本發(fā)明涉及屬于生物工程領域，特別涉及一種多功能裂解酶及其作為抗菌物質在控制金黃色葡萄球菌及單核細胞增生性李斯特菌的污染的應用。
背景技術：
：奶牛乳房炎不僅給世界乳品工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，而且還危害到公共衛(wèi)生和人類健康。引起奶牛乳房炎的主要原因是病原微生物感染，其中以金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)、鏈球菌和大腸桿菌為主，約占奶牛乳房炎病例的90％以上。奶牛乳房炎最直接的治療途徑是使用抗生素，但治療過程中乳汁會殘留抗生素，從而會對人體產(chǎn)生一定的危害，更為嚴重的是，病原會因抗生素的長期攝入及高效量的濫用產(chǎn)生耐藥毒力株。目前更多的途徑是防治奶乳房炎的發(fā)生，防重于治，從而有利于養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展。李斯特菌(Listeria)是一種能夠引起動物和人李斯特菌病的革蘭氏陽性細菌，其中單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是最重要的食源性人獸共患病原菌，主要表現(xiàn)為胃腸炎、敗血癥、腦膜腦炎和流產(chǎn)等，死亡率高達25-30％。在自然界中，Lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰場廢棄物及動物源食品中(肉、奶及其制品、海產(chǎn)品等)，且與大多數(shù)人源病原菌不同的是Lm在低溫環(huán)境中仍可生長繁殖(如2～8℃)，是冷藏食品以及即食(Ready-To-Eat,RTE)食品中威脅人類健康的重要病原菌之一。目前在牛奶以及多種即食性食品中均檢測到李斯特菌，其在食品中的污染令人堪憂，且新分離的病原不僅耐藥且對食品中是化學消毒劑均產(chǎn)生一定耐受性，如何有效的控制李斯特菌的污染已成為食品安全中的重大課題。噬菌體是一類細菌依賴性的病毒，又稱細菌病毒。裂解性噬菌體感染細菌后，可在宿主菌內快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。裂解酶是雙鏈DNA噬菌體所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌體表達的一類肽糖水解酶，該酶通過水解細菌細胞壁肽糖上糖與肽間的酰胺鍵或肽內氨基酸殘基間的連鍵最終使宿主細胞裂解。溶壁酶不僅特異性作用于宿主，且作用時間短，作用譜較噬菌體廣。裂解酶具有高效、特異且不產(chǎn)生抗性等特點，目前在食品及醫(yī)藥行業(yè)已有成功應用的報道。在食品中，由于裂解酶能夠作為抗菌劑來控制細菌污染，且作用快、無殘留、無副作用，具有廣泛的開發(fā)和應用價值。技術實現(xiàn)要素：發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼一種多功能裂解酶。技術方案一種多功能裂解酶，其特征在于其氨基酸序列為SeqIDNO.2。一種多功能裂解酶的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為SeqIDNO.1。一種表達多功能裂解酶的制備方法，具體步驟如下：1)合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶酰胺酶活性的N端序列NO.3，合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶結合功能的SH3bNO.4，從李斯特菌噬菌體裂解酶序列中獲得能夠結合細胞壁的C端結合結構域序列NO.5，對三段序列進行連接獲得重構酶片段；2)構建表達多功能裂解酶的重組表達載體；3)將重組表達載體轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選得到表達多功能裂解酶的工程菌；4)異丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷誘導表達，獲得重組基因表達產(chǎn)物；5)將重組基因表達產(chǎn)物，經(jīng)鎳柱親和層析純化分離，得到重組的多功能裂解酶；6)將純化的多功能裂解酶產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒進行去毒處理即≤0.01EU/μg內毒素。所述的一種多功能裂解酶在用于消毒擠奶器具后控制奶牛養(yǎng)殖過程中奶牛乳房炎的發(fā)生及牛乳中金黃色葡萄球和單核細胞增生性李斯特菌污染控制的應用。所述的一種多功能裂解酶在制備同時抑制金黃色葡萄球菌及單核細胞增生性李斯特菌污染或過度生長藥物的應用。所述的一種多功能裂解酶在制備抑制金黃色葡萄球和單核細胞增生性李斯特菌污染或過度生長藥物應用，其特征在于所述的食品為由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。所述的一種多功能裂解酶的應用，其特征在于用重組表達的多功能裂解酶產(chǎn)物制成殺菌劑。所述的一種多功能裂解酶的應用，其特征在于：將純化的多功能裂解酶產(chǎn)物與賦形劑復配后，用來即食性食品包裝前抑制食品中金黃色葡萄球和單核細胞增生性李斯特菌的污染。所述原核細胞表達載體為pET-28a(+)。所述溶壁酶基因被插入pET-28a(+)的EcoRⅠ和XhoI酶切位點。所述的工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)，培養(yǎng)溫度為37℃。所述誘導表達所用的誘導劑為IPTG，誘導濃度為0.5～1.0mmol/L，誘導表達的溫度為20～26℃。所述的分離純化步驟包括鎳親和層析。有益效果本發(fā)明涉及到的溶壁酶序列是全新序列，其能夠高效殺滅金黃色葡萄球和單核細胞增生性李斯特菌，該序列制成的制劑可以單獨或復配使用為目前預防奶牛乳房炎及控制食品中金黃色葡萄球和單核細胞增生性李斯特菌污染提供一種安全、無毒副作用的酶制劑來源。附圖說明圖1多功能裂解酶LysKZ190表達產(chǎn)物的鑒定分析泳道1：純化的裂解酶蛋白LysKZ190M:蛋白分子質量Maker圖2多功能裂解酶LysKZ190的殺菌活性鑒定圖3多功能裂解酶LysKZ190在牛奶中的殺菌效果具體實施方式本發(fā)明試驗用噬菌體宿主菌金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus，ATCC25923)購自美國標準菌種收藏中心(ATCC)；單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，保藏號：GIM1.228)購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。λ噬菌體基因組快速提取試劑盒(北京艾比根生物技術有限公司)。實施例1：多功能裂解的構建a)合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶酰胺酶活性的N端序列NO.3，合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶結合功能的SH3bNO.4，從李斯特菌噬菌體裂解酶序列中獲得能夠結合細胞壁的C端結合結構域序列NO.5，對三段序列進行連接獲得重構酶片段；b)將合成的片段通過EcoRⅠ和XhoI位點插入表達載體pET28a(+)中，構建表達多功能裂解酶的重組表達載體pET-LysKZ190；c)將測序正確的質粒pET-LysKZ190轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。將轉化的菌液涂布于含有卡那青霉素(100μg/ml)的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取陽性克隆接種于含卡那青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，對陽性克隆進行PCR及測序列鑒定，重組菌命名為DE3(pET-LysKZ190)。實施例2：多功能裂解酶LysKZ190的誘導表達及純化將重組菌DE3(pET-LysKZ190)接種到含卡那青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)；次日，按1:100比例轉接至100mLLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.5時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，28℃誘導5h。收集菌體，超聲波破碎細胞，4℃，10,000rpm/min離心10min，收集上清，并將上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾，SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表達情況。將過濾的裂解上清用His親和層析鎳柱(GEHealthcare,Sweden)純化，具體按試劑盒說明步聚進行。將純化的裂解酶LysKZ190產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒(Novagen公司)進行去毒處理(≤0.01EU/μg內毒素)，進一步進行SDS-PAGE分析蛋白純化效果。SDS-PAGE分析結果如圖1所示，重組菌DE3(pET-LysKZ190)經(jīng)IPTG誘導后，其上清純化的融合his蛋白在58kD的位置有較粗的誘導蛋白條帶，與預期大小相符，從而表明，表達的多功能裂解酶蛋白產(chǎn)物LysKZ190為可溶性蛋白，其純化濃度經(jīng)測定為1.2mg/ml。實施例3：多功能裂解酶裂解活性鑒定將金黃色葡萄球菌ATCC25923及單核細胞增生性李斯特菌GIM1.228培養(yǎng)至OD600＝0.8，用PBS洗滌后重懸，取900μl，加入100μl(100μg)純化的裂解酶產(chǎn)物，混勻，室溫下作用1h，用分光光度計動態(tài)測定菌液的OD600值，OD600的下降表明細菌被裂解。結果如圖2所示，純化的LysKZ190產(chǎn)物對兩種菌均有具有良好的裂解活性，在作用1h后，OD值從起始的0.8分別降到0.21和0.30，表明多功能裂解酶LysKZ190裂解活性較強。實施例4：多功能裂解酶LysKZ190在牛奶中的滅菌作用將巴氏殺菌牛奶分裝為兩組，A組接種宿主菌金黃色葡萄球菌ATCC25923及單核細胞增生性李斯特菌各105cfu/mL，加入100μg的LysKZ190蛋白；B組中僅加入金黃色葡萄球菌及單核細胞增生性李斯特菌作為對照，同時設PBS對照。將制備好的樣品分別置于25℃(即室溫)，在作用3h后檢測宿主菌數(shù)量。結果如圖3所示，25℃作用3h后，金黃色葡萄球菌及單核細胞增生性李斯特菌數(shù)量分別下降了約3.57log和3.88log，與對照組比較呈顯著性差異，從而表明LysKZ190在食品中有具有良好的殺菌作用，能夠應用于食品的生物防控。實施例5多功能裂解酶LysKZ190在預防奶牛乳炎中的抗菌效果選自某奶牛場奶牛10頭(顯示疑似奶牛乳房炎表癥)，隨機分為2組。A組為LysKZ190預防組：將擠奶器具用含有多功能裂解酶的溶液(100μg/10ml)進行接觸表面涂擦，再行擠奶，并在擠完奶后再次將乳房洗凈擦干后用含有多功能裂解酶的溶液(500μg/50ml)直接涂擦乳房表面。B組為對照組，僅洗凈擦干，不用任何藥物。A組及B組用藥均為每天早晚各2次，連用7天為一個預防療程。由表1可以看出，經(jīng)多功能裂解酶LysKZ190預防的A組，體細胞數(shù)與初始數(shù)量比較有顯著下降；而對照組中，體細胞數(shù)沒有顯著變化，且體細胞數(shù)仍高于正常體細胞數(shù)，表明伴有一定的炎癥，需要加強預防，從而防止奶牛乳房炎的發(fā)病。表1不同藥物治療奶牛乳房炎病牛的體細胞數(shù)檢測結果組別用藥用酶前體細胞數(shù)(萬/ml)用酶后體細胞數(shù)(萬/ml)A裂解酶組51.0±47.133.5±28.3B對照組49.0±39.750.5±29.4SEQUENCELISTING<110>江蘇省農業(yè)科學院<120>一種多功能裂解酶及其制備方法和應用<130><160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1374<212>DNA<213>人工序列<400>1atgggatacaaagcagaaccgaaacctacaactcattttgttgcactgcctaaaacgata60aaacatagtttaatcgtcgatgttgatgcttattatggtttggactcggcaatcgattta120cctaactatattttttacgttggtagtaatagatactggaactttaagacaccaggcaac180gcaagagctatgcctgaaggggattttgtctataaagtgcggcaatgtaacacttctaga240tctcctaaaccagcactgtggacaggtggtgcatggtatgcaaattatagatatggtcca300tcaactaaaagtaaatacaattggaacacttggggacacactaaacaggtggttggtatt360gttgtatacttttatagtgaagatcagtctaactctcctgcagcaggtaaaccaacgaag420tttggtgtaagacccggcagtggtggtgatatactaccaaattggaataacgt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