本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種厚樸花低聚糖及多糖的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
厚樸花為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥花蕾。具有芳香化濕，理氣寬中的功效，臨床用于脾胃濕阻氣滯，胸脘痞悶脹滿，納谷不香?，F(xiàn)對其有效成分的研究主要集中在厚樸酚、和厚樸酚、揮發(fā)油等成分，對其中低聚糖及多糖的研究尚未見報(bào)道，尤其是如何解決一體化制備厚樸花低聚糖及多糖也沒有見公開報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種厚樸花低聚糖及多糖的制備方法，可有效解決厚樸花低聚糖及多糖的制備及厚樸花多糖在制備增強(qiáng)免疫力的藥物和保健品中的應(yīng)用和厚樸花低聚糖在制備抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑或化妝品中的應(yīng)用問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種厚樸花低聚糖及多糖的制備方法，包括以下步驟：
(1)厚樸花粗低聚糖提取液的制備
稱取厚樸花藥材，加入藥材重量8～21倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取35～90min，過濾，藥渣揮盡石油醚(60～90℃)，晾干，加入厚樸花藥材重量8～20倍量的80％乙醇(v/v)，超聲提取2次，每次30～60min，過濾，藥渣備用，合并濾液，45℃減壓濃縮至比重為1.08～1.16得厚樸花粗低聚糖提取液，備用；
(2)厚樸花粗多糖的制備
取纖維素酶和木瓜蛋白酶按照3.2:1～5.1:1的重量比混合，加蒸餾水溶解制成質(zhì)量濃度為0.4％～1.1％的混合酶溶液；取步驟(1)中提取厚樸花低聚糖后的厚樸花藥渣，按重量加入15～27倍的混合酶溶液，用鹽酸調(diào)pH至4.5～5.7，45～58℃攪拌酶解6～9h，99℃加熱15min滅酶，酶解液放至室溫，得厚樸花粗多糖溶液；厚樸花粗多糖溶液減壓回收溶劑至厚樸花藥材重量的1.3～1.9倍，5000r/m離心15min,取上清液即得厚樸花粗多糖濃縮液，濃縮液在攪拌下加入95％的乙醇(v/v)，使?jié)饪s液中含醇量為75％～80％(v/v)，靜置12h，濾去上部液體，得底部沉淀物，用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，22～50℃下減壓干燥，得厚樸花粗多糖；
(3)厚樸花低聚糖及多糖的純化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑溶液的配制A組分溶液：稱取A組分1份，加入A組分99倍重量的蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液；B組分溶液：稱取B組分1份，加入B組分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液；取步驟(1)所制備的厚樸花粗低聚糖提取液，加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液，混勻，80℃水浴加熱40min，每間隔5min攪拌1次，每次攪拌時(shí)間為3min，40min后加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液，邊加邊攪拌，1h后攪拌1次，攪拌時(shí)間10min，繼續(xù)80℃水浴加熱1.5h，6000r/min離心10min，傾出上清液，減壓濃縮成比重為1.10～1.20的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量達(dá)75％(v/v)，靜置8h，6000r/min離心15min，傾出上清液，棄去沉淀，上清液減壓濃縮成浸膏(比重1.10～1.20)，冷凍干燥即得厚樸花低聚糖粉末；
取步驟(1)所制備的厚樸花粗多糖，加厚樸花粗多糖10倍重量的蒸餾水80℃水浴加熱使溶解，冷卻至室溫，加入30％過氧化氫(v/v)，加入30％過氧化氫(v/v)的體積為厚樸花粗多糖溶液體積的1/4～1/3，混勻，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5～9.1，70℃水浴下不斷攪拌30min，100℃加熱5～10min，抽濾，濾液減壓濃縮至比重為1.10～1.15的浸膏，過Sephadex G-200凝膠樹脂柱，收集多糖部分洗脫液，冷凍干燥即得厚樸花多糖粉末。
實(shí)現(xiàn)以厚樸花為原料制備厚樸花低聚糖及多糖并有效用于制備增強(qiáng)免疫力和抗氧化的藥物和保健品，實(shí)現(xiàn)厚樸花糖在制備增強(qiáng)免疫力的藥物和保健品中的應(yīng)用，厚樸花低聚糖在制備抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑或化妝品中的應(yīng)用。
本發(fā)明制備方法簡單，易操作，原料豐富，產(chǎn)品應(yīng)用面廣，以厚樸花為原料同時(shí)制備厚樸花低聚糖及多糖，開發(fā)了厚樸花藥材的應(yīng)用范圍，厚樸花多糖可用于制備增強(qiáng)免疫力的藥物和保健品，厚樸花低聚糖可用于制備抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑或化妝品，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，是中藥上的巨大創(chuàng)新。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體情況作詳細(xì)說明。
本發(fā)明在具體實(shí)施中，可由以下實(shí)施例給出：
實(shí)施例1
本發(fā)明制備的厚樸花低聚糖及多糖，在具體實(shí)施中，可經(jīng)以下步驟制成：
(1)厚樸花粗低聚糖提取液的制備
稱取厚樸花藥材，加入藥材重量8倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取35min，過濾，藥渣揮盡石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超聲提取2次，每次加入80％乙醇(v/v)的量為厚樸花藥材重量的8倍量，每次提取時(shí)間30min，過濾，藥渣備用，合并濾液，45℃減壓濃縮至比重為1.08得厚樸花粗低聚糖提取液，備用；
(2)厚樸花粗多糖的制備
取纖維素酶和木瓜蛋白酶按照3.2:1的重量比混合，加蒸餾水溶解制成質(zhì)量濃度為0.4％的混合酶溶液；取步驟(1)中提取厚樸花低聚糖后的厚樸花藥渣，按重量加入15倍的混合酶溶液，用鹽酸調(diào)pH至4.5，45℃攪拌酶解6h，99℃加熱15min滅酶，酶解液放至室溫，得厚樸花粗多糖溶液；厚樸花粗多糖溶液減壓回收溶劑至厚樸花藥材重量的1.3倍，5000r/m離心15min，取上清液即得厚樸花粗多糖濃縮液，濃縮液在攪拌下加入95％的乙醇(v/v)，使?jié)饪s液中含醇量為75％(v/v)，靜置12h，濾去上部液體，得底部沉淀物，用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，22℃下減壓干燥，得厚樸花粗多糖；
(3)厚樸花低聚糖及多糖的純化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑溶液的配制A組分溶液：稱取A組分1份，加入A組分99倍重量的蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液；B組分溶液：稱取B組分1份，加入B組分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液；取步驟(1)所制備的厚樸花粗低聚糖提取液，加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液，混勻，80℃水浴加熱40min，每間隔5min攪拌1次，每次攪拌時(shí)間為3min，40min后加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液，邊加邊攪拌，1h后攪拌1次，攪拌時(shí)間10min，繼續(xù)80℃水浴加熱1.5h，6000r/min離心10min，傾出上清液，減壓濃縮成比重為1.10的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量達(dá)75％(v/v)，靜置8h，6000r/min離心15min，傾出上清液，棄去沉淀，上清液減壓濃縮成浸膏(比重1.10)，冷凍干燥即得厚樸花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花低聚糖中糖含量為83.1％；
取步驟(1)所制備的厚樸花粗多糖，加厚樸花粗多糖10倍重量的蒸餾水80℃水浴加熱使溶解，冷卻至室溫，加入30％過氧化氫(v/v)，加入30％過氧化氫(v/v)的體積為厚樸花粗多糖溶液體積的1/4，混勻，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.5，70℃水浴下不斷攪拌30min，100℃加熱5min，抽濾，濾液減壓濃縮至比重為1.10的浸膏，過Sephadex G-200凝膠樹脂柱，收集多糖部分洗脫液，冷凍干燥即得厚樸花多糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花多糖中糖含量為87.6％。
實(shí)施例2
本發(fā)明制備的厚樸花低聚糖及多糖，在具體實(shí)施中，還可經(jīng)以下步驟制成：
(1)厚樸花粗低聚糖提取液的制備
稱取厚樸花藥材，加入藥材重量21倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取90min，過濾，藥渣揮盡石油醚(60～90℃)，晾干，加入厚樸花藥材重量20倍量的80％乙醇(v/v)，超聲提取2次，每次60min，過濾，藥渣備用，合并濾液，45℃減壓濃縮至比重為1.16得厚樸花粗低聚糖提取液，備用；
(2)厚樸花粗多糖的制備
取纖維素酶和木瓜蛋白酶按照5.1:1的重量比混合，加蒸餾水溶解制成質(zhì)量濃度為1.1％的混合酶溶液；取步驟(1)中提取厚樸花低聚糖后的厚樸花藥渣，按重量加入27倍的混合酶溶液，用鹽酸調(diào)pH至5.7，58℃攪拌酶解9h，99℃加熱15min滅酶，酶解液放至室溫，得厚樸花粗多糖溶液；厚樸花粗多糖溶液減壓回收溶劑至厚樸花藥材重量的1.9倍，5000r/m離心15min，取上清液即得厚樸花粗多糖濃縮液，濃縮液在攪拌下加入95％的乙醇(v/v)，使?jié)饪s液中含醇量為80％(v/v)，靜置12h，濾去上部液體，得底部沉淀物，用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下減壓干燥，得厚樸花粗多糖；
(3)厚樸花低聚糖及多糖的純化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑溶液的配制A組分溶液：稱取A組分1份，加入A組分99倍重量的蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液；B組分溶液：稱取B組分1份，加入B組分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液；取步驟(1)所制備的厚樸花粗低聚糖提取液，加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液，混勻，80℃水浴加熱40min，每間隔5min攪拌1次，每次攪拌時(shí)間為3min，40min后加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液，邊加邊攪拌，1h后攪拌1次，攪拌時(shí)間10min，繼續(xù)80℃水浴加熱1.5h，6000r/min離心10min，傾出上清液，減壓濃縮成比重為1.20的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量達(dá)75％(v/v)，靜置8h，6000r/min離心15min，傾出上清液，棄去沉淀，上清液減壓濃縮成浸膏(比重1.20)，冷凍干燥即得厚樸花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花低聚糖中糖含量為82.2％；
取步驟(1)所制備的厚樸花粗多糖，加厚樸花粗多糖10倍重量的蒸餾水80℃水浴加熱使溶解，冷卻至室溫，加入30％過氧化氫(v/v)，加入30％過氧化氫(v/v)的體積為厚樸花粗多糖溶液體積的1/3，混勻，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.1，70℃水浴下不斷攪拌30min，100℃加熱10min，抽濾，濾液減壓濃縮至比重為1.15的浸膏，過Sephadex G-200凝膠樹脂柱，收集多糖部分洗脫液，冷凍干燥即得厚樸花多糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花多糖中糖含量為89.8％。
實(shí)施例3
本發(fā)明制備的厚樸花低聚糖及多糖，在具體實(shí)施中，亦可經(jīng)以下步驟制成：
(1)厚樸花粗低聚糖提取液的制備
稱取厚樸花藥材，加入藥材重量14倍量的石油醚(60～90℃)，浸泡25min，70℃水浴回流提取68min，過濾，藥渣揮盡石油醚(60～90℃)，晾干，加入厚樸花藥材重量14倍量的80％乙醇(v/v)，超聲提取2次，每次45min，過濾，藥渣備用，合并濾液，45℃減壓濃縮至比重為1.12得厚樸花粗低聚糖提取液，備用；
(2)厚樸花粗多糖的制備
取纖維素酶和木瓜蛋白酶按照4.1:1的重量比混合，加蒸餾水溶解制成質(zhì)量濃度為0.8％的混合酶溶液；取步驟(1)中提取厚樸花低聚糖后的厚樸花藥渣，按重量加入21倍的混合酶溶液，用鹽酸調(diào)pH至5.1，52℃攪拌酶解7.5h，99℃加熱15min滅酶，酶解液放至室溫，得厚樸花粗多糖溶液；厚樸花粗多糖溶液減壓回收溶劑至厚樸花藥材重量的1.6倍，5000r/m離心15min，取上清液即得厚樸花粗多糖濃縮液，濃縮液在攪拌下加入95％的乙醇(v/v)，使?jié)饪s液中含醇量為77％(v/v)，靜置12h，濾去上部液體，得底部沉淀物，用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，41℃下減壓干燥，得厚樸花粗多糖；
(3)厚樸花低聚糖及多糖的純化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑溶液的配制A組分溶液：稱取A組分1份，加入A組分99倍重量的蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液；B組分溶液：稱取B組分1份，加入B組分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液；取步驟(1)所制備的厚樸花粗低聚糖提取液，加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液，混勻，80℃水浴加熱40min，每間隔5min攪拌1次，每次攪拌時(shí)間為3min，40min后加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液，邊加邊攪拌，1h后攪拌1次，攪拌時(shí)間10min，繼續(xù)80℃水浴加熱1.5h，6000r/min離心10min，傾出上清液，減壓濃縮成比重為1.15的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量達(dá)75％(v/v)，靜置8h，6000r/min離心15min，傾出上清液，棄去沉淀，上清液減壓濃縮成浸膏(比重1.15)，冷凍干燥即得厚樸花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花低聚糖中糖含量為84.7％；
取步驟(1)所制備的厚樸花粗多糖，加厚樸花粗多糖10倍重量的蒸餾水80℃水浴加熱使溶解，冷卻至室溫，加入30％過氧化氫(v/v)，加入30％過氧化氫(v/v)的體積為厚樸花粗多糖溶液體積的7/24，混勻，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.3，70℃水浴下不斷攪拌30min，100℃加熱7.5min，抽濾，濾液減壓濃縮至比重為1.12的浸膏，過Sephadex G-200凝膠樹脂柱，收集多糖部分洗脫液，冷凍干燥即得厚樸花多糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花多糖中糖含量為88.3％。
實(shí)施例4
本發(fā)明制備的厚樸花低聚糖及多糖，在具體實(shí)施中，又可經(jīng)以下步驟制成：
(1)厚樸花粗低聚糖提取液的制備
稱取厚樸花藥材5kg，加入石油醚(60～90℃)40kg，浸泡25min，70℃水浴回流提取35min，過濾，藥渣揮盡石油醚(60～90℃)，晾干，加入80％乙醇(v/v)超聲提取2次，每次加80％乙醇(v/v)的量為70kg，每次超聲30min，過濾，藥渣備用，合并濾液，45℃減壓濃縮至比重為1.12得厚樸花粗低聚糖提取液，備用；
(2)厚樸花粗多糖的制備
取纖維素酶和木瓜蛋白酶按照5.1:1的重量比混合，加蒸餾水溶解制成質(zhì)量濃度為0.8％的混合酶溶液；取步驟(1)中提取厚樸花低聚糖后的厚樸花藥渣，按重量加入21倍的混合酶溶液，用鹽酸調(diào)pH至4.5，58℃攪拌酶解7.5h，99℃加熱15min滅酶，酶解液放至室溫，得厚樸花粗多糖溶液；厚樸花粗多糖溶液減壓回收溶劑8kg，5000r/m離心15min，取上清液即得厚樸花粗多糖濃縮液，濃縮液在攪拌下加入95％的乙醇(v/v)，使?jié)饪s液中含醇量為75％(v/v)，靜置12h，濾去上部液體，得底部沉淀物，用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下減壓干燥，得厚樸花粗多糖；
(3)厚樸花低聚糖及多糖的純化
Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑溶液的配制A組分溶液：稱取A組分1份，加入A組分99倍重量的蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液；B組分溶液：稱取B組分1份，加入B組分99倍重量的1％乙酸(v/v)，配制成質(zhì)量濃度為1％的溶液，即得Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液；取步驟(1)所制備的厚樸花粗低聚糖提取液，加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑B組分溶液，混勻，80℃水浴加熱40min，每間隔5min攪拌1次，每次攪拌時(shí)間為3min，40min后加入厚樸花低聚糖提取液質(zhì)量1/40的Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑A組分溶液，邊加邊攪拌，1h后攪拌1次，攪拌時(shí)間10min，繼續(xù)80℃水浴加熱1.5h，6000r/min離心10min，傾出上清液，減壓濃縮成比重為1.10的浸膏，加入95％乙醇(v/v)至含醇量達(dá)75％(v/v)，靜置8h，6000r/min離心15min，傾出上清液，棄去沉淀，上清液減壓濃縮成浸膏(比重1.20)，冷凍干燥即得厚樸花低聚糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花低聚糖中糖含量為86.4％；
取步驟(1)所制備的厚樸花粗多糖，加厚樸花粗多糖10倍重量的蒸餾水80℃水浴加熱使溶解，冷卻至室溫，加入30％過氧化氫(v/v)，加入30％過氧化氫(v/v)的體積為厚樸花粗多糖溶液體積的1/4，混勻，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.3，70℃水浴下不斷攪拌30min，100℃加熱5min，抽濾，濾液減壓濃縮至比重為1.15的浸膏，過Sephadex G-200凝膠樹脂柱，收集多糖部分洗脫液，冷凍干燥即得厚樸花多糖粉末，蒽酮-硫酸法測定厚樸花多糖中糖含量為90.1％。
上述制備的2種活性成分經(jīng)蒽酮-硫酸法(常規(guī)測定方法，是公知技術(shù))測定，其糖含量均不低于80％。經(jīng)HPGPC法(公知技術(shù))測定，厚樸花低聚糖的分子量均在350～2000之間，厚樸花多糖的分子量均大于3000。
上述僅是給出幾個(gè)實(shí)例，在研制中，發(fā)明人經(jīng)反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，均取得了相同或相似的結(jié)果，方法科學(xué)有效，具有較高實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并對厚樸花低聚糖及多糖進(jìn)行反復(fù)的試驗(yàn)均取得了滿意的技術(shù)效果，有關(guān)試驗(yàn)資料如下：
厚樸花多糖的免疫活性實(shí)驗(yàn)
一.試驗(yàn)材料
1.試驗(yàn)動(dòng)物：18.5～23g昆明種清潔劑小鼠，雌雄各半。由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2.實(shí)驗(yàn)試藥：本發(fā)明方法制備的厚樸花多糖(蒽酮-硫酸法測定厚樸花多糖中糖含量為90.1％)，香菇多糖(湖北廣仁藥業(yè)有限公司)，瑞士染液，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，枸櫞酸鈉，氯化鈉，氯化鈣，酒石酸鉀鈉，氯化鉀，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，酚紅，葡萄糖。
二.試驗(yàn)方法
1.厚樸花多糖對正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
取小鼠50只，體重18～22g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為5組。分別灌服小、中、大劑量的厚樸花多糖水溶液(15mg/ml，25mg/ml，45mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(10mg/ml；0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于第7天早上各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.5ml。于第7天灌胃給藥后2h，注射5％雞紅細(xì)胞4h后，脫頸椎處死小鼠，腹腔注入漢氏液2.5ml，輕揉小鼠腹部；然后剪開小鼠腹部皮膚，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于試管中，混勻；吸取少許腹腔液滴于載玻片上，將載玻片放在鋪有濕紗布的糖瓷盤中，37℃孵育30min，瑞氏染液染色，顯微鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬情況，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
表1腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能結(jié)果
**表示與空白組比P＜0.01，*表示與空白組比P＜0.05
從表1可以看出，與空白對照組比，中劑量組、大劑量組及香菇多糖組均能極顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)(P＜0.01)，其中尤以大劑量厚樸花多糖組作用為最強(qiáng)；小劑量多糖組能顯著提高吞噬百分率及吞噬指數(shù)(P＜0.05)。2.厚樸花多糖對正常小鼠溶血素形成的影響
取小鼠50只，體重18.5～23g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為5組。分別灌服小、中、大劑量的厚樸花多糖水溶液(15mg/ml，25mg/ml，45mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。同時(shí)，給藥第1天各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫，于最后1次給藥后2h，小鼠眼眶取血，離心，分離血清。用生理鹽水1∶100稀釋后，取1ml稀釋液與5％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml、10％補(bǔ)體0.5ml(豚鼠血清，用雞紅細(xì)胞預(yù)先飽和6h)混勻，37℃孵育30min，冰水中終止反應(yīng)。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管作對照，吸取各管上清液于UV-TU1810型分光光度計(jì)540nm處比色，測定各組溶血素形成情況。
3.厚樸花多糖對正常小鼠溶血空斑形成的影響
取小鼠50只，體重18～22g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為5組。分別灌服小、中、大劑量的厚樸花多糖水溶液(15mg/ml，25mg/ml，45mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(10mg/ml；0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。同時(shí)，給藥第1天各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫，于最后1次給藥后2h，脫頸椎處死并解剖小鼠，取出脾臟，勻漿，并調(diào)整脾細(xì)胞混懸液中脾細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/ml。取脾細(xì)胞混懸液1.0ml，與0.2％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管，37℃孵育1h，離心，取上清液于UV-TU1810型分光光度計(jì)413nm處比色，測各組溶血空斑形成情況。
表2溶血素、溶血空斑形成結(jié)果
**表示與空白組比P＜0.01，**表示與空白組比P＜0.01，*表示與空白組比P＜0.05
從表2可以看出，與空白對照組比，大、小劑量組溶血空斑均顯著升高(P＜0.05)，中劑量組和香菇多糖組溶血素和溶血空斑均極顯著提高(P＜0.01)。其中尤以中劑量厚樸花多糖組作用為最優(yōu)。
4.厚樸花多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
取小鼠60只，體重18.5～23g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為6組。除空白對照組外，其余各組均建立環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型共5組(劑量為8mg/ml；第1、2、3天連續(xù)腹腔注射)，模型組建立完成后，分別灌服厚樸花多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于給藥最后一天早上各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.5ml，灌胃給藥后2h，給雞紅細(xì)胞后4h，脫頸椎處死小鼠。腹腔注入漢氏液2.5ml，輕揉小鼠腹部，然后剪開小鼠腹部皮膚，在腹膜上剪一小孔，用移液槍吸取腹腔液2ml置于試管中，混勻；吸取少許腹腔液滴于載玻片上，液點(diǎn)大小約為1.5cm×2cm。將載玻片放在鋪有濕紗布的糖瓷盤中，37℃孵育30min，生理鹽水沖去附著的細(xì)胞，瑞氏染液染色，自來水沖洗晾干，顯微鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬情況，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
表3腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能結(jié)果
**表示與模型組比P＜0.01
從表3可以看出，與空白組相比，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率顯著降低(P＜0.01)，說明造模成功。與模型組相比，大、中、小劑量多糖組和香菇多糖組可顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率(P＜0.01)。
5.厚樸花多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠溶血素形成的影響
取小鼠60只，體重18.5～23g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為6組。除空白對照組外，其余各組均建立環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型共5組(劑量為8mg/ml；第1、2、3天連續(xù)腹腔注射)；模型組建立完成后，各組小鼠(含空白組)均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫；并開始分別灌服厚樸花多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混懸液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。最后1次給藥后2h，小鼠眼眶取血，離心，分離血清；以生理鹽水1∶100稀釋后，取1ml稀釋液與5％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml、10％補(bǔ)體0.5ml(豚鼠血清，用雞紅細(xì)胞預(yù)先飽和6h)混勻；37℃孵育30min，冰水中終止反應(yīng)，另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管作對照；吸取各管上清液于UV-TU1810型分光光度計(jì)540nm處比色，測定各組溶血素形成情況，結(jié)果見表4。
6.厚樸花多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影響
取小鼠60只，體重18.5～23g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為6組。除空白對照組外，其余各組均建立環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型共5組(劑量為8mg/ml；第1、2、3天連續(xù)腹腔注射)；模型組建立完成后，各組小鼠(含空白組)均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫；并開始分別灌服厚樸花多糖水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混懸液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于最后1次給藥后2h，脫頸椎處死并解剖小鼠，取出脾臟，勻漿，并調(diào)整脾細(xì)胞混懸液中脾細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/ml。取脾細(xì)胞混懸液1.0ml，與0.2％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管，37℃孵育1h，離心，取上清液于UV-TU1810型分光光度計(jì)413nm處比色，測各組溶血空斑形成情況，結(jié)果見表4。
表4溶血素、溶血空斑形成結(jié)果
**表示與模型組比P＜0.01
從上表可看出，與空白對照組比，模型組溶血素和溶血空斑均顯著降低(P＜0.01)，說明造免疫抑制模型成功。與模型組比，各個(gè)劑量厚樸花多糖組及香菇多糖組均可顯著促進(jìn)小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)。其中，尤以0.2g/kg劑量厚樸花多糖組為最佳。
厚樸花低聚糖抗氧化活性實(shí)驗(yàn)
一、實(shí)驗(yàn)材料
(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用40只普通級昆明種小鼠，鼠齡2個(gè)月，體重(20±2)g，雌雄各半。由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號：SCXK(豫)2005-0001；使用許可證號：SCXK(豫)2005-0012)。
(2)實(shí)驗(yàn)試藥丙二醛(MDA)測定試劑盒，生化試劑，南京建成生物工程研究所；超氧化物岐化酶(SOD)測試盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽酶(GSH-PX)測試盒，南京建成生物工程研究所；本發(fā)明制備的厚樸花低聚糖(蒽酮-硫酸法測定厚樸花低聚糖中糖含量為86.4％)。
二、實(shí)驗(yàn)方法
(1)動(dòng)物的喂養(yǎng)與取樣取體重(20±2)g的昆明種小鼠40只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分成4組,每組10只。分別為空白組、厚樸花低聚糖低劑量組(100mg/kg)、厚樸花低聚糖中劑量組(200mg/kg)、厚樸花低聚糖高劑量組(400mg/kg)，連續(xù)15天口服給藥(空白對照組給等量純凈水)，每天小鼠給藥體積為0.2mL/10g。末次給藥后24h，處死動(dòng)物，分別取小鼠血清及制備10％肝組織勻漿，待測。
制備10％小鼠肝組織勻漿：取肝組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，稱0.5g，放入5mL～10mL的小燒杯內(nèi)，取總量(總量為4.5mL)2/3的生理鹽水于燒杯中，用眼科剪盡快剪碎組織塊，將剪碎的組織倒入勻漿管中，用剩余1/3的生理鹽水用來沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中，進(jìn)行勻漿，使組織勻漿化,將勻漿液離心(3000r/min，10min)，取適量上清液進(jìn)行以下測定。
血清制備：摘眼球取出血樣，37℃水浴30min加速血液凝固。血液凝固后用竹簽沿試管四周輕輕剝離血塊使血清盡快自行析出，然后2500r/min離心10min，用吸管吸出上層血清備用。
(2)檢測方法
蛋白質(zhì)含量測定：采用考馬斯亮蘭法。蛋白質(zhì)分子具有-NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白-NH3+基團(tuán)結(jié)合，致使溶液變藍(lán)，通過測定吸收度可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。具體操作詳見試劑盒說明書。SOD測定：采用黃嘌呤氧化酶法。血清中SOD活力以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽單位(NU)，即U/mL；組織中SOD活力以每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽，即U/mgprot。具體操作詳見試劑盒說明書。
GSH-Px測定：采用二硫?qū)ο趸郊姿岱y定，具體操作詳見試劑和說明書，血清單位為U/mL，組織單位為U/mgprot。
MDA測定：采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定，過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中MDA可與TBA縮合，形成的紅色產(chǎn)物在523nm處有最大吸收峰，因底物為TBA，所以此法稱TBA法。血清單位為nmol/mL，組織單位為nmol/mgprot。具體操作詳見試劑盒說明書。
表5厚樸花低聚糖對小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、MDA的影響
*表示與空白組相比P＜0.05，**表示與空白組比P＜0.01
從表5可以看出，與空白組比較，大劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性提高極顯著(P＜0.01)，MDA水平降低極顯著(P＜0.01)；中劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著增高(P＜0.05)，MDA水平降低極顯著(P＜0.01)；小劑量組肝組織中SOD活性顯著提高(P＜0.05)，MDA水平降低極顯著(P＜0.01)，但GSH-Px活性與空白組差異不顯著(P＞0.05)。
表6厚樸花低聚糖對小鼠血清中SOD、GSH-Px的影響
**表示與空白組比P＜0.01
從表6可見，與空白組相比，大、中劑量組的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性極顯著提高(P＜0.01)，小劑量組小鼠血清中SOD和GSH-Px活性差異無顯著性(P＞0.05)。
由上述資料可以看出，本發(fā)明提取的厚樸花多糖具有很好的增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，完全具備開發(fā)為免疫增強(qiáng)藥物、保健品和保健類食品的潛力及實(shí)際推廣價(jià)值；厚樸花低聚具有較好的抗氧化作用，可作為抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑開發(fā)，由于其抗氧化活性，也可加入美白化妝品中應(yīng)用。開發(fā)研究厚樸花低聚糖及多糖不僅拓寬中藥厚樸花應(yīng)用的新前景，更是緊隨時(shí)代步伐對中醫(yī)藥的創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值和巨大經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益，是中藥上創(chuàng)新。