本發(fā)明涉及一種抗胃癌活性蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-甲基丙烯酸(MAA)/丙烯酸丁酯(BA)的合成方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著人們環(huán)保意識(shí)的提高和綠色化學(xué)的發(fā)展，使得人們開(kāi)始對(duì)可循環(huán)使用的自然資源如麥稈、甘蔗、玉米芯等農(nóng)林廢棄物的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行更深入的研究，擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。其中，從甘蔗渣中提取的木聚糖是一類以生物質(zhì)為基礎(chǔ)的高分子碳水化合物，具有抗癌、抗HIV、抗凝血等生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，為了進(jìn)一步提高蔗渣木聚糖的抗癌活性，需要對(duì)蔗渣木聚糖進(jìn)行化學(xué)改性。

沒(méi)食子酸及其酯化衍生物具有抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等作用，尤其是沒(méi)食子酸酯化衍生物能夠通過(guò)抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散來(lái)降低病毒細(xì)胞的毒性。因此，若將沒(méi)食子酸與蔗渣木聚糖進(jìn)行酯化，能夠結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)，強(qiáng)化提高蔗渣木聚糖酯化衍生物的抗癌活性，但單酯化的蔗渣木聚糖衍生物仍存在抗癌活性低、針對(duì)性弱等缺陷。含有乙烯基團(tuán)的接枝單體能更好的改善接枝聚合物的性能，因而考慮在蔗渣木聚糖單酯化的基礎(chǔ)上引入甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸丁酯(BA)接枝單體，通過(guò)引發(fā)劑的作用，將目標(biāo)單體接枝到蔗渣木聚糖的主鏈上來(lái)進(jìn)一步拓展蔗渣木聚糖的抗癌活性。

本發(fā)明以蔗渣木聚糖為原料，沒(méi)食子酸為酯化劑首先合成了蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯；然后以過(guò)硫酸銨為引發(fā)劑，MAA、BA為接枝單體制備出具有抗胃癌活性的最終產(chǎn)物蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了增強(qiáng)木聚糖衍生物的抗胃癌活性，提供一種蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA的制備方法。

本發(fā)明的具體步驟為：

(1)將蔗渣木聚糖置于60℃真空干燥箱中干燥至恒重，得干基蔗渣木聚糖。

(2)取15～20g沒(méi)食子酸加入250mL的四口燒瓶中，并向其中加入20～40mL分析純醋酸酐和0.5～1.5mL分析純吡啶，在5～20℃下反應(yīng)5～13小時(shí)。

(3)將步驟(2)所得物料倒入燒杯中，并在玻璃棒攪拌下向其中加入5～10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～20％的硫酸溶液直至有晶體析出。

(4)抽濾步驟(3)所得物料，將抽濾物倒入燒杯中，并在玻璃棒攪拌下向其中加入30～50mL飽和碳酸氫鈉溶液。

(5)向步驟(4)所得物料體系中加入5～10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％～30％的鹽酸溶液，靜置3～6小時(shí)。

(6)抽濾步驟(5)所得產(chǎn)物，并分別用10～20mL蒸餾水洗滌沉淀3次后送至50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，得三乙酰沒(méi)食子酸。

(7)取5～12g步驟(6)所得三乙酰沒(méi)食子酸加入到250mL的四口燒瓶中，并向其中加入8～12mL分析純氯化亞砜和0.2～0.5mL分析純N,N–二甲基甲酰胺，在50～60℃的條件下反應(yīng)3～5小時(shí)。

(8)將步驟(7)所得物料在溫度為70～85℃的條件下蒸發(fā)濃縮20～60分鐘得三乙酰沒(méi)食子酰氯溶液。

(9)稱取1.0～3.0g步驟(1)所得干基蔗渣木聚糖加入到步驟(8)所得的三乙酰沒(méi)食子酰氯溶液中，依次再加入30～40mL分析純N,N–二甲基甲酰胺和0.4～0.6mL分析純?nèi)野?，?0～55℃的條件下反應(yīng)3～8小時(shí)。

(10)抽濾步驟(9)所得物料，并分別用10～20mL分析純無(wú)水乙醇、10～20mL分析純丙酮各洗滌2次，得蔗渣木聚糖三乙酰沒(méi)食子酸酯。

(11)將步驟(10)所得蔗渣木聚糖三乙酰沒(méi)食子酸酯加入燒杯中，攪拌下加入30～50mL碳酸氫鈉的無(wú)水乙醇飽和溶液，常溫下攪拌10～20分鐘，直至溶液的pH不再發(fā)生變化。

(12)抽濾步驟(11)所得溶液得固體沉淀物，分別用10～20mL蒸餾水洗滌沉淀物3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯。

(13)將20～30mL蒸餾水加入到250mL四口燒瓶中，加入0.5～1.0g蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯，在35～55℃下充分?jǐn)嚢?0～40分鐘，開(kāi)始向反應(yīng)體系中加入3～6mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的過(guò)硫酸銨引發(fā)劑。

(14)向步驟(13)所得溶液中分別加入0.1～0.3g分析純接枝單體MAA、0.3～0.4g分析純接枝單體BA，反應(yīng)7～9小時(shí)。

(15)抽濾步驟(14)的懸浮液得粗產(chǎn)物，經(jīng)10～20mL蒸餾水洗滌3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得最終產(chǎn)物蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA。

(16)采用酸堿滴定法對(duì)步驟(15)所得產(chǎn)物進(jìn)行沒(méi)食子酸酯化取代度測(cè)定，具體方法及步驟如下：準(zhǔn)確稱取約0.5g樣品置入50mL錐形瓶中，加入10mL蒸餾水，搖勻，加入2滴5％的酚酞指示劑，用濃度為0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淺紅色(30s內(nèi)不會(huì)褪色)。再用移液管加入2.5mL濃度為0.5mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，密封，在室溫下震蕩皂化4小時(shí)。之后用濃度為0.5mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至無(wú)色，即為滴定終點(diǎn)。沒(méi)食子酸酯化取代度(DS_C)的計(jì)算式如下：

式中：

w——蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA中含有沒(méi)食子?；馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)，％；

V₀——滴定蔗渣木聚糖消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位mL；

V₁——滴定沒(méi)食子酸蔗渣木聚糖酯消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位mL；

C_HCl——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位mol/L；

m——沒(méi)食子酸蔗渣木聚糖酯樣品的質(zhì)量，單位g；

170和132——沒(méi)食子?；驼嵩揪厶敲撍咎菃卧南鄬?duì)分子質(zhì)量。

(17)測(cè)定產(chǎn)物蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA中單體的接枝率和接枝效率，具體方法和步驟如下：將蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA用分析純丙酮沉淀后，分別用分析純無(wú)水乙醇10～20mL洗滌2～3次，在55℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到接枝共聚粗產(chǎn)物。然后，在索氏提取器中用分析純丙酮作為溶劑將粗產(chǎn)物抽提24小時(shí)，除去均聚物后得到純化的接枝共聚物。接枝率和接枝效率的計(jì)算方法如下：

式中：G——接枝率，％；

GE——接枝效率，％；

W₀——蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA，單位g；

W₁——單體的質(zhì)量，單位g；

W₂——接枝支鏈的質(zhì)量，單位g。

(18)以人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-H460)、人胃癌細(xì)胞(MGC80-3)、人肝癌細(xì)胞(BEL-7407)為研究對(duì)象，對(duì)原蔗渣木聚糖和步驟(15)中所得產(chǎn)物的抗癌活性抑制率進(jìn)行計(jì)算，抑制率的計(jì)算方法如下：

抑制率＝1-RCR％

本發(fā)明對(duì)合成的最終產(chǎn)物蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA進(jìn)行了抗腫瘤活性研究，測(cè)定了原蔗渣木聚糖和蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA對(duì)BEL-7407癌細(xì)胞株的抑制率。本發(fā)明所得目標(biāo)產(chǎn)物與原蔗渣木聚糖相比能更有效的抑制BEL-7407癌細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)散，提高了抗胃癌活性。

附圖說(shuō)明

圖1為蔗渣木聚糖的SEM照片。

圖2為蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA的SEM照片。

圖3為原蔗渣木聚糖與蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA的IR圖。

圖4為原蔗渣木聚糖的XRD圖。

圖5為蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA的XRD圖。

圖6為原蔗渣木聚糖的TG及DTG曲線。

圖7為蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA的TG及DTG曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：

(1)將蔗渣木聚糖置于60℃真空干燥箱中干燥至恒重，得干基蔗渣木聚糖。

(2)取17g沒(méi)食子酸加入250mL的四口燒瓶中，并向其中加入40mL分析純醋酸酐和1.0mL分析純吡啶，在5～20℃下反應(yīng)10小時(shí)。

(3)將步驟(2)所得物料倒入燒杯中，并在玻璃棒攪拌下向其中加入8.3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的硫酸溶液至有晶體析出。

(4)抽濾步驟(3)所得物料，將抽濾物倒入燒杯中，并在玻璃棒攪拌下向其中加入45mL飽和碳酸氫鈉溶液。

(5)向步驟(4)所得物料體系中加入6.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的鹽酸溶液，靜置5小時(shí)。

(6)抽濾步驟(5)所得產(chǎn)物，并分別用20mL蒸餾水洗滌沉淀3次后送至50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，得三乙酰沒(méi)食子酸。

(7)取10g步驟(6)所得三乙酰沒(méi)食子酸加入到250mL的四口燒瓶中，并向其中加入10mL分析純氯化亞砜和0.3mL分析純N,N–二甲基甲酰胺，在60℃的條件下反應(yīng)3小時(shí)。

(8)將步驟(7)所得物料在溫度為85℃的條件下蒸發(fā)濃縮40分鐘得三乙酰沒(méi)食子酰氯溶液。

(9)稱取1.0g步驟(1)所得干基蔗渣木聚糖加入到步驟(8)所得的三乙酰沒(méi)食子酰氯溶液中，依次再加入30mL分析純N,N–二甲基甲酰胺和0.5mL分析純?nèi)野罚?5℃的條件下反應(yīng)4小時(shí)。

(10)抽濾步驟(9)所得物料，并分別用20mL分析純無(wú)水乙醇、20mL分析純丙酮溶液各洗滌2次，得蔗渣木聚糖三乙酰沒(méi)食子酸酯。

(11)將步驟(10)所得蔗渣木聚糖三乙酰沒(méi)食子酸酯加入燒杯中，攪拌下加入30mL碳酸氫鈉的無(wú)水乙醇飽和溶液，常溫下攪拌20分鐘至溶液的pH不再發(fā)生變化。

(12)抽濾步驟(11)所得溶液得固體沉淀物，分別用20mL蒸餾水洗滌沉淀物3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯。

(13)將20mL蒸餾水加入到250mL四口燒瓶中，加入1.0g蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯，在50℃下充分?jǐn)嚢?0分鐘，開(kāi)始向反應(yīng)體系中加入4.8mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的過(guò)硫酸銨引發(fā)劑。

(14)向步驟(13)所得溶液中分別加入0.2g接枝單體MAA、0.35g分析純接枝單體BA，反應(yīng)8小時(shí)。

(15)抽濾步驟(14)的懸浮液得粗產(chǎn)物，經(jīng)10～20mL蒸餾水洗滌3次后送入50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，即得最終產(chǎn)物蔗渣木聚糖沒(méi)食子酸酯-g-MAA/BA。

(16)采用酸堿滴定法對(duì)步驟(15)所得產(chǎn)物進(jìn)行沒(méi)食子酸酯化取代度測(cè)定，得其取代度為0.64。

(17)測(cè)定步驟(15)所得產(chǎn)物中單體接枝率為29％，接枝效率為75％。

(18)測(cè)定得到原蔗渣木聚糖和步驟(15)所得產(chǎn)物溶液對(duì)人肝癌細(xì)胞(BEL-7407)抑制率，分別為0.36％～1.78％和26.01％～28.83％。

產(chǎn)品經(jīng)IR分析酯化接枝改性后的產(chǎn)物在1725.50cm^-1出現(xiàn)新的特征吸收峰，在2921.30^-1處C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰大大加強(qiáng)，在1466.12cm^-1和1110.84cm^-1處也出現(xiàn)了新的特征峰。經(jīng)XRD分析酯化接枝改性后產(chǎn)物的X射線粉末圖，在粉末角為20°、23°、25°、27°、33°、35°等處出現(xiàn)衍射峰。經(jīng)掃描電鏡分析，改性后的顆粒呈扁平狀，顆粒表面出現(xiàn)很多參差不平的溝壑，散開(kāi)，不緊湊，顆粒破損比較嚴(yán)重。分析交聯(lián)沒(méi)食子酸蔗渣木聚糖酯的TG-DTG曲線，顯示在前100℃只有由于溶劑丙酮和水的殘留，在100～250℃之間沒(méi)有變化；在250～450℃之間DTG曲線出現(xiàn)較大的峰，400℃之后質(zhì)量變化不大，說(shuō)明此時(shí)交聯(lián)沒(méi)食子酸蔗渣木聚糖酯已基本完成分解；在700～750℃再次分解。