本發(fā)明涉及食藥用真菌大分子多糖降解領(lǐng)域，具體的說是涉及一種猴頭菌活性多糖及其制備方法。
背景技術(shù)：
猴頭菌是一種著名的藥膳兩用食用菌，因其子實(shí)體形狀像猴子頭部而得名。猴頭菌多糖作為猴頭菌中最主要的活性成分之一，因具有抗?jié)?、抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、抗輻射、降血脂、增加心肌血液輸出量，加速肌體血液循環(huán)、提高免疫力等藥理功效。但是該猴頭菌多糖具有較大的特性粘度，特性粘度為1231.99mL/g，是目前所發(fā)現(xiàn)真菌類水溶性多糖中粘度較高的一種。而該多糖的特性粘度也成為影響猴頭菌多糖水溶性和生物活性的重要因素，如何解決這個(gè)問題，是目前研究猴頭菌多糖領(lǐng)域的重要課題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明首先提供了一種猴頭菌活性多糖的制備方法，該方法包括如下步驟：
(1)原料預(yù)處理：將猴頭菌多糖與水配成猴頭菌多糖水溶液；
(2)超聲降解：將步驟(1)中的猴頭菌多糖水溶液在冰浴條件下經(jīng)超聲處理后即為所需的猴頭菌活性多糖溶液；其中超聲時(shí)猴頭菌多糖溶液濃度為0.1—3g/L；超聲時(shí)間為10-50min；超聲作用強(qiáng)度為158.8-370.5W/cm2；
(3)冷凍干燥：將步驟(2)中的猴頭菌活性多糖溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得猴頭菌活性多糖；
其中所述的猴頭菌多糖是將猴頭菌子實(shí)體進(jìn)行熱水提取的方法得到的，分子量為239萬道爾頓；
具體的說所述的猴頭菌多糖是通過如下方法制備得到的：
取猴頭菌子實(shí)體鮮品1000g，加入2倍體積的蒸餾水，100℃提取2h，提取2次，合并提取液，濃縮到可溶性固形物含量5°Brix，15317×g離心15min，上清液在4℃靜置12h，15317×g離心15min，收集沉淀；沉淀用20％(v/v)的乙醇洗滌4-5次，離心收集沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，凍干，獲得猴頭菌多糖；該猴頭菌多糖的分子量為239萬道爾頓。
本發(fā)明的制備猴頭菌活性多糖的方法操作簡(jiǎn)便，猴頭菌多糖分子量可以從239萬道爾頓降解到20-50萬道爾頓，且降解后的猴頭菌多糖粘度小，溶解性好，對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞株釋放NO有明顯的促進(jìn)作用，體外免疫活性好。
具體實(shí)施方式
猴頭菌多糖的制備
本發(fā)明使用的猴頭菌由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌所(上海國森生物科技有限公司栽培,菌株編號(hào):H0605)提供；
本發(fā)明使用的透析袋購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；
本發(fā)明所使用的超聲儀型號(hào)為VCX1500購于SONICS公司。
取成熟期猴頭菌子實(shí)體鮮品1000g，加入2倍體積的蒸餾水，100℃提取2h，提取2次，合并提取液，濃縮到可溶性固形物含量5°Brix，15317×g離心15min，上清液在4℃靜置12h，15317×g離心15min，收集沉淀。沉淀用20％(v/v)的乙醇洗滌4-5次，離心收集沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，凍干，獲得猴頭菌多糖，該猴頭菌多糖的分子量為239萬道爾頓。將應(yīng)用到下列實(shí)施例1-4中用于制備猴頭菌活性多糖。
實(shí)施例1
(1)原料預(yù)處理：先將猴頭菌多糖用蒸餾水配成3g/L濃度的水溶液，進(jìn)行充分溶解；
(2)超聲降解：將步驟(1)中的猴頭菌多糖水溶液在冰浴條件下，超聲作用強(qiáng)度為264.7W/cm2，超聲時(shí)間為10min，對(duì)猴頭菌多糖溶液進(jìn)行超聲處理，即得猴頭菌活性多糖溶液；
(3)冷凍干燥：將步驟(2)中的猴頭菌活性多糖溶液用3500Da的透析袋流動(dòng)蒸餾水透析72h進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得猴頭菌活性多糖。
分子量測(cè)定：采用HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用分析多糖分子量分布
儀器：Waters e2695高效液相(2414示差折光檢測(cè)器、DAWN8+激光檢測(cè)器)；色譜柱：TSK PWXL6000和TSK PWXL4000串聯(lián)；條件設(shè)置：流速0.5mL/min，色譜柱溫用柱溫箱恒定在35℃，激光檢測(cè)器光源波長選用623.8nm，多糖在溶液中的折光指數(shù)增量(dn/dc)按照0.146mL/g計(jì)算，普魯蘭shodex standard p-82為標(biāo)準(zhǔn)品(Shodex,Japan)。樣品制備及處理：樣品置于流動(dòng)相中，配成3mg/mL的溶液并經(jīng)0.22μm的水相微孔膜過濾后供進(jìn)樣分析。經(jīng)測(cè)定猴頭菌活性多糖的分子量為46.61萬道爾頓。
實(shí)施例2
(1)原料預(yù)處理：先將猴頭菌多糖用蒸餾水配置成1g/L的多糖溶液，進(jìn)行充分溶解；
(2)超聲降解：將步驟(1)中的猴頭菌多糖水溶液在冰浴條件下設(shè)定超聲作用強(qiáng)度為264.7W/cm2，超聲處理30min，即得猴頭菌活性多糖溶液；
(3)冷凍干燥：將步驟(2)中的猴頭菌活性多糖溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得猴頭菌活性多糖。
分子量測(cè)定：方法同上
經(jīng)測(cè)定猴頭菌活性多糖分子量為33.38萬道爾頓。
實(shí)施例3
(1)原料預(yù)處理：先將猴頭菌多糖用蒸餾水配置成1.5g/L的多糖溶液，進(jìn)行充分溶解；
(2)超聲降解：將步驟(1)中的猴頭菌多糖水溶液在冰浴條件下設(shè)定超聲作用時(shí)間為30min，超聲作用強(qiáng)度為264.7W/cm2對(duì)猴頭菌多糖溶液進(jìn)行超聲處理，即得降解的猴頭菌活性多糖溶液；
(3)冷凍干燥：將步驟(2)中的猴頭菌活性多糖溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得猴頭菌活性多糖。
分子量測(cè)定：方法同上
經(jīng)測(cè)定猴頭菌活性多糖的分子量為28.22萬道爾頓。
實(shí)施例4
(1)原料預(yù)處理：先將猴頭菌多糖用蒸餾水配置成1g/L的多糖溶液，進(jìn)行充分溶脹；
(2)超聲降解：將步驟(1)中的猴頭菌多糖水溶液在冰浴條件下設(shè)定超聲作用時(shí)間為30min，超聲作用強(qiáng)度為370.5W/cm2對(duì)猴頭菌多糖溶液進(jìn)行超聲處理，即得猴頭菌活性多糖溶液；
(3)冷凍干燥：將步驟(2)中的猴頭菌活性多糖溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得猴頭菌活性多糖。
分子量測(cè)定：方法同上
經(jīng)測(cè)定猴頭菌活性多糖的分子量為23.33萬道爾頓。
體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性測(cè)定
實(shí)施例5
供試樣品的配制：稱取實(shí)施例1-4中制備得到的猴頭菌活性多糖于滅菌的eppendorf管中，用無菌的PBS配置成濃度5mg/mL的溶液。充分溶解后以15000r/min離心30min，無菌條件下轉(zhuǎn)移至新的無菌eppendorf管中，將樣品終濃度稀釋至500、200、50μg/ml待用。
小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的制備：取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞株(購自中科院細(xì)胞所)，用DMEM完全培養(yǎng)基(購自Gibco公司)在37℃、含5％CO2條件下傳代培養(yǎng)，用0.05％胰酶消化，混懸液于1000rpm/min離心3min后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)備用。
試劑配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
Griess試劑的配制：在燒杯中加入6.25ml H3PO3，加入蒸餾水250ml，分別加入2.5g的sulfanilamide(4-氨基苯磺酰胺，Sigma公司)和0.25g的naphthylethylenediaminedihydrochloride(鹽酸萘乙二胺，Sigma公司)用磁力攪拌器攪拌至全部溶解，置于棕色試劑瓶4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共九個(gè)；取100μL于96孔板孔，加入50μL Griess試劑，測(cè)定543nm吸光值，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品刺激巨噬細(xì)胞釋放NO量的測(cè)定：收集RAW264.7細(xì)胞，用無色RPMI1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清+1％抗生素液體)將細(xì)胞稀釋至5×105/mL，加入96孔板，每孔加入180μL，然后再加入20μL待測(cè)樣品，使得樣品終濃度依次為500μg/ml，200μg/ml和50μg/ml，陽性對(duì)照為LPS(終濃度為1μg/mL)，陰性對(duì)照為PBS，于37℃、含5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，取100μL上清于96孔板孔，加入50μl Griess試劑，室溫孵浴10min，測(cè)定543nm吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞NO的釋放量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
實(shí)施例1-4中制備的猴頭菌活性多糖，其刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO(單位：μmoL/5.0×105cells)的量如表1所示。
表1猴頭菌活性多糖在不同濃度下刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的量
由表1可知，猴頭菌活性多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞株釋放NO有明顯的促進(jìn)作用，且分子量分布為28.22萬道爾頓的活性提高最為明顯，體外免疫活性顯著增強(qiáng)。