)防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、改善腦細(xì)胞、促進(jìn)激素分泌和保肝利腎等功能,在醫(yī)藥、食品保健、化工、農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用。目前國內(nèi)外主要采用化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化酶法制備γ-氨基丁酸?；瘜W(xué)法合成GABA的過程中，需要用到強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等腐蝕性較強(qiáng)的溶劑，反應(yīng)條件劇烈，原料毒性大，價(jià)格昂貴且存在較多安全隱患等問題；微生物發(fā)酵法條件溫和、安全、成本較低，但后處理過程復(fù)雜且生產(chǎn)周期長；生物轉(zhuǎn)化酶法合成GABA可提高底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品純度,具有節(jié)約后處理工序、縮短生產(chǎn)周期及降低環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，是未來GABA制備工藝開發(fā)的主要方向。

生物轉(zhuǎn)化酶法合成GABA主要利用了能催化L-谷氨酸裂解為GABA和二氧化碳的谷氨酸脫羧酶(GAD，EC4.1.1.15)。該酶廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞中，是GABA生物合成的限速酶，相關(guān)研究報(bào)道很多。為解決天然GAD不足的問題，人們克隆了大腸桿菌、乳酸菌、嗜熱鏈球菌等的GAD基因，并在大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌中進(jìn)行了表達(dá)，并有相關(guān)專利報(bào)道(申請?zhí)枺?01010567447.9，201110289796.3,201210431917.8,201510229161.2，201510198433.7，201510819438.7)。為解決多數(shù)GAD最適pH低(3.8-4.5)，pH高于6.0時(shí)易失活問題，人們利用基因改造獲得了近中性pH穩(wěn)定性提高的突變體(如大腸桿菌或乳酸菌GAD的C末端455-456位缺失的突變體、植物乳桿菌GAD 89位谷氨酸E突變?yōu)榫彼酭或丙氨酸A的突變體(申請?zhí)?01510819438.7)，并通過用酸調(diào)節(jié)并維持反應(yīng)體系pH、用L-谷氨酸取代谷氨酸鈉為底物、在反應(yīng)體系中添加陽離子交換樹脂等優(yōu)化酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件與方式等。

良好的熱穩(wěn)定性是理想的生物催化劑應(yīng)具備的條件之一。細(xì)菌中的GAD酶最適反應(yīng)溫度一般在30-50℃之間，在50℃以上極易失活。短乳桿菌GAD酶在55℃下半衰期為30.9min，大腸桿菌GAD酶在50℃半衰期為24min，非常不利于GAD在GABA生物制備中的應(yīng)用。在保證GAD酶活性基礎(chǔ)上，提高GAD的熱穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)GABA中需要迫切解決的問題。申請?zhí)?01110297056.7的專利公開了熱穩(wěn)定性提高的短乳桿菌GAD 311位甘氨酸G突變?yōu)楦彼酨的突變體G311P。申請?zhí)?01110297904.1的專利公開了熱穩(wěn)定性提高的短乳桿菌GAD 56位甘氨酸G突變?yōu)楦彼酨的突變體G56P。申請?zhí)?01510952734.4的專利根據(jù)嗜熱古細(xì)菌GAD氨基酸序列比對(duì)信息，經(jīng)定點(diǎn)突變在短乳桿菌對(duì)應(yīng)位點(diǎn)引入脯氨酸P，篩選到55℃下半衰期比野生型延長了14.5min的突變體G364P。隨著酶熱穩(wěn)定性的提高，在工業(yè)生產(chǎn)過程中可以采用更高的操作溫度，以提高反應(yīng)速率、增加底物溶解度，有利于利用該酶通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是提供熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體，并提供其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體，其由大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶(其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)編碼基因進(jìn)行點(diǎn)飽和突變并篩選得到。

所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列相對(duì)于天然的谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、纈氨酸V和蘇氨酸T分別突變?yōu)楣劝彼酔、絲氨酸S和纈氨酸V；或，

所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列相對(duì)于天然的谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、纈氨酸V和蘇氨酸T分別突變?yōu)槔野彼醂、精氨酸R和賴氨酸K；或，

所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列相對(duì)于天然的谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、纈氨酸V和蘇氨酸T分別突變?yōu)樘扉T冬酰胺N、酪氨酸Y和纈氨酸V。

這三種突變體分別表示為Q5E/V6S/T7V、Q5Y/V6R/T7K或Q5N/V6Y/T7V。

本發(fā)明的突變體是將大腸桿菌谷氨酸脫羧酶的近N端部分氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，增加其蛋白質(zhì)分子鏈間和鏈內(nèi)氫鍵數(shù)量得到的。獲得的三種谷氨酸脫羧酶突變體的半失活溫度為50-54.5℃，比野生型提高了10.2-14.3℃；在45℃下的半衰期由原來的24min提高到126-160min，提高了4.2-5.6倍。

獲得的三種谷氨酸脫羧酶突變體在pH6.5時(shí)的相對(duì)酶活由原來的38％提高到72％-84％，在中性pH范圍內(nèi)的酶活穩(wěn)定性顯著提高。本發(fā)明所得的谷氨酸脫羧酶突變體更加適合工業(yè)化的生產(chǎn)需求，為高效合成氨基丁酸奠定了基礎(chǔ)。

所述谷氨酸脫羧酶突變體Q5E/V6S/T7V、Q5Y/V6R/T7K或Q5N/V6Y/T7V的氨基酸序列分別如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。

所述的谷氨酸脫羧酶突變體的編碼基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。

含有所述編碼基因的載體為質(zhì)?；蚣?xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌的質(zhì)粒或細(xì)胞，也包括乳酸菌、枯草桿菌、酵母、短棒桿菌等的質(zhì)?；蚣?xì)胞。

本發(fā)明還提供應(yīng)用大腸桿菌作為基因工程菌產(chǎn)谷氨酸脫羧酶突變體的方法，具體方法為：將37℃，200rpm過夜培養(yǎng)的種子(大腸桿菌)以5％的接種量轉(zhuǎn)入TB培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)至OD600為1時(shí)，加入終濃度0.7mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到谷氨酸脫羧酶突變體。

本發(fā)明還提供所述的谷氨酸脫羧酶突變體的另一種獲得方法，針對(duì)由大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶的氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以構(gòu)建成功的含野生菌gad B基因(GenBank No.EF551361.1)的質(zhì)粒pET28a-gad(PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因后，采用切、接、轉(zhuǎn)、增、鑒的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)流程構(gòu)建)為模板，通過PCR獲得編碼突變體的基因及質(zhì)粒，將擴(kuò)增基因或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌等宿主內(nèi)表達(dá)，得到谷氨酸脫羧酶突變體。

除大腸桿菌外，本發(fā)明也構(gòu)建了突變體基因的枯草桿菌重組質(zhì)粒，并利用枯草桿菌表達(dá)得到了GAD突變體。

本發(fā)明提供了所述的谷氨酸脫羧酶突變體在生物合成催化L-谷氨酸或其鈉鹽生成氨基丁酸中的應(yīng)用。利用谷氨酸脫羧酶突變體全細(xì)胞，在30-50℃，初始pH3.8-5.0下分批次加入總量415g/L的谷氨酸，轉(zhuǎn)化24h后得到265-305g/L的γ-氨基丁酸(GABA)，摩爾轉(zhuǎn)化率為86.0％-99.1％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將來源于大腸桿菌谷氨酸脫羧酶的編碼基因進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變并篩選得到三種谷氨酸脫羧酶突變體。獲得的三種谷氨酸脫羧酶突變體的半失活溫度為50-54.5℃，比野生型提高了10.2-14.3℃；在45℃下的半衰期由原來的24min提高到126-160min，提高了4.2-5.6倍。獲得的三種谷氨酸脫羧酶突變體在pH6.5時(shí)的相對(duì)酶活由原來的38％提高到72％-84％，在中性pH范圍內(nèi)的酶活穩(wěn)定性顯著提高。本發(fā)明所得的谷氨酸脫羧酶突變體更加適合工業(yè)化的生產(chǎn)需求，為高效合成氨基丁酸奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為谷氨酸脫羧酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，1為PCR擴(kuò)增gadB基因；M為DNA Mark IV標(biāo)準(zhǔn)分子量。

圖2為重組質(zhì)粒pET28a-GAD B的PCR鑒定結(jié)果。其中1-4分別為挑取轉(zhuǎn)化后平板上的單克隆，M為DNA MarkIV標(biāo)準(zhǔn)分子量。

圖3為SDS-PAGE分析GAD及其突變體表達(dá)情況。其中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，1和2為野生型GAD的誘前與誘后，3和4為GAD突變體1的誘前與誘后，5和6為GAD突變體2的誘前與誘后，7和8為GAD突變體3的誘前與誘后。

圖4為Ni柱純化后的GAD及其突變體。其中1-4分別為野生型GAD、GAD突變體1、GAD突變體2和GAD突變體3。

圖5為GAD及其突變體在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。其中A為野生型GAD、B為GAD突變體1、C為GAD突變體2、D為GAD突變體3。

圖6為重組GAD及其突變體轉(zhuǎn)化制備γ-氨基丁酸的結(jié)果。其中A為野生型GAD、B為GAD突變體2。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明的以下實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基和試劑信息如下：

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％(百分含量均指質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％、瓊脂1.5％(百分含量均指質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 7.0。

磷酸鹽緩沖液：磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(0.2mol/L),pH 7.4。

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：磷酸氫二鈉(0.2mol/L)、檸檬酸(0.1mol/L)，pH 4.0。

硼砂-硼酸緩沖液：含硼砂根(0.2mol/L)、硼酸0.2mol/L、硼砂0.05mol/L，pH 9.0。

反應(yīng)液：0.2M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(L-MSG 1M，PLP 0.1M，pH 4.0)。

本發(fā)明的以下實(shí)施例中使用的引物均委托上海捷瑞生物工程技術(shù)有限公司合成。測序均委托上海美吉基因測序公司完成。質(zhì)粒DNA的抽提、回收和純化分別使用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒(購自捷瑞公司)和膠回收試劑盒(購自捷瑞公司)完成。限制性內(nèi)切酶均購自日本Takara公司。PCR擴(kuò)增使用Taq DNA聚合酶(購自日本Takara公司)完成，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書設(shè)置。

本發(fā)明的以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件進(jìn)行。

本發(fā)明的以下實(shí)施例中使用的原料或試劑除特別注明外，均市售可得。除特別注明外，％均代表重量體積(w/v)百分比。

實(shí)施例1谷氨酸脫羧酶GAD重組菌的構(gòu)建

以大腸桿菌E.coli DH5α基因組DNA為模板，利用引物5’-AATTGGATCCATGGATAAGAAGCAAG-3’和5’-AAGGCTCGAGGGTATGTTTAAAGCTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增gadB基因序列(圖1)。圖1顯示，成功獲得約1400bp的目標(biāo)基因。用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I消化處理PCR產(chǎn)物和載體pET28a(+)。酶切產(chǎn)物純化后，T4連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌培養(yǎng)、抽提質(zhì)粒后，以BamH I和Xho I雙酶切質(zhì)粒鑒定gadB是否存在(圖2)。圖2表明，挑取的2個(gè)重組子均有約1400bp大小的gadB目的基因條帶和約5300bp的pET28a(+)載體條帶，均為陽性克隆。選取其中1#重組子測序，測序結(jié)果證實(shí)其為正確的重組子pET28-GADB。將1#菌對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得谷氨酸脫羧酶GAD重組表達(dá)菌。

實(shí)施例2GAD突變體重組菌的構(gòu)建

以質(zhì)粒pET28-GADB為模板，利用引物5’-ACCATGGATAAGAAGNNNNNNNNNGATTTAAGGTCGGAAC-3’和5’-NNNNNNNNNCTTCTTATCCATGGTATATCTCCTTC-3’進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增含gadB基因的全質(zhì)粒序列，Dpn I消化后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌，于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基的96孔深孔板中培養(yǎng)過夜。

實(shí)施例3熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶重組菌的篩選

將實(shí)施例2中的菌體轉(zhuǎn)接到新的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基的96孔深孔板中，37℃培養(yǎng)2-4h至OD600約為0.6時(shí)，加入終濃度0.2mM的IPTG，16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。離心去除培養(yǎng)液，加入200ul含20mM溴甲酚綠，10mM谷氨酸鈉，0.1mMPLP的10mM pH4.8的乙酸-乙酸鈉溶液，45℃保溫1h，篩選孔內(nèi)顏色呈深藍(lán)色的重組菌株，測序分析相應(yīng)質(zhì)粒突變位點(diǎn)的核苷酸與氨基酸序列。

實(shí)施例4重組GAD酶及其突變體的表達(dá)與純化

將含有pET28a-GADB及其突變體重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)接種到含有50ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，于37℃、180rpm轉(zhuǎn)速的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)液以2％的接種量接種到新鮮的含50ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.4mM的IPTG，16℃、180rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)14-16h，誘導(dǎo)GAD及其突變體的表達(dá)。

4℃、5000×g離心20分鐘收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.6)洗滌一次，棄去上清液，并將菌體重懸于1/10培養(yǎng)液體積的磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.6)。然后在冰浴中超聲破碎細(xì)胞(功率200瓦，工作4秒，間歇4秒，循環(huán)100次)，4℃，12000×g離心30分鐘去除細(xì)胞碎片，收集上清粗酶液。用Ni-NTA親和層析法純化GAD及其突變體，獲得純酶液。用Sephadex G25柱脫鹽并替換成pH3.8、0.1M的檸檬酸緩沖液，Bradford法測定蛋白濃度，SDS-PAGE檢測蛋白純度(圖3、圖4)。

圖3的pET-28a-GAD與其突變體的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)前后的SDS-PAGE電泳圖顯示，與誘導(dǎo)前相比(泳道1,3,5,7)，IPTG誘導(dǎo)后的野生型GAD、GAD突變體1、GAD突變體2和突變體3(泳道2,4,6,8)均在誘前、誘后樣品均在53kDa左右出現(xiàn)與目標(biāo)蛋白大小一致的新條帶，說明四種重組菌種目標(biāo)蛋白成功表達(dá)。

圖4中泳道1～4分別為原始菌、M1、M2、M3經(jīng)過鎳柱親和層析和G25脫鹽柱除鹽后的蛋白樣品。由圖4可見，純化后的野生型GAD及其3種突變體純度均達(dá)到90％以上，幾乎不見目標(biāo)蛋白帶之外的非特異性條帶。

實(shí)施例5重組野生型GAD酶及其突變體的熱穩(wěn)定性分析

將野生型GAD及其突變體的純酶在20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下分別保溫15min后，立即置于冰浴上5min，測定不同溫度下GAD酶殘余活力。以20℃保溫15min的酶活力為參比，以溫度為橫坐標(biāo)X、相對(duì)活力為縱坐標(biāo)y作散點(diǎn)圖，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算半失活溫度T1/2(表1)，以考察酶的熱穩(wěn)定性。野生型GAD的半失活溫度為40.2℃，突變體的半失活溫度分別為48.2、50.4和45.1℃，比野生型GAD提高4.9-10.2℃。

表1 GAD及其突變體的半失活溫度。

將野生型GAD及其突變體的純酶在40℃、50℃和60℃下分別保溫2h-12h后，立即置于冰浴上5min，測不同溫度下GAD酶殘余活力。以不做保溫處理的酶活力為參比，以時(shí)間為橫坐標(biāo)X、相對(duì)活力為縱坐標(biāo)y作散點(diǎn)折線圖，考察酶的熱穩(wěn)定性。野生型GAD在所測試的40℃、50℃和60℃下保溫2h的殘留酶活力均在50％以下，保溫12h后的殘留酶活力約為15％；三個(gè)GAD突變體40℃保溫2h后殘留酶活力在85％-95％之間，保溫12h后的殘留酶活力在35％-70％之間，比野生型GAD酶明顯穩(wěn)定(圖5)。

將野生型GAD及其突變體的純酶在45℃分別保溫5-180min后，立即置于冰浴上5min，測定不同處理時(shí)間下GAD酶殘余活力。45℃下，野生型GAD半衰期為24min，而突變體的半衰期分別為76、90和129min，是野生型GAD的3.1-5.3倍(表2)。

表2 GAD及其突變體在45℃的半衰期

實(shí)施例6重組野生型GAD菌及其突變株轉(zhuǎn)化谷氨酸(鈉)制備γ-氨基丁酸

在含有10mM PLP的200mM pH4.8的乙酸-乙酸鈉溶液中加入重組菌體，使其終濃度為50g/L，并分批次加入總量510g/L的谷氨酸(鈉)，30℃反應(yīng)24h，期間取樣并測定γ-氨基丁酸生成量(圖6)。由圖6a可見，重組野生型GAD菌全細(xì)胞催化的反應(yīng)進(jìn)行到6h時(shí)摩爾轉(zhuǎn)化率為46％；12h時(shí)γ-氨基丁酸生成量為313.17g/L；24h后γ-氨基丁酸生成量為464.07g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率90％。圖6b顯示2號(hào)重組突變體2號(hào)全細(xì)胞催化的反應(yīng)前6～8h的摩爾轉(zhuǎn)化率與重組野生型GAD菌相當(dāng)；12h時(shí)產(chǎn)物γ-氨基丁酸生成量為348.46g/L，較野生型菌高35.29g/L；24h后產(chǎn)物γ-氨基丁酸生成量為492.72g/L，較野生型菌提高28.26g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率提高近6個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)95.56％。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>華東理工大學(xué)

<120>熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體及其應(yīng)用

<160>7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp

5 10 15

Ser Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys

20 25 30

Arg Phe Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile

35 40 45

Ile Asn Asp Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu

50 55 60

Ala Thr Phe Cys Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu

65 70 75

Met Asp Leu Ser Ile Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr

80 85 90

Pro Gln Ser Ala Ala Ile Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala

95 100 105

Asp Leu Trp His Ala Pro Ala Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly

110 115 120

Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Met

125 130 135

Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg Met Glu Ala Ala Gly Lys

140 145 150

Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly Pro Val Gln Ile Cys

155 160 165

Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu Leu Arg Glu Ile

170 175 180

Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys Arg Met Ile

185 190 195

Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr Phe Gly

200 205 210

Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His Asp

215 220 225

Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met

230 235 240

His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala

245 250 255

Pro Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile

260 265 270

Ser Ala Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly

275 280 285

Trp Val Ile Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val

290 295 300

Phe Asn Val Asp Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile

305 310 315

Asn Phe Ser Arg Pro Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu

320 325 330

Phe Leu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala

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aacaaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctacgttgc 300

gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360

accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420

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aacagcttta aacatacc 1398