本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類具有抗腫瘤活性的新型反式芪類化合物，含有該類化合物的藥物組合物及他們作為抗腫瘤劑的用途。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命和社會(huì)發(fā)展的重大疾病，近年來癌癥發(fā)病人數(shù)日益增加，我國三次全國范圍內(nèi)的死因調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，近30年，中國癌癥在死因中的構(gòu)成比由20世紀(jì)70年代的10.13％上升至22.32％，死亡率由73.99/10萬上升至135.88/10萬。位居我國癌癥發(fā)病前十位的癌癥依次是：肺癌、肝癌、食管癌、女性乳腺癌、胰腺癌、淋巴癌、膀胱癌和甲狀腺癌，且有增長趨勢，因此可見，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的抗腫瘤藥物是十分緊迫。
芪類化合物是一類以二苯乙烯為結(jié)構(gòu)母核的化合物總稱，包括二苯乙烯、二苯乙基、菲類及它們的衍生物等。多羥基芪類化合物是當(dāng)前研究最廣泛、最深入的具有多種生物活性的芪類化合物。白藜蘆醇是其中的一個(gè)代表化合物，早期研究表明，白藜蘆醇具有抗菌、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、降血脂、保肝、鎮(zhèn)咳、平喘、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物活性。近年來，隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有化學(xué)防癌的功效，對腫瘤的起始、促進(jìn)和進(jìn)展三個(gè)階段均有明顯的抑制作用(jang,etal.,science,1997)。因此推測其他結(jié)構(gòu)的芪類化合物也可能具有較好的抗腫瘤活性。
目前芪類化合物可以由提取和化學(xué)合成來獲得，芪類化合物主要分布在種子植物中，但由于其在植物體中的含量極低，故提取率低，提取工藝較為繁瑣，一般需要反復(fù)提取多次，不僅溶劑用量和能耗增加，而且生產(chǎn)周期延長。目前采用化學(xué)法合成的芪類化合物，主要是通過wittig反應(yīng)(roberti,etal.，j.med.chem.，2003)、wittig-horner反應(yīng)(jung,etal.,eur.j.med.chem.,2009)、perkin反應(yīng)、heck反應(yīng)以及偶聯(lián)反應(yīng)(bjorkman,etal.,j.chem.soc.perkintrans.1,2000；felpin，etal.,chem.eur.j.,2010)構(gòu)建二苯乙烯骨架結(jié)構(gòu)從而獲得芪類化合物。這樣的合成反應(yīng)中，化合物的種類受取代基的個(gè)數(shù)及種類限制，難以得到活性較好的芪類化合物；其次，大多數(shù)偶聯(lián)反應(yīng)會(huì)生成順反異構(gòu)體，造成產(chǎn)物分離困難，同時(shí)也導(dǎo)致收率降低。因此采用新的合成路線得到新的芪類化合物對于研究新型抗腫瘤藥物具有重大意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一類具有抗腫瘤活性的反式芪類化合物，具有結(jié)構(gòu)通式i，ii，或iii所示結(jié)構(gòu)：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題合成一種新型的反式芪類化合物并將其用于抗腫瘤研究中。
本發(fā)明合成具有通式i的化合物路線是：
將有機(jī)胺溶于dmf中，在冰浴條件下滴加雙乙烯酮進(jìn)行加成反應(yīng)，30min后加入二硫化碳，反應(yīng)1h后滴加碘甲烷，“一鍋法”反應(yīng)2-3h生成α-羰基二硫縮稀酮中間體；然后在冰浴條件下，以氫氧化鈉為催化劑，將α-羰基二硫縮稀酮與肉桂醛或取代肉桂醛進(jìn)行羥醛縮合得到α-烯酰基二硫縮烯酮；最后以dbu為催化劑，將α-烯?；蚩s烯酮與硝基乙烷經(jīng)[5+1]芳構(gòu)化反應(yīng)得到具有抗腫瘤活性的新型反式芪類化合物。
根據(jù)通式i，該化合物有以下特征：r基團(tuán)為h-或ch3o-，r1為烷基或芐基，r2為-h或烷基；
根據(jù)通式ii，該化合物有以下特征：r基團(tuán)為h-或ch3o-，r1為-cooet，r2為烷烴或芐基；
根據(jù)通式iii，該化合物有以下特征：r基團(tuán)為h-或ch3o-，r1為-ch2ch2-，-ch2och2-。
另一方面本發(fā)明所述的反式芪類化合物具有抗腫瘤活性，其特征在于所述的化合物或其藥物可接受的鹽、衍生物、互變異構(gòu)體、前藥或立體異構(gòu)體可用于抗腫瘤藥物的制備。
附圖說明
附圖為合成的23種反式芪類化合物結(jié)構(gòu)
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：10#芪類化合物合成
(1)一鍋法制備α-羰基二硫縮稀酮：將5mmol嗎啉加入圓底燒瓶溶于7mldmf中，使用冰鹽浴將溫度降至-10℃，并緩慢滴加5mmol雙乙烯酮。10min滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)20min并使用tlc板監(jiān)測反應(yīng)狀況，底物反應(yīng)完全后直接加入10mmol弱堿碳酸鉀，活化反應(yīng)30min，然后加入6mmol二硫化碳，溶液變?yōu)榧t色，繼續(xù)反應(yīng)進(jìn)行1h后，緩慢滴加10mmol碘甲烷，30min滴加完畢后緩慢升至室溫反應(yīng)2～2.5h，使用tlc檢測反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)完全，加入蒸餾水停止反應(yīng)，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。收集有機(jī)層并水洗3次，加入除水劑干燥。使用硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，以石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫。并使用二氯甲烷與石油醚體系進(jìn)行重結(jié)晶得到2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-嗎啉基-1,3-丁二酮，收率為61％。
(2)α-烯酰基二硫縮稀酮制備：將上一步得到的2mmol產(chǎn)物2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-嗎啉基-1,3-丁二酮與對甲氧基肉桂醛加入圓底燒瓶，溶解于30mlthf中，體系溫度降至-10℃，然后加入4mmol氫氧化鈉，反應(yīng)約1h，通過tlc監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待底物完全消失后停止反應(yīng)，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph至中性，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到產(chǎn)物(4e，6e)-2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-嗎啉基-7-(4-甲氧基苯)-4,6-二烯-1,3-二酮，收率為71％。
(3)[5+1]合成終產(chǎn)物芪類衍生物：將上一步產(chǎn)物2mmol溶解在7mldmf中，室溫下攪拌，加入6mmol硝基乙烷，混合均勻后，在加入用thf稀釋后的3mmoldbu，室溫反應(yīng)30min后，將溫度升至75℃反應(yīng)2.5h，除后加入蒸餾水停止反應(yīng)，使用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚：乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到終產(chǎn)物，收率62％。1hnmr(500mhz,cdcl3):8.20-7.48(brs,1h),7.42(d,j＝8.5,2h),7.02(d,j＝16.0,1h),6.91(d,j＝8.5,2h),6.86(s,1h),6.75(d,j＝16.0,1h),4.10-3.93(m,1h),3.90-3.79(m,4h),3.78-3.66(m,3h),3.64-3.53(m,1h),3.42-3.17(m,2h),2.46(s,3h),2.29(s,3h)；13cnmr(125mhz,cdcl3):168.44,159.59,150.89,139.47,132.54,131.79,131.03,129.92,127.91,124.08,114.88,114.22,66.74,66.54,55.36,47.37,42.25,19.57,16.53.
實(shí)施例2：13#芪類化合物合成
(1)一鍋法制備α-羰基二硫縮稀酮：將5mmol環(huán)己胺加入到圓底燒瓶溶于7mldmf中，使用冰浴將溫度降至-10℃，并緩慢滴加5mmol雙乙烯酮，10min滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)20min并使用tlc板監(jiān)測反應(yīng)狀況，底物反應(yīng)完全后直接加入10mmol弱堿碳酸鉀，活化反應(yīng)30min，然后加入6mmol二硫化碳，溶液變?yōu)榧t色，繼續(xù)反應(yīng)進(jìn)行1h后，緩慢滴加10mmol碘甲烷，30min滴加完畢后緩慢升至室溫反應(yīng)2～2.5h，使用tlc檢測反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)完全，加入蒸餾水停止反應(yīng)，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。收集有機(jī)層并水洗3次，加入除水劑干燥。使用硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，以石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫。并使用二氯甲烷與石油醚體系進(jìn)行重結(jié)晶得到2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-環(huán)己基-1,3-丁二酮，收率為61％。
(2)α-烯酰基二硫縮稀酮制備：將上一步得到的2mmol產(chǎn)物2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-環(huán)己基-1,3-丁二酮與肉桂醛加入圓底燒瓶，溶解于30ml二甲基亞砜中，體系溫度調(diào)至10～20℃，然后加入4mmol氫氧化鈉，反應(yīng)約1h，通過tlc監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待底物完全消失后停止反應(yīng)，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph至中性，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到產(chǎn)物(4e.6e)-2-(二(甲硫基)甲烯基)-7-(4-甲氧基苯)-1-環(huán)己基-4，6-二烯-1,3-二酮，產(chǎn)率75％。
(3)[5+1]合成終產(chǎn)物芪類衍生物：將上一步2mmol產(chǎn)物溶解在7mldmf中，室溫下攪拌，加入6mmol硝基乙烷，混合均勻后，在加入用thf稀釋后的3mmoldbu，室溫反應(yīng)30min后，將溫度升至75℃反應(yīng)2.5h，除后加入蒸餾水停止反應(yīng)，使用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚：乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到終產(chǎn)物(e)-3-環(huán)己胺甲酰基-4-羥基-2-甲硫基-6-苯乙烯基-苯甲酰胺，收率62％。1hnmr(500mhz,cdcl3):13.41(s,1h),9.55(d,j＝7.5,1h),7.47(d,j＝7.4,2h),7.37(t,j＝7.5,2h),7.33-7.27(m,2h),7.15(d,j＝16.1,1h),6.91(d,j＝16.1,1h),4.45(q,j＝7.1,2h),4.17-3.99(m,1h),2.39(s,3h),2.07-1.93(m,2h),1.81-1.59(m,3h),1.53-1.19(m,8h)；13cnmr(125mhz,cdcl3):168.11,168.05,163.69,138.62,136.34,134.14,133.07,130.44,128.79,128.65,127.05,123.43,115.96,115.23,61.69,48.56,32.49,25.52,24.56,21.33,14.29.
實(shí)施例3：23#芪類化合物合成
(1)一鍋法制備α-羰基二硫縮稀酮：將5mmol二乙胺加入圓底燒瓶溶于7mldmf中，使用冰浴將溫度降至-10℃，并緩慢滴加5mmol雙乙烯酮。10min滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)20min并使用tlc板監(jiān)測反應(yīng)狀況，底物反應(yīng)完全后直接加入10mmol弱堿碳酸鉀，活化反應(yīng)30min，然后加入6mmol二硫化碳，溶液變?yōu)榧t色，繼續(xù)反應(yīng)進(jìn)行1h后，緩慢滴加10mmol碘甲烷，30min滴加完畢后緩慢升至室溫反應(yīng)2～2.5h，使用tlc檢測反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)完全，加入蒸餾水停止反應(yīng)，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。收集有機(jī)層并水洗3次，加入除水劑干燥。使用硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，以石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫。并使用二氯甲烷與石油醚體系進(jìn)行重結(jié)晶得到2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-二乙基-1,3-丁二酮，收率為74％.
(2)α-烯酰基二硫縮稀酮制備：將上一步得到的2mmol產(chǎn)物2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-二乙基-1，3-丁二酮與對甲氧基肉桂醛加入圓底燒瓶，溶解于30mlthf中，體系溫度降至-10℃，然后加入4mmol氫氧化鈉，反應(yīng)約1h，通過tlc監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待底物完全消失后停止反應(yīng)，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph至中性，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到產(chǎn)物(4e.6e)-2-(二(甲硫基)甲烯基)-7-(4-甲氧基苯)-1-二乙基-4,6-二烯-1,3-二酮，收率為64％。
(3)[5+1]合成終產(chǎn)物芪類衍生物：將上一步產(chǎn)物2mmol溶解在7mldmf中，室溫下攪拌，加入6mmol硝基乙烷，混合均勻后，在加入用thf稀釋后的3mmoldbu，室溫反應(yīng)30min后，將溫度升至75℃反應(yīng)2.5h，除后加入蒸餾水停止反應(yīng)，使用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚：乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到終產(chǎn)物(e)-3-甲基-6-羥基-n,n-二乙基-2-甲硫基-4-(4-甲氧基苯乙烯基)-苯甲酰胺，收率為58％。1h-nmr(500mhz,cdcl3):1.073(t,j＝7,3h),1.293(t,j＝7,3h),2.292(s,3h),2.460(s,3h),3.154(q,j＝7.5,2h),3.235(q,j＝3.25,2h),3.846(s,3h),6.749(d,j＝8,1h),6.830(s,1h),6.905(d,j＝9,2h),7.023(d,1h),7.426(d,2h),7.677(s,1h)；13c-nmr(125mhz,cdcl3):12.29,13.59,16.51,19.38,39.11,43.36,55.33,114.18,114.18,115.43,124.35,124.35,127.81,127.81,130.16,130.41,131.57,131.95,138.64,150.79,159.43,169.33.
實(shí)施例4：24#芪類化合物合成
(1)一鍋法制備α-羰基二硫縮稀酮：將5mmol正戊胺加入圓底燒瓶溶于7mldmf中，使用冰鹽浴將溫度降至-10℃，并緩慢滴加5mmol雙乙烯酮。10min滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)20min并使用tlc板監(jiān)測反應(yīng)狀況，底物反應(yīng)完全后直接加入10mmol弱堿碳酸鉀，活化反應(yīng)30min，然后加入6mmol二硫化碳，溶液變?yōu)榧t色，繼續(xù)反應(yīng)進(jìn)行1h后，緩慢滴加10mmol碘甲烷，30min滴加完畢后緩慢升至室溫反應(yīng)2～2.5h，使用tlc檢測反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)完全，加入蒸餾水停止反應(yīng)，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。收集有機(jī)層并水洗3次，加入除水劑干燥。使用硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，以石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫。并使用二氯甲烷與石油醚體系進(jìn)行重結(jié)晶得到2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-戊基-1,3-丁二酮，收率為69％。
(2)α-烯?；蚩s稀酮制備：將上一步得到的2mmol產(chǎn)物2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-戊基-1,3-丁二酮與對甲氧基肉桂醛加入圓底燒瓶，溶解于30mlthf中，體系溫度降至-10℃，然后加入4mmol氫氧化鈉，反應(yīng)約1h，通過tlc監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待底物完全消失后停止反應(yīng)，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph至中性，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到產(chǎn)物(4e.6e)-2-(二(甲硫基)甲烯基)-7-(4-甲氧基苯)-1-戊基-4,6-二烯-1,3-二酮，收率為68％。
(3)[5+1]合成終產(chǎn)物芪類衍生物：將上一步產(chǎn)物2mmol溶解在7mldmf中，室溫下攪拌，加入6mmol硝基乙烷，混合均勻后，在加入用thf稀釋后的3mmoldbu，室溫反應(yīng)30min后，將溫度升至75℃反應(yīng)2.5h，除后加入蒸餾水停止反應(yīng)，使用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚：乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到終產(chǎn)物(e)-3-甲基-6-羥基-n-戊基-2-甲硫基-4-(4-甲氧基苯乙烯基)-苯甲酰胺，收率為58％。1h-nmr(500mhz):0.932(s,3h),1.393-1.400(m,4h),1.574(m,2h),2.302(s,3h),2.576(s,3h),3.488(t,j＝6,2h),3.834(s,3h),6.906(d,j＝9,2h),6.948(d,j＝16,1h),6.964(s,1h),7.146(t,j＝7.5,2h),7.258(s,1h),7.453(d,j＝8.5,1h),9.536(s,1h),12.797(s,1h)；13c-nmr(500mhz):14.02,17.46,20.38,22.36,28.77,29.42,39.94,55.36,114.22,114.22,116.09,124.18,128.16,128.16,128.16,129.83,131.12,132.56,133.13,142.1,159.79,160.65,170.03.
實(shí)施例5：25#芪類化合物合成
(1)一鍋法制備α-羰基二硫縮稀酮：將5mmol芐胺加入圓底燒瓶溶于7mldmf中，使用冰浴將溫度降至-10℃，并緩慢滴加5mmol雙乙烯酮。10min滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)20min并使用tlc板監(jiān)測反應(yīng)狀況，底物反應(yīng)完全后直接加入10mmol弱堿碳酸鉀，活化反應(yīng)30min，然后加入6mmol二硫化碳，溶液變?yōu)榧t色，繼續(xù)反應(yīng)進(jìn)行1h后，緩慢滴加10mmol碘甲烷，30min滴加完畢后緩慢升至室溫反應(yīng)2～2.5h，使用tlc檢測反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)完全，加入蒸餾水停止反應(yīng)，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。收集有機(jī)層并水洗3次，加入除水劑干燥。使用硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，以石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫。并使用二氯甲烷與石油醚體系進(jìn)行重結(jié)晶得到2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-芐基-1,3-丁二酮。
(2)α-烯酰基二硫縮稀酮制備：將上一步得到的2mmol產(chǎn)物2-(二(甲硫基)甲烯基)-1-芐基-1,3-丁二酮與肉桂醛加入圓底燒瓶，溶解于30mlthf中，體系溫度降至-10℃，然后加入4mmol氫氧化鈉，反應(yīng)約1h，通過tlc監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待底物完全消失后停止反應(yīng)，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph至中性，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到產(chǎn)物(4e.6e)-2-(二(甲硫基)甲烯基)-7-(4-甲氧基苯)-1-芐基-4,6-二烯-1,3-二酮。
(3)[5+1]合成終產(chǎn)物芪類衍生物：將上一步產(chǎn)物2mmol溶解在7mldmf中，室溫下攪拌，加入6mmol硝基乙烷，混合均勻后，在加入用thf稀釋后的3mmoldbu，室溫反應(yīng)30min后，將溫度升至75℃反應(yīng)2.5h，除后加入蒸餾水停止反應(yīng)，使用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)層3次，然后合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥。抽濾，減壓蒸發(fā)濃縮至干。使用石油醚：乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，硅膠柱層析分離純化，得到終產(chǎn)物(e)-3-甲基-6-羥基-n-芐基-2-甲硫基-4-苯乙烯基苯甲酰胺，收率為63％。1h-nmr(500mhz,cdcl3):2.190(s,3h),2.567(s,3h),4.695(d,j＝5.5,2h),6.980(s,1h),7.010(d,j＝2,1h),7.216(s,1h),7,252(d,j＝4.5,1h),7.284(s,1h),7.375(m,j＝25,6h),7.515(d,j＝7,2h),9.941(s,1h),12.751(s,1h)；13c-nmr(125mhz,cdcl3):17.48,20.40,44.03,116.13,116.49,126.35,126.89,127.70,127.70,127.94,128.28,128.28,128.79,128.79,128.85,128.85,131.47,133.16,133.34,136.95,137.53,142.04,160.80,170.01.
實(shí)施例6：抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)
mtt法觀察反式芪類化合物對人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7、人肝癌細(xì)胞株hepg-2、人胃癌sgc-7901的增值影響
(1)材料：
細(xì)胞株：人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7、人肝癌細(xì)胞株hepg-2、人胃癌sgc-7901購置于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)。
實(shí)驗(yàn)藥物：制備的部分反式芪類化合物；白藜蘆醇，上海昊化化工有限公司；0.9％的生理鹽水，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)；無水乙醇(ar)，天津市東麗區(qū)天大化工試劑廠；rpmi1640培養(yǎng)基，美國hyclone公司；胰蛋白酶，美國gibco公司；edta，美國sigma公司；mtt(噻唑藍(lán))，美國sigma公司；小牛血清，天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國coming公司；96孔培養(yǎng)板，加拿大jet公司；封口膜，美國parafilm公司；二甲基亞砜(dmso)，美國amerseco公司；青霉素、鏈霉素，美國hyclone公司；co2氣體，哈爾濱。
(2)實(shí)驗(yàn)方法：
腫瘤細(xì)胞的復(fù)蘇：(1)從液氮罐中取出保存有細(xì)胞株的凍存管，迅速置于37℃的水浴箱中，并反復(fù)搖動(dòng)，直至凍存管中無固態(tài)物質(zhì)，取出置于超凈臺(tái)中；(2)用70％乙醇仔細(xì)擦凈凍存管的管口后開蓋，用1000μl微量移液器吸凈管中液體，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中；(3)補(bǔ)加10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，棄上清；此過程重復(fù)一次；(4)加入含10％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打混勻后置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)入37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)過夜；
細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：(1)每日用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞，如發(fā)現(xiàn)污染或細(xì)胞碎裂，丟棄；(2)肉眼觀察培養(yǎng)液顏色，如果顏色由紅色轉(zhuǎn)為黃色，則說明細(xì)胞密度過大，需要及時(shí)更換培養(yǎng)液；(3)酶胰消化后，在超凈臺(tái)中用吸管將細(xì)胞吹打混勻，取1ml置于新培養(yǎng)瓶中，依次加入8mldmem培養(yǎng)基1ml胎牛血清；(4)將傳代后細(xì)胞重新放回37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)；(5)將四種腫瘤細(xì)胞連續(xù)體外傳代20次后，可獲得相對純凈的腫瘤細(xì)胞，方可用于之。
細(xì)胞增值抑制實(shí)驗(yàn)：(1)分別取處于指數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液稀釋成20000個(gè)細(xì)胞/ml；(2)96孔板每孔中加入200μl細(xì)胞懸液，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；(3)將藥物用dmso溶解，每孔中加入設(shè)定濃度藥物，稀釋至需要的工作濃度(用rpmi1640細(xì)胞維持稀釋)。同時(shí)以白藜蘆醇為陽性對照；(4)置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h；(5)mtt用無血清rpmi1640培養(yǎng)液配成5mg/ml溶液，每孔中加入20μl，置于37℃、5％co2孵箱中孵育4h；(6)吸出上清，用培養(yǎng)液洗三次加入100μldmso溶解沉淀物，用振蕩器搖勻測定od570值；(7)按下列公式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組od/對照組od)×100％。
(3)結(jié)果
表1反式芪類化合物對腫瘤細(xì)胞的體外半數(shù)抑制率
從表中可以看出，合成的新型反式芪類化合物主要對hepg2和pc-3兩種癌細(xì)胞表現(xiàn)出比較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，對a549的細(xì)胞毒性稍弱。在所測定的25種化合物中，化合物2,5,10,13,20和25對三種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性均較好。而化合物3,4,8和17對三種癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性都很小。整體上看，大部分化合物對三種癌細(xì)胞的有著不同的選擇性，化合物13,19,20和24對肝癌細(xì)胞hepg2顯示出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性選擇性，而對于肺癌細(xì)胞a549而言，除了化合物23外，其他的新化合物并沒有表現(xiàn)出很好的細(xì)胞毒性選擇性。