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熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:12411730閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體,其特征在于,其由大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶編碼基因進行點飽和突變并篩選得到,所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列相對于天然的谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、纈氨酸V和蘇氨酸T分別突變?yōu)楣劝彼酔、絲氨酸S和纈氨酸V;

所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體,其特征在于,其由大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶編碼基因進行點飽和突變并篩選得到,所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列相對于天然的谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、纈氨酸V和蘇氨酸T分別突變?yōu)槔野彼醂、精氨酸R和賴氨酸K;

所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.一種熱穩(wěn)定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體,其特征在于,其由大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶編碼基因進行點飽和突變并篩選得到,所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列相對于天然的谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、纈氨酸V和蘇氨酸T分別突變?yōu)樘扉T冬酰胺N、酪氨酸Y和纈氨酸V;

所述谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一種如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶突變體的編碼基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

5.一種如權(quán)利要求2所述的谷氨酸脫羧酶突變體的編碼基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

6.一種如權(quán)利要求3所述的谷氨酸脫羧酶突變體的編碼基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

7.含有權(quán)利要求4或5或6所述編碼基因的載體,其特征在于,所述的載體為質(zhì)?;蚣毎瑑?yōu)選為大腸桿菌,也包括乳酸菌、枯草桿菌、酵母、短棒桿菌。

8.一種如權(quán)利要求1或2或3所述的谷氨酸脫羧酶突變體的獲得方法,其特征在于,針對由大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶的氨基酸位點設(shè)計引物,以含野生菌gad B基因的質(zhì)粒pET28a-gad為模板,通過PCR獲得編碼突變體的基因及質(zhì)粒,將擴增基因或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主內(nèi)表達,得到谷氨酸脫羧酶突變體。

9.一種如權(quán)利要求1或2或3所述的谷氨酸脫羧酶突變體的獲得方法,其特征在于,應(yīng)用大腸桿菌作為基因工程菌產(chǎn)谷氨酸脫羧酶突變體,具體方法為:將37℃,200rpm過夜培養(yǎng)的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入TB培養(yǎng)基,于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)至OD600為1時,加入終濃度0.7mM的IPTG誘導(dǎo)表達,得到谷氨酸脫羧酶突變體。

10.一種如權(quán)利要求1或2或3所述的谷氨酸脫羧酶突變體在生物合成催化L-谷氨酸或其鈉鹽生成氨基丁酸中的應(yīng)用。

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