本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求于2014年6月4日提交的標題為“免疫調(diào)節(jié)劑通過脂質(zhì)體球形核酸的多價遞送以用于預防或治療應用”的美國臨時申請系列號No.62/007,528的優(yōu)先權(quán)，其通過引用整體并入本文。

發(fā)明背景

免疫系統(tǒng)是細胞和體液組分的復雜網(wǎng)絡，所述細胞和體液組分一致地作用以識別身體中的外來和潛在危險物質(zhì)，并以高度靶向和受控的方式消除它們。它通常可以分為先天性和適應性免疫系統(tǒng)。先天免疫系統(tǒng)是種系編碼的，并且被設(shè)計為對病原體上存在的保守基序進行應答。適應性免疫系統(tǒng)通過受控的體細胞重組過程產(chǎn)生其抗原特異性集庫，并可以以精確的特異性對廣泛多樣的抗原類型進行應答。刺激先天和適應性免疫應答已被證明是治療或預防動物、動物疾病模型和人類中的廣泛多樣的疾病的有效策略。

免疫調(diào)節(jié)方法在治療或預防各種傳染病中的成功是非凡的。盡管如此，可能有可以使用免疫治療方法來解決的更多的疾病。兩個關(guān)鍵的限制仍然是：(1)用在最佳時間和以最佳比例遞送的正確信號適當?shù)匾龑忍烀庖呒毎?，以安全地增強其功能，同時還提供誘導適應性免疫應答的合適環(huán)境，和(2)鑒定應該由自適應性應答靶向的正確的抗原或抗原組合。

用于刺激免疫應答的當前方法很大程度上取決于已知單獨地為免疫調(diào)節(jié)性的化合物的混合物。目前，在臨床中使用的化合物是免疫刺激劑的成批混合物，任選地與抗原組合，其已經(jīng)根據(jù)經(jīng)驗被確定分別誘導先天和適應性免疫應答。盡管近一個世紀的發(fā)展，常規(guī)方法僅產(chǎn)生了兩種FDA批準的免疫刺激劑：(1)明礬，其是鋁鹽的組合，和(2)單磷酰脂質(zhì)A。雖然明礬特別地具有令人印象深刻的安全記錄和在感染性疾病上的功效，但越來越清楚的是，這些藥劑不足以誘導有效的免疫應答以對抗更復雜的疾病，例如細胞內(nèi)病原體、癌癥、過敏和過敏性疾病等。開發(fā)新的免疫刺激劑的努力在很大程度上是不成功的，主要是由于缺乏效力或由于安全性問題。

免疫系統(tǒng)經(jīng)過幾千年發(fā)展以對病原體如細菌、病毒、真菌和蠕蟲進行應答。因此，大多數(shù)免疫細胞被優(yōu)化以識別、吞噬、加工和然后響應存在于微生物上的基序，并且具有被“調(diào)節(jié)”至通常存在于這些生物體上的比例的受體。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的方面提供了用作多價免疫調(diào)節(jié)劑的脂質(zhì)體球形核酸。在一些方面，本發(fā)明基于納米結(jié)構(gòu)，其包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸。

在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸形成寡核苷酸殼。

在其它實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸形成寡核苷酸殼，其中寡核苷酸殼包含至少一種模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸。

在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸形成寡核苷酸殼，其中寡核苷酸殼包含至少一種模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸，其中模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸是TLR激動劑。

在其它實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸形成寡核苷酸殼，其中寡核苷酸殼包含至少一種模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸，其中模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸是TLR拮抗劑。

在其它實施方案中，TLR選自TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和TLR13。

在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸形成寡核苷酸殼，其中寡核苷酸殼包含至少一種模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸，其中模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸是RIG-I激動劑。

在其它實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸形成寡核苷酸殼，其中寡核苷酸殼包含至少一種模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸，其中模式識別受體調(diào)節(jié)寡核苷酸是RIG-I拮抗劑。

在一些實施方案中，寡核苷酸殼包含寡核苷酸和載體分子。

在一些實施方案中，其中寡核苷酸殼完全由寡核苷酸組成。

在一些實施方案中，寡核苷酸包含單鏈或雙鏈DNA寡核苷酸。

在其它實施方案中，寡核苷酸包含單鏈或雙鏈RNA寡核苷酸。

在其它實施方案中，寡核苷酸包含嵌合RNA-DNA寡核苷酸。

在另一個實施方案中，寡核苷酸包含單鏈或雙鏈DNA、RNA或嵌合RNA-DNA寡核苷酸的組合。

在另一個實施方案中，寡核苷酸殼的寡核苷酸具有結(jié)構(gòu)相同的寡核苷酸。

在一些實施方案中，寡核苷酸殼的寡核苷酸具有至少兩種結(jié)構(gòu)不同的寡核苷酸。

在其它實施方案中，寡核苷酸殼的寡核苷酸具有2-10個不同的核苷酸序列。

在一些實施方案中，寡核苷酸具有至少一個硫代磷酸酯鍵。

在其它實施方案中，寡核苷酸不具有硫代磷酸酯鍵。

在另一個實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含含CpG基序的寡核苷酸。

在一些實施方案中，CpG寡核苷酸選自A類、B類和C類CpG寡核苷酸。

在另一個實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含免疫刺激性單鏈或雙鏈RNA。

在一些實施方案中，至少一種寡核苷酸的5'-末端暴露于納米結(jié)構(gòu)的外表面。

在其它實施方案中，所有寡核苷酸的5'-末端暴露于納米結(jié)構(gòu)的外表面。

在另一個實施方案中，寡核苷酸直接連接至脂質(zhì)體核心。

在一些實施方案中，寡核苷酸通過接頭間接連接至脂質(zhì)體核心。

在其它實施方案中，寡核苷酸通過多于一個接頭間接連接至脂質(zhì)體核心。

在另一個實施方案中，接頭是一個或多個以下接頭：生育酚，鞘脂如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇，神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺磷酸酯，1-0?；窠?jīng)酰胺，二氫神經(jīng)酰胺，2-羥基神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，鞘磷脂，和各種長度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂如磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰膽堿，磷脂酸，溶血磷脂酸，環(huán)狀LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，溶血磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸酯，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，雙(單?；视?磷酸酯，(二酰基甘油)磷酸酯，醚脂，二植烷醚脂質(zhì)，和各種長度和飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物，甾醇如膽固醇，去氫膽甾醇，豆甾醇，羊毛甾醇，烯膽甾烷醇，薯蕷皂苷配基，谷甾醇，酵母甾醇，zymostenol，14-脫甲基-羊毛甾醇，膽甾醇硫酸酯，DHEA，DHEA硫酸酯，14-脫甲基-14-脫氫羊毛甾醇，谷甾烷醇，菜油甾醇，醚陰離子脂質(zhì)，醚陽離子脂質(zhì)，鑭系螯合脂質(zhì)，A-環(huán)取代氧化甾醇，B-環(huán)取代氧化甾醇，D-環(huán)取代氧化甾醇，側(cè)鏈取代氧化甾醇，雙取代氧化甾醇，膽甾烷酸衍生物，氟化甾醇，熒光甾醇，磺化甾醇，磷酸化甾醇，不同長度、飽和狀態(tài)的多不飽和甾醇，飽和C8-C22脂肪酸，甘油的飽和C8-C22醚衍生物，C8-C22脂肪酸的飽和和不飽和酰胺衍生物以及單-和1,2-或1,3-二氨基甘油及其衍生物。

在另一個實施方案中，寡核苷酸包含2-1,000個寡核苷酸。

在一些實施方案中，脂質(zhì)體核心包含選自以下的一種或多種脂質(zhì)：鞘脂如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇，神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺磷酸酯，1-0?；窠?jīng)酰胺，二氫神經(jīng)酰胺，2-羥基神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，鞘磷脂，和各種長度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂如磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰膽堿，磷脂酸，溶血磷脂酸，環(huán)狀LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，溶血磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸酯，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，雙(單?；视?磷酸酯，(二?；视?磷酸酯，醚脂，二植烷醚脂質(zhì)，和各種長度和飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物，甾醇如膽固醇，去氫膽甾醇，豆甾醇，羊毛甾醇，烯膽甾烷醇，薯蕷皂苷配基，谷甾醇，酵母甾醇，zymostenol，14-脫甲基-羊毛甾醇，膽甾醇硫酸酯，DHEA，DHEA硫酸酯，14-脫甲基-14-脫氫羊毛甾醇，谷甾烷醇，菜油甾醇，醚陰離子脂質(zhì)，醚陽離子脂質(zhì)，鑭系螯合脂質(zhì)，A-環(huán)取代氧化甾醇，B-環(huán)取代氧化甾醇，D-環(huán)取代氧化甾醇，側(cè)鏈取代氧化甾醇，雙取代氧化甾醇，膽甾烷酸衍生物，氟化甾醇，熒光甾醇，磺化甾醇，磷酸化甾醇，不同長度、飽和狀態(tài)的多不飽和甾醇，飽和C8-C22脂肪酸，甘油的飽和C8-C22醚衍生物，C8-C22脂肪酸的飽和和不飽和酰胺衍生物以及單-和1,2-或1,3-二氨基甘油及其衍生物。

在另一個實施方案中，脂質(zhì)體核心包含一種類型的脂質(zhì)。

在一些實施方案中，脂質(zhì)體核心包含2-10種不同的脂質(zhì)。

在其它實施方案中，其中免疫刺激劑選自單磷酰脂質(zhì)A，來自細菌來源的脂質(zhì)A，22:0海藻糖，二甲基雙十八烷基銨，Kdo2脂質(zhì)A，肌醇磷酸酯，包括IP3(1,3,4)，IP3(1,3,5)，IP3(1,4,5)，IPR(1,3,4,5)，LPA/S1P受體選擇性激動劑，PAF和PAF類似物，脂核苷酸，環(huán)狀LPA，生物活性神經(jīng)酰胺，內(nèi)源性大麻素，大麻素，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，二酰基甘油磷酸酯，細菌膜脂質(zhì)，N-?；拾彼嶂|(zhì)，酰基肉堿脂質(zhì)，分枝菌酸，植物脂質(zhì)提取物，F(xiàn)SL-1，PAM3CSK4，HKLM，LPS，F(xiàn)LA-ST，咪喹莫特，瑞喹莫德，C12-IE-DAP，L18-MDP toll樣受體激動劑，NOD受體激動劑，和促炎免疫受體激動劑。

在另一個實施方案中，納米結(jié)構(gòu)還包含抗原。

在一些實施方案中，抗原與納米結(jié)構(gòu)混合在一起。

在其它實施方案中，抗原直接連接至寡核苷酸殼。

在一些實施方案中，抗原通過接頭與寡核苷酸殼間接連接。

在其它實施方案中，抗原直接直接連接至脂質(zhì)體核心。

在另一個實施方案中，抗原通過接頭間接連接至脂質(zhì)體核心。

在另一個實施方案中，其中抗原-寡核苷酸綴合物通過寡核苷酸雜交連接至脂質(zhì)體核心。

在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中所述免疫刺激劑通過嵌入脂質(zhì)體核心內(nèi)與脂質(zhì)體核心結(jié)合。

在其它實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中免疫刺激劑通過間接連接至脂質(zhì)體核心而與脂質(zhì)體核心結(jié)合。

在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中免疫刺激劑通過直接連接至脂質(zhì)體核心而與脂質(zhì)體核心結(jié)合。

在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)包含具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其中免疫刺激劑或免疫抑制劑與脂質(zhì)雙層結(jié)合，以及位于脂質(zhì)體核心外部的寡核苷酸，其中寡核苷酸形成寡核苷酸殼，其中寡核苷酸殼的寡核苷酸徑向向外定向。

在其它實施方案中，接頭選自生育酚，鞘脂如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇，神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺磷酸酯，1-0?；窠?jīng)酰胺，二氫神經(jīng)酰胺，2-羥基神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，鞘磷脂，和各種長度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂如磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰膽堿，磷脂酸，溶血磷脂酸，環(huán)狀LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，溶血磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸酯，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，雙(單?；视?磷酸酯，(二?；视?磷酸酯，醚脂，二植烷醚脂質(zhì)，和各種長度和飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物，甾醇如膽固醇，去氫膽甾醇，豆甾醇，羊毛甾醇，烯膽甾烷醇，薯蕷皂苷配基，谷甾醇，酵母甾醇，zymostenol，14-脫甲基-羊毛甾醇，膽甾醇硫酸酯，DHEA，DHEA硫酸酯，14-脫甲基-14-脫氫羊毛甾醇，谷甾烷醇，菜油甾醇，醚陰離子脂質(zhì)，醚陽離子脂質(zhì)，鑭系螯合脂質(zhì)，A-環(huán)取代氧化甾醇，B-環(huán)取代氧化甾醇，D-環(huán)取代氧化甾醇，側(cè)鏈取代氧化甾醇，雙取代氧化甾醇，膽甾烷酸衍生物，氟化甾醇，熒光甾醇，磺化甾醇，磷酸化甾醇，不同長度、飽和狀態(tài)的多不飽和甾醇，飽和C8-C22脂肪酸，甘油的飽和C8-C22醚衍生物，C8-C22脂肪酸的飽和和不飽和酰胺衍生物以及單-和1,2-或1,3-二氨基甘油及其衍生物。

在一些實施方案中，抗原在內(nèi)部水層中包封在脂質(zhì)體核心內(nèi)。

在其它實施方案中，抗原非共價地連接至寡核苷酸殼的寡核苷酸上。

在其它實施方案中，抗原選自癌抗原、細菌抗原、病毒抗原、寄生蟲抗原、半抗原和過敏原。

在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)是自組裝納米結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的另一方面包括用于治療受試者的方法，包括向受試者施用有效量的核酸納米結(jié)構(gòu)以促進免疫應答。

在一個實施方案中，所述受試者患有病癥，并且其中所述方法是用于治療所述病癥的方法。

在另一個實施方案中，所述病癥是癌癥。

在一些實施方案中，所述病癥是傳染病。

在其它實施方案中，感染性疾病是病毒感染。

在一些實施方案中，感染性疾病是細菌感染。

在另一個實施方案中，所述病癥是過敏癥。

在一些實施方案中，所述病癥是哮喘。

在另一個實施方案中，所述病癥是自身免疫疾病。

在一些實施方案中，進一步包括對受試者施用治療方案。

在另一個實施方案中，治療方案是手術(shù)。

在一些實施方案中，治療方案是放射。

在其它實施方案中，治療方案是藥物。

在一個實施方案中，所述方法還包括施用佐劑。

在一個實施方案中，所述受試者患有病癥，并且其中所述方法是用于治療所述病癥的方法，其中所述納米結(jié)構(gòu)與靶向分子結(jié)合。

在一個實施方案中，受試者患有病癥，并且其中所述方法是治療所述病癥的方法，其中所述納米結(jié)構(gòu)通過選自口服、鼻、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、呼吸、直接注射、灌腸和皮膚的途徑遞送。

在另一方面，用于治療疾病的組合物包含核酸納米結(jié)構(gòu)及其實施方案。

本發(fā)明的每個限制可以包括本發(fā)明的各種實施方案。因此，預期涉及任何一個元件或元件組合的本發(fā)明的每個限制可以包括在本發(fā)明的每個方面中。本發(fā)明在其應用中不限于在以下描述中闡述或在附圖中示出的構(gòu)造的細節(jié)和組分的布置。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)其它實施方案并且能夠以各種方式實踐或執(zhí)行。在所附的詳細描述、實施例、權(quán)利要求和附圖中示出了本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將根據(jù)本說明書和權(quán)利要求書而變得明顯。

附圖說明

附圖不旨在按比例繪制。在附圖中，在各個圖中示出的每個相同或幾乎相同的組分由相似的附圖標記表示。為了清楚起見，不是每個組分都可以在每個附圖中標記。在附圖中：

圖1顯示了用于共遞送寡核苷酸和親脂性免疫刺激劑的本發(fā)明的示例性脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)的一般結(jié)構(gòu)。納米結(jié)構(gòu)包括：(1)脂質(zhì)體核心，其含有連接至并可能嵌入脂質(zhì)雙層中的親脂性免疫刺激劑(TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR6等)，和(2)寡核苷酸殼，其具有雙重功能，因為其有助于將整個構(gòu)建體靶向至免疫細胞，并且還用于刺激可識別核酸的免疫受體(TLR3、TLR7、TLR8、TLR9，TLR13，RIG-I等)。

圖2顯示了用于共遞送寡核苷酸和親脂性免疫刺激劑和抗原的另一示例性抗原綴合的脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)的一般結(jié)構(gòu)。該構(gòu)建體與圖1所示的構(gòu)建體相似，但包括另外的修飾，其中抗原綴合的寡核苷酸非共價地連接至母體結(jié)構(gòu)?？乖ㄟ^與寡核苷酸殼的相互作用與脂質(zhì)體SNA綴合。

圖3顯示了用于共遞送寡核苷酸和親脂性免疫刺激劑和抗原的抗原-綴合的脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)的另一種通用結(jié)構(gòu)?？乖部梢园庠谥|(zhì)體核心中。

圖4是顯示通過脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)刺激TLR4和TLR9兩者誘導比單獨的任一誘導更大的活化的圖。攜帶TLR4和TLR9的激動劑的脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)誘導比單獨的任一誘導更大的RAW Blue細胞的活化。

圖5A-5B是一組柱狀圖，其顯示MPLA對NF-kB的活化依賴于功能性TLR4。通過含MPLA的脂質(zhì)體SNA對NF-kB的活化依賴于功能性TLR4，因為RAW Blue細胞系(圖5A)而不是Ramos Blue細胞系(圖5B)顯示響應于刺激的NF-kB活化。單因素ANOVA****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01。

圖6A-6B是一組柱狀圖，其顯示CpG和MPLA的納米結(jié)構(gòu)共遞送最佳地活化MyD88-依賴性和非依賴性途徑。在單一構(gòu)建體中遞送CpG 1826和MPLA兩者的脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)顯示不能通過單獨遞送每一個或通過在相同的孔中而在非相同構(gòu)建體上遞送兩種組分重復的升高的TNF(圖6A)和IFN-α(圖6B)水平。ANOVA，**p<0.01，****p<0.0001。

圖7A-7B是一組柱狀圖，其顯示MPLA的脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)遞送改善NF-kB的活化，即使沒有CpG基序。圖7A顯示NF-kB活化，圖7B顯示TNF(OD)。單因素ANOVA****p<0.0001。

圖8是顯示MPLA進料至納米結(jié)構(gòu)制劑中在3.8％以上但不超過7.7％的增加提高活性的圖。在RAW Blue細胞系中，觀察到將MPLA進料增加至7.7％MPLA但不高至11.5％增加了脂質(zhì)體SNA的活化效力。

圖9是一組圖表，其顯示在11.5％MPLA(上圖)或7.7％MPLA(下圖)，在鼠免疫細胞中硫代磷酸酯(PS)鍵增加效力但不增加最大刺激。在RAW Blue細胞中，在脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)的效力中觀察到偏移，但是在最大刺激中沒有觀察到偏移，盡管預期這是物種依賴性的。

圖10是顯示抗原綴合的脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)顯示免疫細胞活化的圖。

圖11是顯示納米結(jié)構(gòu)比游離PS寡核苷酸和明礬更有效地誘導細胞應答的圖。在第0天和第21天使用卵白蛋白作為模型抗原，用指定的制劑免疫C57BL/6小鼠(N＝4/組)。在第28天，收集脾細胞，并在具有1uM OVA(257-264)的IFN-γELISPOT板上孵育過夜。使用自動化ELISPOT計數(shù)器定量IFN-γ斑點的數(shù)量。*p<0.05，NS＝非顯著性

圖12是顯示具有抗原的中空納米結(jié)構(gòu)降低腫瘤生長速率的圖。在第0天用1×10⁶E.G7-OVA細胞接種C57BL/6小鼠(N＝10/組)，然后在第3、7、10天用指定化合物處理。

本發(fā)明的某些實施方案的詳細描述

Toll樣受體(TLR)是模式識別受體(PRR)家族，其觸發(fā)先天免疫細胞的活化，促進其效應子功能和橋接先天和適應性免疫。刺激TLR的藥劑作為潛在的治療和預防化合物被廣泛研究，因為這些受體在協(xié)調(diào)免疫應答中起著中心作用。類似于當免疫細胞處理病原體時刺激多種TLR和免疫受體的方式，已經(jīng)顯示用多種化合物刺激多種TLR可以產(chǎn)生更大的功效。然而，有效地組合遞送多種TLR激動劑可能是相當困難的，原因如下：(1)通常僅在兩種化合物之間的固定濃度比的窄窗口中觀察到協(xié)同作用，這是由于它們通常具有不同的IC50或EC50值，(2)不同的物理化學性質(zhì)(例如不同的大小、電荷和疏水性)可以使它們彼此的連接變得困難或使它們具有完全不同的PK/PD/ADME性質(zhì)，(3)化合物的毒性水平傾向于是不同的，和(4)一種或多種不同化合物的靶受體可能是不可接近的，例如胞質(zhì)溶膠，或位于降解區(qū)室如內(nèi)體或溶酶體中。

根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)開發(fā)了具有意想不到的高免疫調(diào)節(jié)活性的新型納米結(jié)構(gòu)。這些納米結(jié)構(gòu)是超分子組裝體，其是免疫調(diào)節(jié)脂質(zhì)體球形核酸(有時稱為SNA)。這些納米結(jié)構(gòu)可以以高度時空受控的方式向細胞遞送免疫調(diào)節(jié)材料的組合(實例顯示在圖1-3中)。這些納米結(jié)構(gòu)的顯著特征是在外殼內(nèi)以及在核心內(nèi)摻入免疫調(diào)節(jié)材料，其協(xié)同作用以在免疫反應的量級和質(zhì)量方面實現(xiàn)意想不到的免疫調(diào)節(jié)效應。這些免疫調(diào)節(jié)效應不能通過單獨地或組合地遞送材料而不是在相同構(gòu)建體中物理地結(jié)合在一起來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)證明，將所有組分組裝成單個結(jié)構(gòu)對于實現(xiàn)最佳效果是至關(guān)重要的(數(shù)據(jù)在圖6-7中示出)。

除了上述以外，還開發(fā)了用于實現(xiàn)抗原與多價免疫調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的共遞送的方法(實例描述于圖2-3中)。這使得這些構(gòu)建體能夠遞送抗原和共刺激信號以橋接先天和適應性免疫以誘導針對各種疾病的強力免疫應答(刺激應用)或通過在不存在共刺激的情況下遞送抗原來引發(fā)抗原特異性耐受，通過缺乏刺激信號或通過用拮抗劑分子阻斷免疫信號傳導來實現(xiàn)，從而導致效應細胞無反應或調(diào)節(jié)性T細胞的誘導(調(diào)節(jié)應用)。

目前，在臨床中用于誘導免疫效應的方法通常分為兩類：1)活化或加強免疫應答的化合物，例如疫苗和佐劑，toll樣受體的小分子激動劑如咪喹莫特和瑞喹莫德，或寡核苷酸如ISS 1018(Dynavax Technologies Corporation，等，以及2)用于減少不想要的免疫應答的化合物，例如皮質(zhì)類甾醇、環(huán)孢菌素和他克莫司。這些化合物具有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的顯著限制。

一般來說，現(xiàn)有技術(shù)中的免疫刺激嘗試受到缺乏活化針對靶抗原的強烈的細胞免疫應答的能力的限制，導致不能開發(fā)用于各種感染性疾病(例如HIV，結(jié)核病，瘧疾，登革熱，衣原體等)的有效和成本有效的疫苗。類似地，用于癌癥的各種實驗疫苗化合物在晚期臨床試驗中未能達到其主要終點。尚未令人滿意地滿意的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是能夠獲得優(yōu)異結(jié)果的抗原和免疫刺激劑的制劑。本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了這些目標，在體內(nèi)產(chǎn)生對抗原的強細胞應答的活化，提供了腫瘤負荷的顯著(95％)減少的證據(jù)(圖12)。

本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)包含：(1)具有脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)體核心，其含有嵌入或連接至脂質(zhì)雙層的免疫刺激物，和(2)寡核苷酸層，其可以是寡核苷酸殼，并且其具有雙重功能，因為它們有助于將納米結(jié)構(gòu)靶向至免疫細胞，并且還起到刺激可以識別核酸的免疫受體的作用(圖1)?？乖部梢耘悸?lián)到該構(gòu)建體，使得其將與共刺激信號一起遞送(圖2)。與圖1所示的構(gòu)建體相似的構(gòu)建體經(jīng)歷另外的修飾，由此將抗原綴合的寡核苷酸連接至納米結(jié)構(gòu)?；蛘呋蛄硗?，可將水溶性免疫刺激劑或抗原包封在核心中。

本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)包括脂質(zhì)體核心。本文使用的脂質(zhì)體核心是指由形成脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)或磷脂的組分形成的位于中心的核心區(qū)室?！爸|(zhì)體”是各種大小和結(jié)構(gòu)的人工的、自閉的囊泡結(jié)構(gòu)，其中一個或幾個膜包封水性核心。最通常地，脂質(zhì)體膜由脂質(zhì)雙層膜形成，其中親水性頭部基團朝向水性環(huán)境定向，并且脂質(zhì)鏈嵌入在親脂性核心中。脂質(zhì)體也可以由其它兩親性單體和聚合物分子(例如聚合物，如嵌段共聚物或多肽)形成。單層囊泡是由包封水性空間的單個膜限定的脂質(zhì)體。相比之下，寡層或多層囊泡由幾個膜構(gòu)成。通常，膜大約4nm厚并且包含天然或合成來源的兩親性脂質(zhì)(例如磷脂)。任選地，膜性質(zhì)可以通過摻入其它脂質(zhì)例如甾醇或膽酸衍生物來改變。

脂質(zhì)雙層包含兩層脂質(zhì)分子。層中的每個脂質(zhì)分子基本上平行于相鄰脂質(zhì)雙層定向，并且形成雙層的兩個層具有其分子的暴露于水相的極性末端和彼此相鄰的非極性末端，如圖1-3中所示。脂質(zhì)體核心的中心含水區(qū)可以是空的或用水、水性乳液、抗原、免疫刺激劑、免疫抑制劑或其它治療劑或診斷劑完全或部分填充。

“脂質(zhì)”是指其常規(guī)含義，其是包括不溶于水的原生質(zhì)的醇-醚可溶性成分、脂肪、脂質(zhì)的通用術(shù)語。脂質(zhì)通常由親水部分和疏水部分組成。在水中，脂質(zhì)可以自組織以形成雙層膜，其中親水部分(頭基)朝向水相定向，并且親脂部分(?；?嵌入雙層核心中。脂質(zhì)還可以包含兩個親水部分(bola兩親物)。在這種情況下，膜可以由單個脂質(zhì)層而不是雙層形成。在本文中脂質(zhì)的典型實例是脂肪，脂肪油，精油，蠟，類甾醇，甾醇，磷脂，糖脂，硫脂，氨基脂，色脂和脂肪酸。該術(shù)語包括天然存在的和合成的脂質(zhì)。與本發(fā)明相關(guān)的優(yōu)選脂質(zhì)是：類甾醇和甾醇，特別是膽甾醇，磷脂，包括磷脂酰，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。當存在脂肪酸時，它們可以是長度為約12-24個碳的鏈，含有至多6個雙鍵。脂肪酸連接至主鏈，其可以源自甘油。一種脂質(zhì)中的脂肪酸可以是不同的(不對稱的)，或者可以僅存在1個脂肪酸鏈，例如溶血卵磷脂?；旌现苿┮彩强赡艿?，特別是當非陽離子脂質(zhì)來源于天然來源時，例如從蛋黃、牛心、腦、肝或大豆純化的卵磷脂(磷脂酰膽堿)。

脂質(zhì)體核心可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種脂質(zhì)構(gòu)建，包括但不限于：鞘脂如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇，神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺磷酸酯，1-0?；窠?jīng)酰胺，二氫神經(jīng)酰胺，2-羥基神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，鞘磷脂，和各種長度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂如磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰膽堿，磷脂酸，溶血磷脂酸，環(huán)狀LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，溶血磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸酯，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，雙(單酰基甘油)磷酸酯，(二?；视?磷酸酯，醚脂，二植烷醚脂質(zhì)，和各種長度和飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物，甾醇如膽固醇，去氫膽甾醇，豆甾醇，羊毛甾醇，烯膽甾烷醇，薯蕷皂苷配基，谷甾醇，酵母甾醇，zymostenol，14-脫甲基-羊毛甾醇，膽甾醇硫酸酯，DHEA，DHEA硫酸酯，14-脫甲基-14-脫氫羊毛甾醇，谷甾烷醇，菜油甾醇，醚陰離子脂質(zhì)，醚陽離子脂質(zhì)，鑭系螯合脂質(zhì)，A-環(huán)取代氧化甾醇，B-環(huán)取代氧化甾醇，D-環(huán)取代氧化甾醇，側(cè)鏈取代氧化甾醇，雙取代氧化甾醇，膽甾烷酸衍生物，氟化甾醇，熒光甾醇，磺化甾醇，磷酸化甾醇，不同長度、飽和狀態(tài)的多不飽和甾醇及其衍生物。

免疫刺激劑與脂質(zhì)體核心的脂質(zhì)雙層結(jié)合。如本文所使用的免疫刺激劑是引起免疫系統(tǒng)的刺激以使得誘導或活化一種或多種免疫因子(即細胞因子，免疫細胞，抗體，趨化因子)的物質(zhì)。免疫應答可以包括細胞和/或體液應答。免疫刺激劑可以是例如小分子，核酸，蛋白質(zhì)或其組合。免疫刺激劑還可以能夠活化局部微環(huán)境的細胞上的免疫刺激分子的表達。

并入雙層中的免疫刺激劑可以是廣泛多樣的分子，包括但不限于：單磷酰脂質(zhì)A，來自細菌來源的脂質(zhì)A，22:0海藻糖，二甲基雙十八烷基銨，Kdo2脂質(zhì)A，肌醇磷酸酯，包括IP3(1,3,4)，IP3(1,3,5)，IP3(1,4,5)，IPR(1,3,4,5)，LPA/S1P受體選擇性激動劑，PAF和PAF類似物，脂核苷酸，環(huán)狀LPA，生物活性神經(jīng)酰胺，內(nèi)源性大麻素，大麻素，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，二?；视土姿狨?，細菌膜脂質(zhì)，N-?；拾彼嶂|(zhì)，酰基肉堿脂質(zhì)，分枝菌酸，植物脂質(zhì)提取物，F(xiàn)SL-1，PAM3CSK4，HKLM，LPS，F(xiàn)LA-ST，咪喹莫特，瑞喹莫德，C12-IE-DAP，L18-MDP toll樣受體激動劑，NOD受體激動劑，和對于誘導免疫應答會是有效的其它促炎免疫受體激動劑。

免疫刺激劑與脂質(zhì)體核心結(jié)合。其可以通過嵌入在核心內(nèi)結(jié)合或其可以間接(即通過其它分子如接頭非共價地或共價地)或直接(即共價地)附接或連接。

本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)還包括優(yōu)選為治療性寡核苷酸的寡核苷酸。本文所用的寡核苷酸是指任何含有核酸的分子。核酸可以是DNA，RNA，PNA，LNA，ENA或其組合或修飾。它也可以是單鏈、雙鏈或三鏈。治療性寡核苷酸是可以用作治療劑和/或診斷劑的寡核苷酸。

寡核苷酸位于脂質(zhì)體核心的外部。至少一個寡核苷酸在外部。在一些實施方案中，至少25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000個寡核苷酸或其任何范圍組合位于脂質(zhì)體核心的外部。在一些實施方案中，1-1000、10-500、50-250或50-300個寡核苷酸存在于表面上。在一些情況下，寡核苷酸形成寡核苷酸殼。當脂質(zhì)體的外表面的至少50％的可用表面積包括寡核苷酸時，形成寡核苷酸殼。在一些實施方案中，脂質(zhì)體外表面的可用表面積的至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％包括寡核苷酸。寡核苷酸殼的寡核苷酸可以以多個方向定向。在一些實施方案中，寡核苷酸徑向向外定向。

寡核苷酸可以直接或通過接頭間接地連接至核心或彼此連接和/或連接至其它分子如抗原。寡核苷酸可以通過5'端或3'端與接頭綴合。例如。[序列，5'-3']-接頭或接頭-[序列，5'-3']。納米結(jié)構(gòu)的一些或所有寡核苷酸可以通過共價或非共價鍵直接或間接地彼此連接。一個寡核苷酸與另一個寡核苷酸的連接可以是該寡核苷酸與脂質(zhì)體核心的連接的補充或替代。一個或多個寡核苷酸還可以與其它分子如抗原連接。寡核苷酸可以直接或間接地通過共價或非共價鍵連接至核心的抗原。

寡核苷酸殼可以是廣泛多樣的分子，包括但不限于：單鏈脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和摻入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種修飾的其它單鏈寡核苷酸，雙鏈脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，和摻入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種修飾的其它雙鏈寡核苷酸，摻入脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或摻入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種修飾的寡核苷酸的寡核苷酸三鏈體。在另一個實施方案中，一種或多種不同的寡核苷酸存在于單個脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)的相同表面上。

寡核苷酸殼可以通過與一個或多個接頭分子綴合而錨定到脂質(zhì)體核心的表面，所述接頭分子包括但不限于：生育酚，鞘脂如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇，神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺磷酸酯，1-0酰基神經(jīng)酰胺，二氫神經(jīng)酰胺，2-羥基神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，鞘磷脂，和各種長度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂如磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰膽堿，磷脂酸，溶血磷脂酸，環(huán)狀LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，溶血磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸酯，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，雙(單?；视?磷酸酯，(二?；视?磷酸酯，醚脂，二植烷醚脂質(zhì)，和各種長度和飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物，甾醇如膽固醇，去氫膽甾醇，豆甾醇，羊毛甾醇，烯膽甾烷醇，薯蕷皂苷配基，谷甾醇，酵母甾醇，zymostenol，14-脫甲基-羊毛甾醇，膽甾醇硫酸酯，DHEA，DHEA硫酸酯，14-脫甲基-14-脫氫羊毛甾醇，谷甾烷醇，菜油甾醇，醚陰離子脂質(zhì)，醚陽離子脂質(zhì)，鑭系螯合脂質(zhì)，A-環(huán)取代氧化甾醇，B-環(huán)取代氧化甾醇，D-環(huán)取代氧化甾醇，側(cè)鏈取代氧化甾醇，雙取代氧化甾醇，膽甾烷酸衍生物，氟化甾醇，熒光甾醇，磺化甾醇，磷酸化甾醇，不同長度、飽和狀態(tài)的多不飽和甾醇及其衍生物。寡核苷酸可以是與分子或分子的復合物相互作用的核酸，所述分子或分子的復合物在被刺激時，響應于該相互作用產(chǎn)生免疫應答。分子或分子的復合物可以是受體。在一些實施方案中，寡核苷酸可以是模式識別受體(PRR)調(diào)節(jié)寡核苷酸。PRR是包含由先天免疫系統(tǒng)的細胞表達以鑒定與微生物病原體或細胞應激相關(guān)的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)以及與在細胞損傷期間釋放的細胞組分相關(guān)的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)的蛋白質(zhì)的免疫系統(tǒng)的原始部分。PRR包括但不限于膜結(jié)合的PRR，例如受體激酶，toll樣受體(TLR)和C型凝集素受體(CLR)(甘露糖受體和脫唾液酸糖蛋白受體)；細胞質(zhì)PRR例如RIG-I樣受體(RLR)，RNA解旋酶，植物PRR和NonRD激酶；和分泌的PRR。PRR調(diào)節(jié)寡核苷酸包括但不限于TLR激動劑，RIG-I的激動劑或拮抗劑，轉(zhuǎn)錄因子，細胞翻譯機構(gòu)，細胞轉(zhuǎn)錄機構(gòu)，核酸作用酶和結(jié)合核酸的自身抗原。該實施方案的一個實例是使用未甲基化的5'-胞嘧啶-磷酸-鳥苷-3'(CpG)基序。另一個是使用5'-UUG-3'或5'-UUA-3'基序。另一個是使用長雙鏈RNA。

本文所用的TLR激動劑是與TLR相互作用并刺激TLR活性的核酸分子。Toll樣受體(TLR)是在哺乳動物的先天免疫中起關(guān)鍵作用的高度保守的多肽家族。已經(jīng)鑒定了至少10個家族成員，命名為TLR1-TLR10。各種TLR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的特征在于Toll-白細胞介素1(IL-1)受體(TIR)結(jié)構(gòu)域。Medzhitov R等人(1998)Mol Cell 2:253-8。通過TLR的微生物侵入的識別觸發(fā)在果蠅(Drosophila)和哺乳動物中進化保守的信號級聯(lián)的活化。據(jù)報道，含有TIR域的銜接蛋白MyD88與TLR結(jié)合，并將IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子6(TRAF6)募集至TLR。認為MyD88依賴性信號傳導途徑導致NF-κB轉(zhuǎn)錄因子和c-Jun NH₂末端激酶(Jnk)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化，這是免疫活化和炎癥細胞因子的產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。關(guān)于綜述，參見Aderem A等人(2000)Nature 406:782-87。

認為TLR在各種組織中和在各種類型的免疫細胞上差異表達。例如，已報道人TLR7在胎盤、肺、脾、淋巴結(jié)、扁桃體中和在漿細胞樣前體樹突細胞(pDC)上表達。Chuang T-H等人(2000)Eur Cytokine Netw 11:372-8)；Kadowaki N等人(2001)J Exp Med 194:863-9。據(jù)報道，人TLR8在肺、外周血白細胞(PBL)、胎盤、脾、淋巴結(jié)中和在單核細胞上表達。Kadowaki N等人(2001)J Exp Med 194:863-9；Chuang T-H等人(2000)Eur Cytokine Netw 11:372-8。人TLR9據(jù)報道在脾、淋巴結(jié)、骨髓、PBL中和在pDC和B細胞上表達。Kadowaki N等人(2001)J Exp Med 194:863-9；Bauer S等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:9237-42；Chuang T-H等人(2000)Eur Cytokine Netw 11:372-8。

人和鼠TLR7的核苷酸和氨基酸序列是已知的。參見例如GenBank登錄號AF240467，AF245702，NM_016562，AF334942，NM_133211；和AAF60188，AAF78035，NP_057646，AAL73191和AAL73192，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。人TLR7被報道為1049個氨基酸長。鼠TLR7被報道為1050個氨基酸長。TLR7多肽包括具有富含亮氨酸的重復區(qū)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和包括TIR結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域。

人和鼠TLR8的核苷酸和氨基酸序列是已知的。參見例如GenBank登錄號AF246971，AF245703，NM_016610，XM_045706，AY035890，NM_133212；和AAF64061，AAF78036，NP_057694，XP_045706，AAK62677和NP_573475，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。據(jù)報道，人TLR8以至少兩種同種型存在，一個1041個氨基酸長，另一個1059個氨基酸長。鼠TLR8的長度為1032個氨基酸。TLR8多肽包括具有富含亮氨酸的重復區(qū)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和包括TIR結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域。

人和鼠TLR9的核苷酸和氨基酸序列是已知的。參見例如GenBank登錄號NM_017442，AF259262，AB045180，AF245704，AB045181，AF348140，AF314224，NM_031178；和NP_059138，AAF72189，BAB19259，AAF78037，BAB19260，AAK29625，AAK28488和NP_112455，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。據(jù)報道，人TLR9以至少兩種同種型存在，一個為1032個氨基酸，另一個為1055個氨基酸。鼠TLR9的長度為1032個氨基酸。TLR9多肽包括具有富含亮氨酸的重復區(qū)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和包括TIR結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域。

如本文所用，術(shù)語“TLR信號傳導”是指與通過TLR的信號傳導相關(guān)的細胞內(nèi)信號傳導的任何方面。如本文所用，術(shù)語“TLR介導的免疫應答”是指與TLR信號傳導相關(guān)的免疫應答。TLR信號傳導的水平可以被增強超過預先存在的信號傳導水平，或者可以被誘導超過信號傳導的背景水平。

TLR3介導的免疫應答是與TLR3信號傳導相關(guān)的應答。TLR3激動劑包括但不限于dsRNA，例如具有多個AU基序的dsRNA。

TLR7介導的免疫應答是與TLR7信號傳導相關(guān)的應答。TLR7介導的免疫應答通常特征在于誘導IFN-α和IFN誘導性細胞因子例如IP-10和I-TAC。在TLR7介導的免疫應答中誘導的細胞因子IL-1α/β、IL-6、IL-8、MIP-1α/β和MIP-3α/β的水平小于在TLR8介導的免疫應答中誘導的水平。TLR7配體包括但不限于鳥苷類似物例如C8-取代的鳥苷，基本上由G和U組成的核糖核苷的混合物，鳥苷核糖核苷酸和RNA或RNA樣分子(PCT/US03/10406)和基于腺苷的化合物(例如，6-氨基-9-芐基-2-(3-羥基-丙氧基)-9H-嘌呤-8-醇和由Sumitomo制備的類似化合物(例如CL-029))。

如本文所用，術(shù)語“鳥苷類似物”是指具有牽涉鳥嘌呤堿基、鳥苷核苷糖或鳥嘌呤堿基和鳥苷核苷糖兩者的化學修飾的鳥苷樣核苷酸(不包括鳥苷)。鳥苷類似物具體包括但不限于7-脫氮-鳥苷。

鳥苷類似物還包括C8-取代的鳥苷，例如7-硫雜-8-氧代鳥苷(immunosine)，8-巰基鳥苷，8-溴鳥苷，8-甲基鳥苷，8-氧代-7,8-二氫鳥苷，C8-芳基氨基-2'-脫氧鳥苷，C8-丙炔基-鳥苷，C8-和N7-取代的鳥嘌呤核糖核苷例如7-烯丙基-8-氧代鳥苷(洛索立賓)和7-甲基-8-氧代鳥苷，8-氨基鳥苷，8-羥基-2'-脫氧鳥苷，8-羥基鳥苷和7-脫氮8-取代的鳥苷。

TLR8介導的免疫應答是與TLR8信號傳導相關(guān)的應答。該應答的特征還在于促炎細胞因子例如IFN-γ、IL-12p40/70、TNF-α、IL-1α/β、IL-6、IL-8、MIP-1α/β和MIP-3α/β的誘導。TLR8配體包括基本上由G和U組成的核糖核苷的混合物，鳥苷核糖核苷酸和RNA或RNA樣分子(PCT/US03/10406)。另外的TLR8配體也公開于Gorden等人J.Immunol.2005,174:1259-1268。

如本文所用，“TLR7/8激動劑”共同地指能夠增加TLR7和/或TLR8信號傳導的任何核酸(即，TLR7和/或TLR8的激動劑)。一些TLR7/8配體單獨誘導TLR7信號傳導(例如TLR7特異性激動劑)，一些誘導單獨的TLR8信號傳導(例如TLR8特異性激動劑)，以及其它誘導TLR7和TLR8信號傳導兩者。

TLR9介導的免疫應答是與TLR9信號傳導相關(guān)的應答。該應答的特征至少進一步在于IFN-γ和IL-12的產(chǎn)生/分泌，盡管其水平低于通過TLR8介導的免疫應答實現(xiàn)的水平。如本文所用，術(shù)語“TLR9激動劑”是指能夠增加TLR9信號傳導的任何試劑(即，TLR9的激動劑)。TLR9激動劑特別包括但不限于免疫刺激性核酸，特別是CpG免疫刺激性核酸。

“免疫刺激性CpG核酸”或“免疫刺激性CpG寡核苷酸”是指能夠活化免疫細胞的任何含CpG的核酸。至少CpG二核苷酸的C通常但不一定是未甲基化的。免疫刺激性CpG核酸描述于許多授權(quán)的專利和公開的專利申請中，包括美國專利號6,194,388；6,207,646；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199。

TLR13介導的免疫應答是與TLR13信號傳導相關(guān)的應答。TLR13激動劑是細菌23S rRNA。

寡核苷酸還可以是視黃酸誘導型基因-I(RIG-I)激動劑或拮抗劑。RIG-I對應于GenBank登錄號AF038963。RIG-I激動劑包括但不限于dsRNA，例如聚(I:C)。RIG-I拮抗劑包括短的5'三磷酸DNA或RNA。

“免疫刺激性寡核苷酸”是含有能夠誘導免疫應答的免疫刺激基序或主鏈的任何核酸(DNA或RNA)。免疫應答的誘導是指免疫細胞的數(shù)量或活性的任何增加，或免疫因子例如細胞因子的表達或絕對水平的增加。免疫細胞包括但不限于NK細胞，CD4+T淋巴細胞，CD8+T淋巴細胞，B細胞，樹突狀細胞，巨噬細胞和其它抗原呈遞細胞。細胞因子包括但不限于白細胞介素，TNF-α，IFN-α,β和γ，F(xiàn)lt-配體和共刺激分子。免疫刺激基序包括但不限于CpG基序和富含T的基序。

免疫刺激性寡核苷酸的非限制性集合包括：

dsRNA：

聚(A:C)和聚(I:C)

ssRNA：

CCGUCUGUUGUGUGACUC(SEQ ID NO:4)

GCCACCGAGCCGAAGGCACC(SEQ ID NO:6)

UAUAUAUAUAUAUAUAUAUA(SEQ ID NO:7)

UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU(SEQ ID NO:8)

UUUUAUUUUAUUUUAUUUUA(SEQ ID NO:9)

UGUGUGUGUGUGUGUGUGUG(SEQ ID NO:10)

UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU(SEQ ID NO:11)

UUUGUUUGUUUGUUUGUUUG(SEQ ID NO:12)

UUAUUUAUUUAUUUAUUUAUUUAU(SEQ ID NO:13)

UUGUUUGUUUGUUUGUUUGUUUGU(SEQ ID NO:14)

GCCCGUCUGUUGUGUGACUC(SEQ ID NO:15)

GUCCUUCAAGUCCUUCAA(SEQ ID NO:16)

DNA:

GGTGCATCGATGCAGGGGGG(SEQ ID NO:5)

TCCATGGACGTTCCTGAGCGTT(SEQ ID NO:17)

TCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQ ID NO:18)

TCGTCGACGATCCGCGCGCGCG(SEQ ID NO:19)

GGGGTCAACGTTGAGGGGGG(SEQ ID NO:20)

TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:21)

TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:22)

GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO:23)

GGGGACGACGTCGTGGGGGGG(SEQ ID NO:24)

TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO:25)

TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQ ID NO:26)

術(shù)語“寡核苷酸”和“核酸”可互換使用，是指多個核苷酸(即，包含連接至磷酸基團和可交換有機堿基的糖(例如，核糖或脫氧核糖)的分子，所述堿基是取代的嘧啶(例如胞嘧啶(C)，胸苷(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))。因此，該術(shù)語包括DNA和RNA寡核苷酸。該術(shù)語應還包括寡核苷(即減去磷酸酯的寡核苷酸)和任何其它含有機堿基的聚合物。寡核苷酸可以從現(xiàn)有的核酸來源(例如基因組或cDNA)獲得，但是優(yōu)選是合成的(例如，通過核酸合成產(chǎn)生的)。

寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。雙鏈寡核苷酸在本文中也稱為雙鏈體。本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸可以包含兩條分開的互補核酸鏈。

如本文所用，“雙鏈體”包括其中互補序列或部分互補序列彼此氫鍵鍵合的雙鏈核酸分子?；パa序列可以包括有義鏈和反義鏈。反義核苷酸序列可以與靶基因相同或充分相同，以介導對靶基因序列的有效靶基因抑制(例如，至少約98％相同，96％相同，94％，90％相同，85％相同或80％相同)。

雙鏈寡核苷酸可以在其整個長度上是雙鏈的，意味著它沒有突出的單鏈序列，因此是平端的。在其它實施方案中，雙鏈寡核苷酸的兩條鏈可具有不同長度，從而產(chǎn)生一個或多個單鏈突出端。本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸可以含有錯配和/或環(huán)或凸起。在一些實施方案中，其在寡核苷酸長度的至少約70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％上是雙鏈的。在一些實施方案中，本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。

與本發(fā)明相關(guān)的寡核苷酸可以被修飾，例如在糖部分、磷酸二酯鍵和/或堿基處。如本文所用，“糖部分”包括天然的、未修飾的糖，包括戊糖、核糖和脫氧核糖，修飾的糖和糖類似物。糖部分的修飾可以包括用鹵素、雜原子或脂族基團置換羥基，并且可以包括羥基官能化為例如醚、胺或硫醇。

糖部分的修飾可包括被稱為“甲基化”的2'-O-甲基核苷酸。在一些情況下，與本發(fā)明相關(guān)的寡核苷酸可僅含有修飾的或未修飾的糖部分，而在其它情況下，寡核苷酸含有一些被修飾的糖部分和一些未被修飾的部分。

在一些情況下，修飾的核苷酸單體包括糖-或主鏈-修飾的核糖核苷酸。修飾的核糖核苷酸可以含有非天然存在的堿基，例如在5'-位修飾的尿苷或胞苷，例如5'-(2-氨基)丙基尿苷和5'-溴尿苷；在8-位修飾的腺苷和鳥苷，例如8-溴鳥苷；脫氮核苷酸，例如7-脫氮-腺苷；和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。此外，糖修飾的核糖核苷酸可以具有被H、烷氧基(或OR)、R或烷基、鹵素、SH、SR、氨基(例如NH₂,NHR,NR₂)、或CN基團取代的2'-OH基團，其中R是低級烷基、烯基或炔基。在一些實施方案中，修飾的核糖核苷酸可以具有修飾基團例如硫代磷酸酯基團取代的連接至相鄰核糖核苷酸的磷酸二酯基團。

在一些方面，2'-O-甲基修飾對于減少不期望的細胞應激反應例如對雙鏈核酸的干擾素反應可以是有益的。修飾的糖可以包括D-核糖，2'-O-烷基(包括2'-O-甲基和2'-O-乙基)，即2'-烷氧基，2'-氨基，2'-S-烷基，2′-鹵代(包括2'-氟代)，2'-甲氧基乙氧基，2'-烯丙氧基(-OCH₂CH＝CH₂)，2'-炔丙基，2'-丙基，乙炔基，乙烯基，丙烯基和氰基等。糖部分也可以是己糖。

術(shù)語“烷基”包括飽和脂肪族基，包括直鏈烷基(例如甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基等)，支鏈烷基(異丙基，叔丁基，異丁基等)，環(huán)烷基(脂環(huán)族)基團(環(huán)丙基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基，環(huán)辛基)，烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。在一些實施方案中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈中具有6個或更少的碳原子(例如，對于直鏈為C₁-C₆，對于支鏈為C₃-C₆)，更優(yōu)選為4個或更少。類似地，優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3-8個碳原子，更優(yōu)選在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有5或6個碳。術(shù)語C₁-C₆包括含有1至6個碳原子的烷基。

除非另有說明，術(shù)語烷基包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，其中后者是指具有獨立選擇的取代烴主鏈的一個或多個碳上的氫的取代基的烷基部分。術(shù)語“烯基”包括在長度和可能的取代上類似于上述烷基但含有至少一個雙鍵的不飽和脂族基團。除非另有說明，術(shù)語烯基包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”，其中后者是指具有獨立選擇的取代烴主鏈的一個或多個碳上的氫的取代基的烯基部分。

術(shù)語“堿基”包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)堿基，脫氮嘌呤和類似物(包括雜環(huán)取代的類似物，例如氨基乙氧基吩惡嗪)，其衍生物(例如1-烷基-、1-烯基-、雜芳族-和1-炔基衍生物)和互變異構(gòu)體。嘌呤的實例包括腺嘌呤，鳥嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和黃嘌呤以及其類似物(例如8-氧代-N⁶-甲基腺嘌呤或7-二氮雜黃嘌呤)和衍生物。嘧啶包括例如胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶及其類似物(例如5-甲基胞嘧啶，5-甲基尿嘧啶，5-(1-丙炔基)尿嘧啶，5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4,4-乙烷基胞嘧啶)。合適的堿基的其它實例包括非嘌呤基和非嘧啶基堿基例如2-氨基吡啶和三嗪。

在一些方面，本發(fā)明的寡核苷酸的核苷酸單體是RNA核苷酸，包括修飾的RNA核苷酸。

術(shù)語“核苷”包括與糖部分(優(yōu)選核糖或脫氧核糖)共價連接的堿基。優(yōu)選的核苷的實例包括核糖核苷和脫氧核糖核苷。核苷還包括與可包含游離羧基、游離氨基或保護基的氨基酸或氨基酸類似物連接的堿基。合適的保護基團是本領(lǐng)域熟知的(參見P.G.M.Wuts and T.W.Greene,“Protective Groups in Organic Synthesis”,2^nd Ed.,Wiley-Interscience,New York,1999)。

如本文所用，在核苷酸間鍵聯(lián)的上下文中使用的術(shù)語“鍵聯(lián)”包括共價偶聯(lián)相鄰核苷酸單體的天然存在的未修飾的磷酸二酯部分(-O-(PO^2-)-O-)。如本文所用，術(shù)語“替代鍵聯(lián)接”或“修飾的鍵聯(lián)”或“修飾的核苷酸間鍵聯(lián)”包括共價偶聯(lián)相鄰核苷酸單體的天然磷酸二酯基團的任何類似物或衍生物。取代鍵聯(lián)包括磷酸二酯類似物，例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，和P-ethyoxyphosphodiester，P-乙氧基磷酸二酯，P-烷氧基磷酸三酯，甲基膦酸酯，和不含磷的鍵聯(lián)，例如縮醛和酰胺。這種替代鍵聯(lián)是本領(lǐng)域已知的(例如，Bjergarde等人1991.Nucleic Acids Res.19:5843；Caruthers等人 1991.Nucleosides Nucleotides.10:47)。在某些實施方案中，優(yōu)選不可水解的鍵聯(lián)，例如硫代磷酸酯鍵聯(lián)。

在一些方面，本發(fā)明的寡核苷酸包含3'和5'末端(除了環(huán)狀寡核苷酸)。寡核苷酸的3'和5'末端可以基本上保護免于核酸酶，例如通過修飾3'或5'鍵聯(lián)(例如，美國專利號5,849,902和WO 98/13526)。寡核苷酸可以通過包含“封閉基團”而具有抗性。如本文所用的術(shù)語“封閉基團”是指可以連接至寡核苷酸或核苷酸單體的取代基(例如，除OH基團之外的基團)，作為保護基團或用于合成的偶聯(lián)基團(例如FITC，丙基(CH₂-CH₂-CH₃)，二醇(-O-CH₂-CH₂-O-)磷酸酯(PO₃^2-)，膦酸氫酯或亞磷酰胺?！胺忾]基團”還包括保護寡核苷酸的5'和3'末端的“末端封閉基團”或“外切核酸酶封閉基團”，包括修飾的核苷酸和非核苷酸外切核酸酶抗性結(jié)構(gòu)。

示例性的末端封閉基團包括帽結(jié)構(gòu)(例如7-甲基鳥苷帽)，反向核苷酸單體，例如具有3'-3'或5'-5'末端倒置(參見，例如Ortiagao等人1992.Antisense Res.Dev.2:129)，膦酸甲酯，亞磷酰胺，非核苷酸基團(例如，非核苷酸接頭，氨基接頭，綴合物)等。3'末端核苷酸單體可包含修飾的糖部分。3'末端核苷酸單體包含3'-O，其可以任選地被阻止寡核苷酸的3'-外切核酸酶降解的封閉基團取代。例如，3'-羥基可以通過3'→3'核苷酸間鍵聯(lián)被酯化成核苷酸。例如，烷氧基自由基可以是甲氧基，乙氧基或異丙氧基，優(yōu)選是乙氧基。任選地，3'端的3'→3'連接的核苷酸可以通過替代鍵聯(lián)連接。為了降低核酸酶降解，最5'的3'→5'鍵聯(lián)可以是修飾的鍵聯(lián)，例如硫代磷酸酯或P-烷基氧基磷酸三酯鍵聯(lián)。優(yōu)選地，兩個最5'的3'→5'鍵聯(lián)是修飾的鍵聯(lián)。任選地，5'末端羥基部分可以用含磷部分例如磷酸酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯化。

在一些方面，寡核苷酸可以是包括DNA和RNA二者的嵌合RNA-DNA寡核苷酸。

寡核苷酸的長度優(yōu)選為6至100個堿基。然而，如果存在足夠的刺激基序，則大于4個核苷酸(甚至許多kb長)的任何大小的核酸能夠誘導根據(jù)本發(fā)明的生物應答。優(yōu)選地，核酸的大小在8至100個之間，并且在一些實施方案中在8至50或8至30個核苷酸之間的范圍內(nèi)。

在一些實施方案中，寡核苷酸具有修飾的主鏈，例如硫代磷酸酯(PS)主鏈。在其它實施方案中，寡核苷酸具有磷酸二酯(PO)主鏈。在其它實施方案中，寡核苷酸具有混合或嵌合的PO和PS主鏈。

納米結(jié)構(gòu)還可以包含抗原。本文所用的抗原是能夠在體內(nèi)引發(fā)免疫應答，特別是產(chǎn)生抗體的分子。抗原包括但不限于細胞，細胞提取物，蛋白質(zhì)，多肽，肽，多糖，多糖綴合物，多糖和其它分子的肽和非肽模擬物，小分子，脂質(zhì)，糖脂，碳水化合物，病毒和病毒提取物和多細胞生物體如寄生蟲和過敏原。術(shù)語抗原廣泛地包括被宿主免疫系統(tǒng)識別為外源的任何類型的分子?？乖ǖ幌抻诎┛乖?，微生物抗原和過敏原。

抗原可以通過向外朝向的寡核苷酸共價或非共價(例如Watson/Crick雜交)連接至結(jié)構(gòu)?；蛘呋蛄硗?，可以通過與疏水部分綴合將抗原摻入脂質(zhì)體雙層中(圖2-3)。本文提供的數(shù)據(jù)證明，這種形式的抗原遞送在體外誘發(fā)了意想不到的更強的免疫刺激效應誘導(圖10)，并誘導有效的抗原加工和呈遞，從而導致在體內(nèi)以高度意想不到的水平有效誘導抗腫瘤免疫應答(圖11-12)。在另一個實施方案中，可以將抗原摻入脂質(zhì)體的內(nèi)部水層內(nèi)(圖3)。

在一個實施方案中，抗原通過與寡核苷酸殼的相互作用與脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)綴合(圖2)。在一些情況下，抗原-寡核苷酸綴合物通過寡核苷酸雜交與脂質(zhì)體核心連接。換句話說，寡核苷酸與互補或部分互補的寡核苷酸雜交以形成雙鏈體或部分雙鏈體。雙鏈體的一個或兩個寡核苷酸直接連接至脂質(zhì)體核心并且面向外部(在脂質(zhì)雙層的外部)或在內(nèi)部(在內(nèi)部水層中)且不直接連接至脂質(zhì)體核心的抗原連接至雙鏈體中的一個或兩個寡核苷酸。在另一個實施方案中，抗原通過與脂質(zhì)體核心的直接相互作用與脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu)綴合(圖3)?？乖梢酝ㄟ^與一個或多個接頭分子綴合而錨定到脂質(zhì)體核心的表面，所述接頭分子包括但不限于：生育酚，鞘脂如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇，神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺磷酸酯，1-0?；窠?jīng)酰胺，二氫神經(jīng)酰胺，2-羥基神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，鞘磷脂，和各種長度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂如磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰膽堿，磷脂酸，溶血磷脂酸，環(huán)狀LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，溶血磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸酯，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，雙(單酰基甘油)磷酸酯，(二?；视?磷酸酯，醚脂，二植烷醚脂質(zhì)，和各種長度和飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物，甾醇如膽固醇，去氫膽甾醇，豆甾醇，羊毛甾醇，烯膽甾烷醇，薯蕷皂苷配基，谷甾醇，酵母甾醇，zymostenol，14-脫甲基-羊毛甾醇，膽甾醇硫酸酯，DHEA，DHEA硫酸酯，14-脫甲基-14-脫氫羊毛甾醇，谷甾烷醇，菜油甾醇，醚陰離子脂質(zhì)，醚陽離子脂質(zhì)，鑭系螯合脂質(zhì)，A-環(huán)取代氧化甾醇，B-環(huán)取代氧化甾醇，D-環(huán)取代氧化甾醇，側(cè)鏈取代氧化甾醇，雙取代氧化甾醇，膽甾烷酸衍生物，氟化甾醇，熒光甾醇，磺化甾醇，磷酸化甾醇，不同長度、飽和狀態(tài)的多不飽和甾醇及其衍生物。

本文使用的癌抗原是與腫瘤或癌細胞表面相關(guān)的化合物，例如肽或蛋白質(zhì)，其當在MHC分子的背景下在抗原呈遞細胞的表面上表達時能夠引發(fā)免疫應答。癌抗原可以通過制備癌細胞的粗提取物來從癌細胞制備，例如，如Cohen,等人,1994,Cancer Research,54:1055中所述，通過部分純化抗原來制備，通過重組技術(shù)來制備，或通過從頭合成已知抗原來制備。癌抗原包括但不限于重組表達的抗原，腫瘤或癌癥的免疫原性部分或整個腫瘤或癌癥。此類抗原可以重組地或通過本領(lǐng)域已知的任何其它手段分離或制備。

本文所用的微生物抗原是微生物的抗原，包括但不限于病毒、細菌、寄生蟲和真菌。這樣的抗原包括完整的微生物以及其天然分離物和片段或衍生物，以及與天然微生物抗原相同或相似并且誘導對該微生物特異的免疫應答的合成化合物。如果化合物誘導針對天然微生物抗原的免疫應答(體液的和/或細胞的)，則該化合物類似于天然微生物抗原。此類抗原在本領(lǐng)域中常規(guī)使用，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。

已經(jīng)在人類中發(fā)現(xiàn)的病毒的實例包括但不限于：逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也稱為HDTV-III，LAVE或HTLV-III/LAV或HIV-III；以及其它分離株，例如HIV-LP；細小RNA病毒(Picornaviridae)(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒，甲型肝炎病毒，腸道病毒，人柯薩奇病毒，鼻病毒，?？刹《?；杯狀病毒(Calciviridae)(例如，導致胃腸炎的毒株)；披蓋病毒(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒、風疹病毒)；黃病毒(Flaviridae)(例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒)；日冕形病毒(Coronoviridae)(例如，冠形病毒)；彈狀病毒(Rhabdoviradae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；纖絲病毒(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副黏病毒(Paramyxoviridae)(例如，副流行性感冒病毒，腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體病毒)；正粘病毒(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亞病毒(Bungaviridae)(例如，漢坦病毒、本呷(bunga)病毒、白蛉病毒和內(nèi)羅(Nairo)病毒)；沙狀病毒(Arena viridae)(出血熱病毒)；呼腸病毒(Reoviridae)(例如，呼腸病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙股雙節(jié)RNA病毒(Bimaviridae)；肝DNA病毒(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；微小病毒(Parvovirida)(細小病毒)；乳頭泡病毒(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒(Adenoviridae)(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒(Herpesviridae)(1型和2型單純皰疹病毒(HSV)、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、皰疹病毒)；痘病毒(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒(Iridoviridae)(例如，非洲豬瘟病毒)；和其它病毒(例如，丁型肝炎(被認為是乙肝病毒的缺陷衛(wèi)星型)、丙型肝炎的媒介物；諾瓦克(Norwalk)和相關(guān)病毒以及星狀病毒)。

革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌用作脊椎動物的抗原。這樣的革蘭氏陽性細菌包括但不限于巴斯德氏菌屬(Pasteurella)物種，葡萄球菌屬(Staphylococci)物種和鏈球菌屬(Streptococcus)物種。革蘭氏陰性細菌包括但不限于大腸桿菌(Escherichia coli)，假單胞菌屬(Pseudomonas)物種和沙門氏菌屬(Salmonella)物種。感染性細菌的具體實例包括但不限于幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)，伯氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi)，嗜肺軍團桿菌(Legionella pneumophilia)，分枝桿菌屬的種(Mycobacteria sps)(例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，鳥分枝桿菌(M.avium)，胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)，堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)，戈氏分枝桿菌(M.gordonae)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A組鏈球菌)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B組鏈球菌)，鏈球菌(Streptococcus)(草綠色鏈球菌組)，糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)，鏈球菌(厭氧菌)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，致病性彎曲桿菌屬的種(Campylobacter sp.)，腸球菌屬的種(Enterococcus sp.)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，炭疽桿菌(Bacillus antracis)，白喉棒狀桿菌(corynebacterium diphtheriae)，棒狀桿菌屬的種(corynebacterium sp.)，豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringers)，破傷風梭菌(Clostridium tetani)，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)，多殺巴斯德桿菌(Pasturella multocida)，擬桿菌屬的種(Bacteroides sp.)，核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)，蒼白密螺旋體(Treponema pallidium)，細弱密螺旋體(Treponema pertenue)，鉤端螺旋體屬(Leptospira)，立克次氏體屬(Rickettsia)和伊色列氏放線菌(Actinomyces israelli)。

真菌的實例包括新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，皮炎芽孢桿菌(Blastomyces dermatitidis)，沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)，白色念珠菌(Candida albicans)。

其它傳染性生物體(即原生生物)包括瘧原蟲屬的種(Plasmodium spp.)例如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)，三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)，卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)和間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)和剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)。血源性和/或組織寄生蟲包括瘧原蟲屬的種，微小巴貝蟲(Babesia microti)，分歧巴貝蟲(Babesia divergens)，熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)，利什曼原蟲屬的種(Leishmania spp.)，巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)，杜氏利什曼蟲(Leishmania donovani)，岡比亞錐蟲(Trypanosoma gambiense)和羅德西亞錐蟲(Trypanosoma rhodesiense)(非洲昏睡病)，克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)(美洲錐蟲病)，和剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)。

其它醫(yī)學相關(guān)微生物已經(jīng)在文獻中廣泛描述，例如參見C.G.A Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,Great Britain 1983，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

如本文所用，術(shù)語“癌抗原”和“腫瘤抗原”可互換使用，是指由癌細胞差異表達并因此可被利用以靶向癌細胞的抗原。癌抗原是可以潛在地刺激明顯的腫瘤特異性免疫應答的抗原。這些抗原中的一些由正常細胞編碼，但不一定表達。這些抗原可以表征為在正常細胞中通常沉默(即，不表達)的那些、僅在分化的某些階段表達的那些和暫時表達的那些，例如胚胎和胎兒抗原。其它癌抗原由突變細胞基因如癌基因(例如活化的ras致癌基因)、抑制基因(例如突變p53)、由內(nèi)部缺失或染色體易位產(chǎn)生的融合蛋白編碼。其它癌抗原可以由病毒基因編碼，例如在RNA和DNA腫瘤病毒上攜帶的那些。

本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)可以體內(nèi)或離體地遞送給受試者用于治療和/或診斷用途，或者可以在體外、離體或體內(nèi)用于研究目的?；蛘?，納米結(jié)構(gòu)可用于激發(fā)免疫應答的目的以用于產(chǎn)生可以被收獲的試劑例如抗體或細胞因子。

納米結(jié)構(gòu)可以單獨施用或在用于體內(nèi)施用的任何合適的藥物載體(例如液體，例如鹽水或粉末)中施用。它們也可以與較大的載體顆粒共同遞送或在施用裝置內(nèi)。納米結(jié)構(gòu)可以是經(jīng)配制的或未經(jīng)配制的。本發(fā)明的制劑可以在藥學上可接受的溶液中施用，所述溶液可以常規(guī)地含有藥學上可接受的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的載體、佐劑和任選地其它治療成分。在一些實施方案中，納米結(jié)構(gòu)與諸如洗劑(例如，水凝膠)的物質(zhì)混合并施用于受試者的皮膚，由此納米結(jié)構(gòu)通過受試者的皮膚遞送。應當理解，本領(lǐng)域已知的任何遞送納米顆粒的方法可以與本發(fā)明的各方面相容。納米結(jié)構(gòu)也可以是無菌的。

為了在治療中使用，可以通過將納米結(jié)構(gòu)遞送到所需細胞的任何模式向受試者施用有效量的納米結(jié)構(gòu)。施用藥物組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法完成。施用途徑包括但不限于口服，腸胃外，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，粘膜，鼻內(nèi)，舌下，氣管內(nèi)，吸入，眼，陰道，皮膚，直腸和直接注射。

因此，本發(fā)明在一個方面涉及本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)在介導免疫刺激效應上高度有效的發(fā)現(xiàn)。這些納米結(jié)構(gòu)(刺激和調(diào)節(jié)性的)在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以治療癌癥、感染性疾病、過敏癥、哮喘、自身免疫疾病和其它疾病和幫助保護避免癌癥化療后的機會性感染中是治療和預防上有用的。

因此，本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)可用作用于治療處于發(fā)展風險的受試者或患有過敏或哮喘、感染性生物體的感染或其中已鑒定特定癌抗原的癌癥的受試者的疫苗。納米結(jié)構(gòu)也可以配制成不含抗原或過敏原以用于保護避免感染、過敏或癌癥，在這種情況下，重復劑量可允許更長期的保護。如本文所用的處于風險中的受試者是具有暴露于引起感染的病原體或癌癥或過敏原或發(fā)展癌癥的風險的任何風險的受試者。例如，處于危險中的受試者可以是計劃前往發(fā)現(xiàn)特定類型的傳染原的區(qū)域的受試者，或者可以是通過生活方式或醫(yī)療程序暴露于可能含有傳染性生物體的體液的受試者或直接暴露于生物體或甚至生活在已經(jīng)鑒定出感染性生物體或過敏原的區(qū)域中的任何受試者。處于發(fā)展感染風險的受試者還包括醫(yī)療機構(gòu)推薦用特定感染性生物體抗原接種的一般人群。如果抗原是過敏原，并且受試者對該特定抗原產(chǎn)生過敏反應，并且受試者可能暴露于抗原，即在花粉季節(jié)，則該受試者處于暴露于抗原的風險。

具有感染的受試者是已經(jīng)暴露于感染性病原體并且在體內(nèi)具有急性或慢性可檢測水平的病原體的受試者。納米結(jié)構(gòu)可以與抗原一起使用或不與抗原一起使用，以產(chǎn)生能夠降低傳染性病原體的水平或根除傳染性病原體的抗原特異性全身性或粘膜免疫應答。本文所用的傳染病是由外源微生物在體內(nèi)的存在引起的疾病。特別重要的是開發(fā)有效的疫苗策略和治療以保護身體的粘膜表面，其是病原體進入的主要部位。

患有癌癥的受試者是具有可檢測的癌細胞的受試者。癌癥可以是惡性或非惡性癌癥。癌癥或腫瘤包括但不限于膽管癌；腦癌；乳腺癌；宮頸癌；絨毛膜癌；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；胃癌；上皮內(nèi)瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小細胞和非小細胞)；黑素瘤；神經(jīng)母細胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤；皮膚癌；睪丸癌；甲狀腺癌；和腎癌，以及其它癌和肉瘤。在一個實施方案中，癌癥是毛細胞白血病，慢性骨髓性白血病，皮膚T細胞白血病，多發(fā)性骨髓瘤，濾泡性淋巴瘤，惡性黑色素瘤，鱗狀細胞癌，腎細胞癌，前列腺癌，膀胱細胞癌或結(jié)腸癌。

受試者是指人或脊椎動物，包括但不限于狗，貓，馬，牛，豬，綿羊，山羊，火雞，雞，靈長類動物例如猴子和魚(水產(chǎn)養(yǎng)殖物種)例如三文魚。因此，本發(fā)明還可用于治療非人受試者中的癌癥和腫瘤、感染、自身免疫疾病和過敏/哮喘。

如本文所使用的，當針對病癥諸如感染性疾病、自身免疫性疾病、癌癥、過敏癥或哮喘使用時，術(shù)語治療、被治療或經(jīng)治療是指增加受試者對發(fā)展疾病(例如，感染病原體)的耐受性的預防性治療或者換句話說，降低受試者將發(fā)展疾病(例如，變得被病原體感染)的可能性，以及受試者已發(fā)展疾病后的治療以抵抗疾病(例如，減少或消除感染)或防止疾病變得更糟。

本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)還可以用抗微生物劑包被或與抗微生物劑結(jié)合施用。本文所用的抗微生物劑是指能夠殺死或抑制感染性微生物的天然存在的或合成的化合物。根據(jù)本發(fā)明有用的抗微生物劑的類型將取決于受試者感染的或處于感染風險的微生物的類型?？刮⑸飫┌ǖ幌抻诳辜毦鷦?，抗病毒劑，抗真菌劑和抗寄生蟲劑。短語諸如“抗感染劑”、“抗細菌劑”、“抗病毒劑”、“抗真菌劑”、“抗寄生蟲劑”和“殺蟲劑”等具有對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言良好建立的含義并且在標準醫(yī)學文本中被定義。簡言之，抗細菌劑殺死或抑制細菌，并且包括抗生素以及具有類似功能的其它合成或天然化合物?？股厥堑头肿恿糠肿?，其作為次級代謝產(chǎn)物被細胞如微生物產(chǎn)生。通常，抗生素干擾對微生物特異的且不存在于宿主細胞中的一種或多種細菌功能或結(jié)構(gòu)?？共《緞┛梢詮奶烊粊碓捶蛛x或被合成，并且可用于殺死或抑制病毒?？拐婢鷦┯糜谥委煴砻嬲婢腥疽约皺C會性和原發(fā)性全身性真菌感染。抗寄生蟲劑殺死或抑制寄生蟲。

本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)還可用于調(diào)節(jié)免疫應答，以使得一些免疫因子的水平降低。實現(xiàn)特異性免疫下調(diào)或“耐受性”是重大挑戰(zhàn)，因為現(xiàn)有技術(shù)通常通過廣泛下調(diào)免疫應答而起作用。這種非特異性方法可導致高的副作用發(fā)生率、毒性、以及獲得傳染病的增加的風險等。沒有市售化合物或結(jié)構(gòu)已經(jīng)證明在臨床上誘導有效和特異性抗炎作用的能力。挑戰(zhàn)是在不存在額外的共刺激信號的情況下向免疫細胞遞送適當?shù)男盘柪缈乖?/p>

本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)解決了現(xiàn)有技術(shù)遇到的這些問題中的一些。在一些實施方案中，抗原可以通過與本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)綴合而以實現(xiàn)或促進耐受性的方式在細胞內(nèi)高效遞送。所述方法可涉及在抗原遞送過程期間拮抗toll樣受體，以便增強誘導抗原特異性耐受的能力。用于本發(fā)明的這些實施方案的納米結(jié)構(gòu)包括連接至免疫抑制子例如TLR4免疫抑制子的脂質(zhì)體核心，和位于核心外部的寡核苷酸。

這些調(diào)節(jié)性納米結(jié)構(gòu)可用于下調(diào)免疫應答或在需要誘導耐受性的任何時候使用。例如，它們可用于治療和預防自身免疫性疾病、過敏癥、哮喘或其中病理的組分牽涉過度活性免疫應答的其它病癥(例如肝纖維化或特發(fā)性肺纖維化)。

具有過敏癥的受試者是具有響應于過敏原的過敏反應或發(fā)生響應于過敏原的過敏反應的風險的受試者。過敏癥是指對物質(zhì)(過敏原)的獲得性超敏反應。過敏性病癥包括但不限于濕疹，過敏性鼻炎或鼻粘膜炎，花粉癥，結(jié)膜炎，支氣管哮喘，風疹(蕁麻疹)和食物過敏癥以及其它特應性疾病。

過敏原是指可以在易感受試者中誘導過敏或哮喘反應的物質(zhì)(抗原)。過敏原的列表是巨大的，并且可以包括花粉，昆蟲毒液，動物皮屑，真菌孢子和藥物(例如青霉素)。天然、動物和植物過敏原的實例包括但不限于特異于以下屬的蛋白：犬(Canine)(家犬(Canis familiaris))；塵螨屬(Dermatophagoides)(例如粉塵螨(Dermatophagoides farinae))；貓屬(Felis)(貓(Felis domesticus))；豕草屬(Ambrosia)(Ambrosia artemiisfolia；黑麥草屬(Lolium)(例如多年生黑麥草(Lolium perenne)或多花黑麥草(Lolium multiflorum))；柳杉屬(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))；鏈格孢屬(Alternaria)(鏈格孢(Alternaria alternata))；榿木(Alder)；赤楊(Alnus)(Alnus gultinoasa)；樺木屬(Betula)(疣皮樺(Betula verrucosa))；櫟樹屬(Quercus)(白橡木(Quercus alba))；木犀欖屬(Olea)(Olea europa)；蒿屬(Artemisia)(艾萵(Artemisia vulgaris))；車前屬(Plantago)(例如長葉車前(Plantago lanceolata))；墻草屬(Parietaria)(例如藥用墻草(Parietaria officinalis)或歐蓍草(Parietaria judaica))；蜚蠊(Blattella)(例如德國蜚蠊(Blattella germanica))；蜜蜂屬(Apis)(例如Apis multiflorum)；柏屬(Cupressus)(例如地中海柏木(Cupressus sempervirens),綠干柏(Cupressus arizonica)和大果柏木(Cupressus macrocarpa))；刺柏屬(Juniperus)(例如Juniperus sabinoides,維吉尼亞雪松(Juniperus virginiana),刺柏(Juniperus communis)和Juniperus ashei)；金鐘柏(Thuya)(例如Thuya orientalis)；扁柏屬(Chamaecyparis)(例如日本扁柏(Chamaecyparis obtuse))；大蠊屬(Periplaneta)(例如美洲大蠊(Periplaneta americana))；冰草屬(Agropyron)(例如偃麥草(Agropyron repens))；黑麥屬(Secale)(例如黑麥(Secale cereale))；小麥屬(Triticum)(例如小麥(Triticum aestivum))；鴨茅屬(Dactylis)(例如鴨茅(Dactylis glomerata))；羊茅屬(Festuca)(例如牛尾草(Festuca elatior))；早熟禾屬(Poa)(例如草地早熟禾(Poa pratensis)或加拿大早熟禾(Poa compressa))；燕麥屬(Avena)(例如燕麥(Avena sativa))；絨毛草屬(Holcus)(例如絨毛草(Holcus lanatus))；黃花茅屬(Anthoxanthum)(例如黃花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麥草屬(Arrhenatherum)(例如燕麥草(Arrhenatherum elatius))；剪股穎屬(Agrostis)(例如白翦股穎(Agrostis alba))；梯牧草屬(Phleum)(例如貓尾草(Phleum pratense))；虉草屬(Phalaris)(例如虉草(Phalaris arundinacea))；雀稗屬(Paspalum)(例如百喜草(Paspalum notatum))；高梁屬(Sorghum)(例如Sorghum halepensis)；和雀麥屬(Bromus)(例如無芒雀麥(Bromus inermis))。

自身免疫性疾病是其中受試者自身的抗體與宿主組織反應或其中免疫效應T細胞與內(nèi)源自體肽自身反應并引起組織破壞的一類疾病。因此，針對受試者自身抗原(被稱為自身抗原)發(fā)生免疫應答。自身免疫性疾病包括但不限于類風濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，多發(fā)性硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，自身免疫性腦脊髓炎，重癥肌無力(MG)，橋本氏甲狀腺炎，古德帕斯徹綜合征，天皰瘡(例如尋常型天皰瘡)，格雷夫斯病，自身免疫性溶血性貧血，自身免疫性血小板減少性紫癜，具有抗膠原抗體的硬皮病，混合性結(jié)締組織病，多發(fā)性肌炎，惡性貧血，特發(fā)性艾迪生病，自身免疫相關(guān)不孕癥，腎小球性腎炎(例如新月體性腎小球腎炎，增殖性腎小球腎炎)，大皰性類天皰瘡，干燥綜合征，胰島素耐受性和自身免疫性糖尿病。

本文所用的“自身抗原”是指正常宿主組織的抗原。正常的宿主組織不包括癌細胞。因此，在自身免疫性疾病的情況下針對自身抗原發(fā)生的免疫應答是不期望的免疫應答，并且促成正常組織的破壞和損傷，而針對癌抗原發(fā)生的免疫應答是期望的免疫應答，并且促成腫瘤或癌癥的破壞。因此，在本發(fā)明的旨在治療自身免疫性疾病的一些方面，不推薦將納米結(jié)構(gòu)與自身抗原，特別是作為自身免疫性疾病的靶標的那些自身抗原一起配制。

在其它情況下，納米結(jié)構(gòu)可以包括少量的自身抗原。許多動物研究已經(jīng)證明，低劑量抗原的粘膜施用可導致免疫低反應性或“耐受性”的狀態(tài)?；钚詸C制似乎是從Th1朝向主要地Th2和Th3(即，TGF-β主導的)應答的細胞因子介導的免疫偏差。使用低劑量抗原遞送的主動抑制還可抑制不相關(guān)的免疫應答(旁觀者抑制)，其在自身免疫疾病(例如類風濕性關(guān)節(jié)炎和SLE)的治療中具有相當大的益處。旁觀者抑制涉及在其中促炎性和Th1細胞因子以抗原特異性或抗原非特異性方式釋放的局部環(huán)境中的Th1反調(diào)節(jié)性抑制細胞因子的分泌。本文使用的“耐受性”用于指這種現(xiàn)象。實際上，口服耐受性在治療動物中的許多自身免疫性疾病中已經(jīng)是有效的，這些疾病包括：實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，實驗性自身免疫性重癥肌無力，膠原誘導的關(guān)節(jié)炎(CIA)和胰島素依賴性糖尿病。在這些模型中，自身免疫性疾病的預防和抑制與從Th1到Th2/Th3應答的抗原特異性體液和細胞應答的變化相關(guān)。

在另一方面，本發(fā)明涉及包括一種或多種前述組合物的試劑盒。本文所用的“試劑盒”通常定義包裝或組件，其包括一種或多種本發(fā)明的組合物，和/或與本發(fā)明相關(guān)的其它組合物，例如，如前所述的。試劑盒的每種組合物(如果存在)可以液體形式(例如，以溶液形式)或以固體形式(例如干燥粉末)提供。在某些情況下，一些組合物可以是可組合的或可以其它方式加工的(例如，至活性形式)，例如通過加入合適的溶劑或其它物質(zhì)，其可以或可以不與試劑盒一起提供?？膳c本發(fā)明相關(guān)的其它組合物的實例包括但不限于溶劑，表面活性劑，稀釋劑，鹽，緩沖劑，乳化劑，螯合劑，填充劑，抗氧化劑，粘合劑，疏松劑，防腐劑，干燥劑，抗菌劑，針，注射器，包裝材料，管，瓶，燒瓶，燒杯，盤，釉料，過濾器，環(huán)，夾子，包裹材料，貼劑，容器，帶，粘著劑，等等，其例如用于使用、施用、修飾、組裝、儲存、包裝、制備、混合、稀釋和/或保存組合物組分用于特定用途例如用于樣品和/或受試者。

在一些實施方案中，與本發(fā)明相關(guān)的試劑盒包括納米結(jié)構(gòu)的一種或多種組分。例如，試劑盒可以包括用于形成脂質(zhì)體核心的脂質(zhì)體、免疫刺激劑或TLR4免疫抑制劑和/或用于納米結(jié)構(gòu)外部的寡核苷酸。試劑盒還可以包括一種或多種抗原和/或其它治療劑。

在一些情況下，本發(fā)明的試劑盒可以包括以與本發(fā)明的組合物相關(guān)聯(lián)的方式提供的任何形式的說明書，以使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到所述說明書將與本發(fā)明的組合物相關(guān)。例如，說明書可包括用于與試劑盒相關(guān)的組合物和/或其它組合物的使用、修飾、混合、稀釋、保存、施用、組裝、儲存、包裝和/或制備的說明。在一些情況下，說明書還可包括使用組合物的說明，例如用于特定用途，例如用于樣品。說明書可以以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可識別的任何形式提供為用于包含這樣的說明的以任何方式提供的合適的媒介物，例如書面或出版的、語言的、可聽的(例如電話)、數(shù)字的、光學的、覺的(例如，錄像帶，DVD等)或電子通信(包括因特網(wǎng)或基于網(wǎng)絡的通信)。

實施例

為了可以更充分地理解本文所述的本發(fā)明，示出了以下實施例。本申請中描述的實施例被提供來舉例說明本文提供的化合物、藥物組合物和方法，且不以任何方式被解釋為限制其范圍。

實施例1

在一個被簡化以進行實踐的實施方案中，將序列為5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO：1；命名為“CpG 1826”)的寡核苷酸用α-生育酚3'-修飾并摻入包含與(8％w/w)單磷酰脂質(zhì)A混合的(92％w/w)1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DOPC)的小單層囊泡(圖1)。在一個子實施方案中，這些結(jié)構(gòu)通過卵白蛋白-寡核苷酸構(gòu)建體的Watson-Crick類型雜交與卵白蛋白(模型蛋白抗原)進一步綴合，其中寡核苷酸部分與CpG 1826(5’-AACGTCAGGAACGTCATGGA-3’SEQ ID NO:2)互補(圖2)。基于其刺激TLR9的能力選擇本文中的寡核苷酸，而根據(jù)刺激TLR4的能力選擇MPLA。

脂質(zhì)體SNA(納米結(jié)構(gòu))合成

將溶解在4mL二氯甲烷(DCM)中的25mg 1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DOPC)與溶解在1mL氯仿中的1mg單磷酰脂質(zhì)A(MPLA)在玻璃容器中混合。然后通過在氬氣下溫和干燥直到所有溶劑蒸發(fā)將脂質(zhì)以薄膜干燥到玻璃容器的壁上。通過冷凍干燥過夜除去任何殘留的溶劑。第二天，通過渦旋和超聲處理將脂質(zhì)重建在10mL脂質(zhì)體緩沖液(150mM NaCl，20mM HEPES)中，然后通過2-5個凍融循環(huán)，然后通過100nm、50nm和隨后30nm擠出膜進行連續(xù)擠出。擠出后，將1umol具有共價連接的3'-α-生育酚基團的寡核苷酸(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’SEQ ID NO:1)與26mg脂質(zhì)混合，并在4℃孵育過夜以形成脂質(zhì)體SNA。第二天，使用300kDa膜截留濾器，利用>5倍體積的1x PBS交換，通過切向流過濾來純化脂質(zhì)體SNA。

通過將卵白蛋白首先綴合至與CpG 1826互補的寡核苷酸(5’-AACGTCAGGAACGTCATGGA-3’SEQ ID NO:2)，將一些脂質(zhì)體SNA另外修飾為含有卵白蛋白。然后通過在脂質(zhì)體SNA上以相對于寡核苷酸2倍過量的卵白蛋白-寡核苷酸綴合物在37℃下孵育3小時，然后在4℃下孵育過夜，將該卵白蛋白-寡核苷酸偶聯(lián)物與脂質(zhì)體SNA雜交。通過切向流過濾除去過量的卵白蛋白-寡核苷酸綴合物。

體外測試

化合物以1:4連續(xù)稀釋。將20μL該混合物一式兩份接種在96孔板中。將Raw Blue細胞(InvivoGen)(源自含有NF-kB誘導型分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的RAW 264.7細胞的報道鼠巨噬細胞細胞系)以100k細胞/孔接種于180uL/孔中并加入到96孔板中的測試化合物。將Ramos Blue細胞(InvivoGen)(源自含有NF-kB誘導型SEAP的Ramos細胞的報道人B細胞系)以306k細胞/孔接種于180uL/孔中，并加入到96孔板中的測試化合物。重要的是，Ramos Blue細胞不具有通過TLR4的功能信號傳導。將細胞與測試化合物在37℃、5％CO2下在潮濕室中孵育過夜。第二天，使用QuantiBlue試劑(InVivoGen)根據(jù)制造商推薦的方案探測上清液的SEAP活性。結(jié)果顯示，攜帶TLR4和TLR9的激動劑的脂質(zhì)體SNA誘導比任一單獨誘導的更高的RAW Blue細胞活化(圖4)。重要的是，結(jié)果顯示，含有MPLA的脂質(zhì)體SNA對NF-kB的活化取決于功能性TLR4，因為RAW Blue細胞系而不是Ramos Blue細胞系表現(xiàn)出響應于刺激的NF-kB活化(圖5)。

為了進一步分析由包含TLR9和TLR4激動劑的脂質(zhì)體SNA觸發(fā)的反應，測試脂質(zhì)體SNA誘導MyD88依賴性和MyD88非依賴性途徑活化的能力，分別通過TNF和IFN-α的活化水平測量。為此，將6x10⁶人外周血單核細胞(PBMC)以1x10⁶/mL重懸于補充有10％FBS和1％青霉素/鏈霉素的RPMI-1640中，并以180k/孔接種20uL測試化合物。孵育過夜后，通過ELISA檢測上清液的TNF和IFN-α水平。結(jié)果顯示，在單一構(gòu)建體中遞送CpG 1826和MPLA兩者的脂質(zhì)體SNA顯示升高的TNF和IFN-α水平，其不能通過單獨遞送每一種或通過在相同的孔而非相同的構(gòu)建體中遞送兩種組分來重復(圖6)。即使當不活化TLR9的序列(命名為“CTL-ps”：5’-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT-3’SEQ ID NO:3)用于構(gòu)建脂質(zhì)體SNA時，觀察到MPLA的增強的活性(圖7)，表明脂質(zhì)體SNA比脂質(zhì)體制劑更有效地遞送MPLA。

接下來，鑒定可能調(diào)節(jié)脂質(zhì)體SNA的功效的參數(shù)。進入脂質(zhì)體配制步驟的MPLA進料的量以及核苷酸間鍵聯(lián)化學(PO相對PS)可能發(fā)揮作用。因此，脂質(zhì)體SNA用從3.8％(w/w)增加至11.5％(w/w)的MPLA進料和含有PO和PS鍵聯(lián)的構(gòu)建體開發(fā)，并測試它們在RAW Blue細胞中的活性。在該細胞系中，觀察到將MPLA進料增加至7.7％MPLA但不高達11.5％增加了脂質(zhì)體SNA的活化效力(圖8)。在RAW Blue細胞中，在脂質(zhì)體SNA的效力中觀察到偏移，但是在最大刺激中沒有觀察到偏移(圖9)，盡管這預期是物種依賴性的。

最后，測試了抗原綴合的脂質(zhì)體SNA活化免疫細胞的能力。將卵白蛋白負載的脂質(zhì)體SNA如用RAW Blue細胞所述的以通過QuantiBlue測定法探測的SEAP水平孵育過夜?？乖c脂質(zhì)體SNA的綴合似乎增加其活性(圖10)。這可能是由于存在與CpG 1826形成雙鏈體的由連接至卵白蛋白的互補寡核苷酸引入的額外的CpG基序引起的。

體內(nèi)測試

已顯示這種形式的抗原遞送在體外誘導更強的免疫刺激效應誘導(圖10)，并誘導有效的抗原加工和呈遞，從而導致體內(nèi)抗腫瘤免疫應答的有效誘導(圖11-12)。

在第0和21天使用卵白蛋白作為模型抗原(圖11)，用指定的制劑免疫(200μL s.c.,100μg卵白蛋白當量劑量)C57BL/6小鼠(N＝4/組)。在第28天，收集脾細胞，并在具有1uM OVA(257-264)的IFN-γELISPOT板上孵育過夜。使用自動化ELISPOT計數(shù)器定量IFN-γ斑點的數(shù)量。這項研究表明SNA比游離PS寡核苷酸和明礬更有效地誘導細胞反應。*p<0.05，NS＝非顯著。

在另一個實驗中，在第0天用1×10⁶E.G7-OVA細胞(ATCC#CRL-2113)接種C57BL/6小鼠(N＝11/組)，然后在第3、7、10天用指定的制劑處理(200μL s.c.,100μg卵清蛋白當量劑量)。通過測量皮下腫瘤的長度和寬度并應用公式“腫瘤體積＝(長度)×(寬度)×(寬度)/2”計算腫瘤體積。結(jié)果證明了對抗原的強細胞應答的體內(nèi)活化，具有腫瘤負荷顯著(95％)減少的證據(jù)(圖12)。

在權(quán)利要求中，冠詞例如“一”、“一個”和“該”可以表示一個或多于一個，除非相反指示或者另外地從上下文顯而易見。包括在組的一個或多個成員之間的“或”的權(quán)利要求或描述被認為滿足是否一個、多于一個或所有組成員存在于、使用于或以其它方式相關(guān)于給定產(chǎn)品或過程，除非相反指示或另外地從上下文顯而易見。本發(fā)明包括其中組中僅一個成員存在于、使用于或以其它方式相關(guān)于給定產(chǎn)品或過程的實施方案。本發(fā)明包括其中多于一個或所有組成員存在于、使用于或以其它方式相關(guān)于給定產(chǎn)品或過程的實施方案。

此外，本發(fā)明包括其中來自一個或多個所列權(quán)利要求的一個或多個限制、元素、條款和描述性術(shù)語被引入到另一個權(quán)利要求中的所有變化、組合和排列。例如，可以修改從屬于另一個權(quán)利要求的任何權(quán)利要求，以包括在從屬于相同的基本權(quán)利要求的任何其它權(quán)利要求中找到的一個或多個限制。在元素被呈現(xiàn)為列表(例如，以馬庫什組格式)的情況下，還公開了元素的每個亞組，并且可以從組中移除任何元素。應當理解，一般來說，當本發(fā)明或本發(fā)明的方面被稱為包括特定元素和/或特征時，本發(fā)明的某些實施方案或本發(fā)明的方面由以下組成或基本上由這樣的元素和/或特征組成或基本上由其組成。為了簡單起見，這些實施方案在這里沒有具體地闡述。還應注意，術(shù)語“包括”和“包含”旨在是開放的，并且允許包括其它的元素或步驟。在給出范圍的情況下，包括端點。此外，除非另有說明或者從上下文和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解中顯而易見，否則表示為范圍的值可以采取本發(fā)明不同實施方案中所述范圍內(nèi)的任何具體值或子范圍，直到該范圍的下限的單位的十分之一，除非上下文另有明確規(guī)定。

本申請引用各種已授權(quán)的專利、公開的專利申請、期刊文章和其它出版物，所有這些通過引用并入本文。如果任何所并入的參考文獻和本說明書之間存在沖突，則以說明書為準。另外，可以從任何一個或多個權(quán)利要求中明確排除落入現(xiàn)有技術(shù)內(nèi)的本發(fā)明的任何特定實施方案。因為這樣的實施方案被認為是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，即使排除物沒有在本文中明確闡述，它們也可以被排除。本發(fā)明的任何特定實施方案可以出于任何原因從任何權(quán)利要求中排除，無論是否與現(xiàn)有技術(shù)的存在相關(guān)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將通過使用不超過常規(guī)實驗來認識或能夠確定本文所述的具體實施方案的許多等同物。本文描述的本實施方案的范圍不旨在限于以上描述，而是如所附權(quán)利要求中所闡述的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，在不脫離如所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對本描述進行各種改變和修改。

序列表

<110> AuraSense, LLC

<120> 免疫調(diào)節(jié)劑通過脂質(zhì)體球形核酸的多價遞送以用于預防或治療應用

<130> A1107.70003WO00

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurrently Herewith

<150> US 62/007,528

<151> 2014-06-04

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 1

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

<400> 2

aacgtcagga acgtcatgga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

<400> 3

tccatgagct tcctgagctt 20

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<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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ccgucuguug ugugacuc 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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ggtgcatcga tgcagggggg 20

<210> 6

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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gccaccgagc cgaaggcacc 20

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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uauauauaua uauauauaua 20

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<212> RNA

<213> 人工序列

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uuauuauuau uauuauuauu 20

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<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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uuuuauuuua uuuuauuuua 20

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<213> 人工序列

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ugugugugug ugugugugug 20

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uuguuguugu uguuguuguu 20

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<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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uuuguuuguu uguuuguuug 20

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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uuauuuauuu auuuauuuau uuau 24

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<212> RNA

<213> 人工序列

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uuguuuguuu guuuguuugu uugu 24

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<212> RNA

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<212> DNA

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tcgtcgttcg aacgacgttg at 22

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tcgtcgacga tccgcgcgcg cg 22

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<212> DNA

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<223> 合成的多核苷酸

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ggggtcaacg ttgagggggg 20

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tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

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<223> 合成的多核苷酸

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<223> 合成的多核苷酸

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ggggacgacg tcgtgggggg g 21

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<213> 人工序列

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<223> 合成的多核苷酸

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