本發(fā)明涉及微生物學(xué)及生物納米硒制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用地衣芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硒(Selenium,Se)元素是許多有機體必需的微量元素之一，是生物體內(nèi)硫氧還原蛋白酶、脫碘酶、谷胱甘肽過氧化酶等多種含硒酶蛋白的必需組分，并且參與人體多種代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)，人體缺硒會導(dǎo)致多種疾病，并且增加患癌風(fēng)險。我國具有豐富硒資源，但硒在自然界分布極不均勻，導(dǎo)致我國三分之二以上地區(qū)缺硒。中國營養(yǎng)學(xué)會及FAO/WHO/IAEA聯(lián)合專家委員會確定人體硒攝入量適宜范圍為60-250μg/d，安全劑量為400μg/d，中毒劑量為800μg/d。硒過量也會造成人體危害。因此亟待為缺硒人群開發(fā)安全高效硒源。自然界中硒形態(tài)包括負二價、零價、四價及六價四種形態(tài)，研究表明，負二價、四價及六價形態(tài)的硒毒性巨大，作為補硒源具有潛在危險；塊狀零價單質(zhì)硒不具有生物學(xué)活性，而納米級別的單質(zhì)硒具有顯著生物學(xué)活性，并且能顯著抑制腫瘤，因此開發(fā)納米硒作為補硒源具有明顯優(yōu)勢。

國內(nèi)外研究人員對微生物參與的硒的各價態(tài)間的轉(zhuǎn)化及有機硒的形成有較明確的認識。相對于化學(xué)或物理方法制備單質(zhì)納米硒過程中的高能耗高污染，通過微生物對無機硒轉(zhuǎn)化，可得到更為簡便、經(jīng)濟、綠色環(huán)保獲取單質(zhì)納米硒的方法。近十年來，發(fā)現(xiàn)許多細菌可以耐受高濃度的硒鹽，并轉(zhuǎn)化硒鹽為低毒的紅色單質(zhì)納米硒。涵蓋的種屬極其豐富，已有報道約30個屬，包括大腸桿菌(Escherichia coli)、莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等，總體上它們屬于變形菌門和厚壁菌門。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用地衣芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從土壤中分離得到一株可耐受較高濃度亞硒酸鹽、硒酸鹽的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)S13，菌株S13現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC No.11742，保藏日期2015年11月26日。

地衣芽孢桿菌S13為芽孢桿菌目、芽孢桿菌科，革蘭氏陽性菌，棒狀，內(nèi)生孢子，廣泛存在于土壤中。地衣芽孢桿菌能夠促進腸道內(nèi)正常生理性厭氧菌的生長，調(diào)整腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)腸道功能；對腸道細菌感染具有特效，對輕型或重型急性腸炎，輕型及普通型的急性菌痢等，均有明顯療效；能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抑制致病菌的生長繁殖。在水產(chǎn)養(yǎng)殖、飼料添加以及醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明還提供含有所述地衣芽孢桿菌S13的復(fù)合微生物菌劑。

本發(fā)明還提供利用所述地衣芽孢桿菌S13生物合成納米硒的方法，所述方法是向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加亞硒酸鹽和/或硒酸鹽，發(fā)酵培養(yǎng)地衣芽孢桿菌S13，并從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化納米硒。所述發(fā)酵產(chǎn)物包括發(fā)酵液經(jīng)離心所得菌體沉淀，菌懸液以及菌體裂解液。

本發(fā)明所述亞硒酸鹽、硒酸鹽包括亞硒酸/硒酸的鈉鹽、鉀鹽等無機鹽。優(yōu)選亞硒酸鈉、硒酸鈉。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鹽的濃度為0.001-70mM，優(yōu)選1-3mM，更優(yōu)選3mM；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中硒酸鹽的濃度為0.001-600mM，優(yōu)選0.1-500mM，更優(yōu)選1-150mM。

本發(fā)明提供的利用地衣芽孢桿菌S13生物合成納米硒的方法，包括以下步驟：

S1、菌種活化

用SOC培養(yǎng)基對菌株進行活化培養(yǎng)，SOC培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，氯化鉀2.5mM，氯化鎂10mM，葡萄糖20mM，瓊脂15g/L，pH 7.0-7.2；將菌株S13接種于SOC培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)48小時；

S2、種子液的制備

種子培養(yǎng)用SOB液體培養(yǎng)基，SOB液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，氯化鉀2.5mM，氯化鎂10mM，pH 7.0-7.2；將活化好的菌株S13用無菌生理鹽水配制成10⁸CFU/mL的菌懸液，以1％的接種量接種于SOB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)時間為24-36h；

S3、發(fā)酵罐發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)采用TB發(fā)酵培養(yǎng)基，TB發(fā)酵培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10-15g/L，酵母提取物8-15g/L，甘油4-6ml/L，KH₂PO₄ 2-5g/L，K₂HPO₄ 15-20g/L，亞硒酸鹽3mM，pH 7.0；控制培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的60-80％，將種子液按照2-4％的接種量接入發(fā)酵罐，控制發(fā)酵溫度為35-38℃，攪拌速度為160-260rpm，通氣量為1：0.4-0.8，罐壓1.3-1.7F/cm²，發(fā)酵80-120小時；

S4、從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化納米硒。

從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化生物納米硒的方法如下：

方案I：

發(fā)酵液下罐，4500-12000rpm離心10-20min收集菌體沉淀，用無菌生理鹽水4500-12000rpm離心10-20min清洗2-3遍，并用發(fā)酵液1/10體積的水(優(yōu)選無菌純凈水)重懸沉淀，所得菌懸液經(jīng)冷凍干燥，即得納米硒干粉。

方案II：

a、發(fā)酵液下罐，將發(fā)酵液置于冰上進行超聲破碎細胞，設(shè)置變幅桿為Φ10，占空比40-80％，功率500-800W，頻率20KHz，啟停間隔5-10s，破碎30-40min，得到菌體裂解液；

b、菌體裂解液于4000-10000rpm離心10-30min，所得沉淀用無菌生理鹽水4000-10000rpm離心20-30min清洗3-5遍；將沉淀重懸于發(fā)酵液1/2體積的水(優(yōu)選無菌純凈水)中，得到納米硒懸液；

c、將納米硒懸液轉(zhuǎn)移至萃取塔中，按照發(fā)酵液0.4-0.7倍體積的量加入正己烷萃取3-6次，收集下層水相，冷凍干燥，即得納米硒干粉；

d、獲得高純度、分散性較好生物納米硒懸液。

冷凍干燥與生物納米硒制備：將方案I中制備的生物納米硒，用液氮冷凍10-15min，放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強20-100Pa，加熱板溫度為20-35℃，樣品厚度為10-25mm；干燥時間在48-72小時，得到生物納米硒干粉A。

將方案II中制備的生物納米硒，用液氮冷凍1015min，放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強20-65Pa，加熱板溫度為20-25℃，樣品厚度為10-14mm；干燥時間在36-48小時，得到純生物納米硒干粉B。

本發(fā)明還提供由所述地衣芽孢桿菌S13發(fā)酵制備的生物納米硒。其中，所述生物納米硒的粒徑為50-300nm，主要粒徑為150-200nm。

本發(fā)明進一步提供由所述地衣芽孢桿菌S13生物合成的納米硒在制備食品、保健品、藥品、畜禽飼料以及農(nóng)用肥料中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供由所述生物納米硒制備的富硒功能食品、富硒保健品和硒藥片以及富硒飼料、富硒肥料。其中，生物納米硒所占含量分別為10-2500μg/kg、10-500mg/kg、50-800mg/kg、50-800μg/kg和1-5g/kg。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，將生物納米硒干粉A和B分別懸浮于純凈水中，配制成1-5g/L的富硒肥料A和富硒肥料B。將肥料A和B用于小麥、水稻、玉米等糧食作物種植，用于大豆、花生、谷子、紅薯等雜糧的種植，并在金針菇、香菇、木耳等食用菌養(yǎng)殖中施用，用于番茄、茄子、黃瓜等蔬菜的種植，以及用于蘋果、獼猴桃等水果和茶葉種植中，獲得可再加工的富硒作物、富硒食用菌、富硒水果、富硒茶葉。

在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，將生物納米硒干粉A或B按照50-800μg/kg比例與飼料原料混合均勻，配制成富硒飼料A和富硒飼料B。將飼料A和B飼喂蛋雞、肉雞、豬、羊、牛等畜禽后，獲得可再加工的富硒雞蛋、富硒雞肉、富硒豬肉、富硒羊肉、富硒牛肉。

在本發(fā)明的又一個具體實施方式中，將生物納米硒干粉B按照10-2500μg/kg的比例與小米面粉、植物油和純凈水(三者的重量百分比為55％、10％和35％)混合均勻，投入膨化機中擠壓膨化，烘干裝袋，獲得膨化小米富硒功能食品?；蛘?，將小米面粉替換為玉米粉、蕎麥粉或豆粉，可獲得膨化玉米、蕎麥或豆粉富硒功能食品。

在本發(fā)明的再一個具體實施方式中，將生物納米硒干粉B(10-500mg/Kg)與淀粉(972.50-999.99g/Kg)、維生素E(0-22g/Kg)和β胡蘿卜素(0-5g/Kg)混合均勻，加入潤濕劑，在制粒機中制成微粒，將微粒烘干并填充到膠囊殼中，控制每粒膠囊重0.3-0.6g，按100粒每瓶裝瓶，封口包裝入庫。

將生物納米硒干粉B(50-800mg/Kg)與淀粉和植物蛋白粉(淀粉和植物蛋白粉的重量比為95：4.9)混合均勻，將粘合劑HPMC加入到上述混合物中，在混合機中攪拌均勻，將原料投入壓片機中開車壓片，烘干，每粒片重0.4-0.6g，按100粒每瓶裝瓶，封口包裝入庫。

本發(fā)明對納米硒合成菌--地衣芽孢桿菌S13生物合成納米硒的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，對亞硒酸鹽、硒酸鹽的耐受范圍，對不同濃度亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化效率，不同時間點的轉(zhuǎn)化效率變化，以及對其生長曲線、致病性、發(fā)酵工藝、納米硒分離純化技術(shù)等進行研究，探索出可進行工廠化生產(chǎn)生物納米硒的一套技術(shù)。為獲得可進行再加工的富硒產(chǎn)品，本發(fā)明還進行了純化后生物納米硒的深加工研究，開發(fā)出了富硒肥料、富硒飼料、富硒功能食品、富硒保健品以及硒藥片等。

本發(fā)明利用地衣芽孢桿菌S13合成生物納米硒，對生物納米硒進行分離純化，大量制備生物納米硒，并在肥料、飼料、富硒功能食品加工、保健品及醫(yī)藥產(chǎn)品中應(yīng)用。采用生物發(fā)酵工藝制備納米硒，具有環(huán)境友好，產(chǎn)率高，安全高效等特點，生產(chǎn)獲得的生物納米硒用于富硒肥料、富硒飼料，施肥或飼喂后，作物、瓜果、蔬菜、肉蛋奶富硒效果顯著。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中菌株S13系統(tǒng)進化樹，A為16S rRNA基因進化樹，B為gyrB基因進化樹。

圖2為本發(fā)明實施例2中菌株S13對不同濃度亞硒酸鈉的耐受性。

圖3為本發(fā)明實施例3中菌株S13對不同濃度硒酸鹽的耐受性。

圖4為本發(fā)明實施例4中菌株S13在不同亞硒酸鹽濃度下的納米硒產(chǎn)量(A)及對應(yīng)濃度下的轉(zhuǎn)化率(B)。

圖5為本發(fā)明實施例5中菌株S13在3mM亞硒酸鹽存在時，不同時間點的納米硒產(chǎn)量(A)及對應(yīng)時間點的轉(zhuǎn)化效率(B)。

圖6為本發(fā)明實施例6中培養(yǎng)基中添加3mM亞硒酸鹽時，S13透射電子顯微鏡(TEM)照片(A)和生物納米硒能譜(EDX)分析圖(B)；其中，B是對A圖中箭頭所指顆粒進行分析的結(jié)果。

圖7為本發(fā)明實施例7中地衣芽孢桿菌S13轉(zhuǎn)化生成的納米硒顆粒純化后透射電子顯微鏡(TEM)照片。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

以下實施例中所述亞硒酸鹽是指亞硒酸鈉，所述硒酸鹽是指硒酸鈉。

實施例1地衣芽孢桿菌S13的分離純化及鑒定

1、菌株S13的分離純化

從土壤中分離得到一株可耐受較高濃度亞硒酸鹽、硒酸鹽的菌株S13。

2、菌株S13的鑒定

1.2.1 PCR擴增16S rRNA、gyrB基因序列并測序：

將菌株S13接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，取0.2mL滅菌PCR管，加入10μL ddH₂O，無菌牙簽挑取單個菌落到PCR管中攪拌混勻。

1.2.2構(gòu)建PCR反應(yīng)體系：

16S rRNA：以8F(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)及1506R(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)為引物，PCR擴增獲得16S rRNA基因序列。PCR反應(yīng)體系為：ddH₂O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL，dNTP Mix，2μL；引物8F，0.5μL；引物1506R，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq DNA聚合酶，0.5μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃10min；94℃40s，56℃40s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

gyrB：以gyrB UP-1Sf(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’)及gyrB UP-1Sr(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’)為引物，PCR擴增獲得gyrB基因序列。PCR反應(yīng)體系為：ddH₂O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL；Dntp Mix，2μL；引物gyrB UP-1Sf，0.5μL；引物gyrB UP-1Sr，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq DNA聚合酶，0.5μL；

PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃1min，55～62℃1min，72℃2min，共30個循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

將PCR擴增獲得的DNA片段進行純化，并測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件拼接。測得16S rRNA基因序列見SEQ ID NO:1，gyrB基因序列見SEQ ID NO:2。將測得的16S rRNA基因序列登錄GenBank，獲得的登錄號為KX812811，并應(yīng)用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.blm.nih.gov/blast.cgi)中已有細菌的16S rRNA基因、gyrB基因序列進行相似性比較分析，結(jié)果顯示S13菌株16S rRNA基因序列與Bacillus licheniformis ATCC14579的一致性達到100％，gyrB基因序列與Bacillus licheniformis ATCC14580一致性達到99％。S13菌株16S rRNA基因進化樹見圖1A，gyrB基因進化樹見圖1B。由此確定S13菌株為地衣芽孢桿菌。

實施例2地衣芽孢桿菌S13對亞硒酸鹽的耐受濃度

制備固體LB不同濃度含硒培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂15g，去離子水1L)，121℃高壓滅菌20min；配制亞硒酸鹽母液，過濾滅菌，加入亞硒酸鹽溶液，使培養(yǎng)基中亞硒酸鹽含量分別為0mM、10mM、25mM、35mM、55mM、70mM、80mM。

將S13菌株挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中搖培8h(150rpm，37℃)，取上述菌液，稀釋為OD₆₀₀＝0.8的母液備用；將母液分別稀釋至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，分別在含硒平板上滴加2.5μL不同濃度的菌液，每個濃度6個重復(fù)，37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落生長及顏色變化。

結(jié)果見圖2，可知10mM、25mM、35mM亞硒酸鹽對地衣芽孢桿菌生長沒有明顯抑制作用并能合成納米硒；55mM亞硒酸鹽存在時，地衣芽孢桿菌S13仍能很好生長并合成納米硒；70mM亞硒酸鹽存在時，地衣芽孢桿菌S13仍能夠較好的生長。由此得到地衣芽孢桿菌S13對亞硒酸鹽耐受濃度范圍為0-70mM。

實施例3地衣芽孢桿菌S13對硒酸鹽的耐受濃度

制備固體LB不同濃度含硒培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂15g，去離子水1L)，121℃高壓滅菌20min；配制硒酸鹽母液，過濾滅菌，加入硒酸鹽溶液，使培養(yǎng)基中硒酸鹽含量分別0mM、50mM、100mM、150mM、、400mM、500Mm、600mM。

將S13菌株挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中搖培8h(150rpm，37℃)，取上述菌液，稀釋為OD₆₀₀＝0.8的母液，再將母液稀釋至10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，分別在不同濃度的含硒平板上滴加菌液，每個濃度3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落生長及顏色變化。

結(jié)果見圖3，可知50mM硒酸鹽對地衣芽孢桿菌生長不受影響；100mM、150mM、400mM、500mM硒酸鹽存在時，地衣芽孢桿菌S13生長能較好生長并且合成納米硒；600mM硒酸鹽存在時，地衣芽孢桿菌S13仍能存活且產(chǎn)生納米硒，由此得到地衣芽孢桿菌S13對硒酸鹽耐受濃度范圍為0-600mM。

實施例4地衣芽孢桿菌S13對生物納米硒的合成效率

制備不同濃度含硒液體LB培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min；配制亞硒酸鹽母液，過濾滅菌，加入亞硒酸鹽溶液，使培養(yǎng)基中亞硒酸鹽含量分別為1mM、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、20mM，每個濃度梯度3個重復(fù)。

將S13菌株挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中搖培8h(150rpm，37℃)，取上述菌液，稀釋至OD₆₀₀＝0.8；將稀釋好的菌液按照0.1％接種量接種于LB培養(yǎng)基(含有亞硒酸鹽)中，搖培48小時。

用蒸餾水配置1M的Na₂S溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)；將發(fā)酵液6000-12000rprn離心8-15min，去上清，清洗3-5次，然后加入與原發(fā)酵液體積比為1：2的1M Na₂S溶液，混勻后充分反應(yīng)1h，再6000-12000rprn離心5-8min；然后取上清液在500nm波長處測定吸光度。每個樣品3個重復(fù)，每個樣品測定3次。

根據(jù)納米硒吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線換算可知樣品中納米硒含量及S13菌株在不同亞硒酸鹽濃度下的轉(zhuǎn)化率(圖4)。S13菌株在較低亞硒酸鹽濃度下可將亞硒酸鹽全部轉(zhuǎn)化為納米硒，對1mM亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率為98.5％，產(chǎn)量為0.985mM；培養(yǎng)基中含有3mM亞硒酸鹽時，S13菌株轉(zhuǎn)化納米硒達到最高產(chǎn)量，為2.47mM，并且對亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率仍能達到82.4％。

實施例5地衣芽孢桿菌S13合成納米硒的最佳培養(yǎng)時間

1、制備含硒液體LB培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min；配制亞硒酸鹽母液，過濾滅菌，加入亞硒酸鹽溶液，使培養(yǎng)基中亞硒酸鹽含量3mM。

2、將S13菌株挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中搖培8h(150rpm，37℃)，取上述菌液，稀釋至OD₆₀₀＝0.8；將稀釋好的菌液按照0.1％接種量接種于空白與3mM亞硒酸鹽LB培養(yǎng)基中，37℃，150rpm搖培，對照與處理各3個重復(fù)。分別于搖培0h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、84h取樣，每個處理3個重復(fù)。

3、將培養(yǎng)好的菌液6000-12000rpm離心8-15min，棄上清，清洗3次，然后加入1:2體積的1M Na₂S溶液，混勻后充分反應(yīng)1h，再6000-12000rpm離心5-8min；然后取上清液在500nm處測定吸光度。每個樣品3個重復(fù)，每個樣品測定3次。

4、根據(jù)納米硒吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線換算可知，S13菌株在3mM亞硒酸鹽濃度下的不同時間納米硒產(chǎn)量(圖5A)及對應(yīng)的納米硒轉(zhuǎn)化效率(圖5B)。S13菌株在搖培60h后合成納米硒單位體積的產(chǎn)量達到最高并保持穩(wěn)定。由此說明在地衣芽孢桿菌S13合成納米硒的最佳生長時間為60-72h。

實施例6地衣芽孢桿菌S13合成生物納米硒特征分析

活化地衣芽孢桿菌S13，轉(zhuǎn)接0.1％的菌液(OD₆₀₀＝0.8)于滅菌后的含LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入一定體積已過濾滅菌后的亞硒酸鹽母液，保證錐形瓶內(nèi)亞硒酸鹽終濃度為3mM，置于搖床內(nèi)37℃，150rpm培養(yǎng)48h。

將搖培48h后的紅色菌液取出，在常溫下6000-10000rpm離心5-10min，去上清，用生理鹽水重懸浮沉淀，離心沖洗3-5遍，取菌與納米硒的紅色混合液，滴加一滴在銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余水分，晾干，在透射電鏡下(TEM,JEM-1230,Japan)觀察，并利用能譜分析儀(EDX)對該納米顆粒進行分析。

結(jié)果如圖6A和6B所示：透射電鏡下，S13細胞膜上與細胞外可見球形納米硒顆粒，粒徑為50-300nm，主要粒徑為150-200nm。通過EDX能譜分析箭頭所指的納米顆?？芍霈F(xiàn)在1.37、11.22和12.49KeV處特定吸收峰為硒的特征峰，說明S13菌將亞硒酸鹽還原后形成的納米顆粒是納米硒。

實施例7地衣芽孢桿菌S13合成生物納米硒發(fā)酵工藝

1、菌種活化

用SOC培養(yǎng)基對菌株進行活化培養(yǎng)，SOC培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，氯化鉀2.5mM，氯化鎂10mM，葡萄糖20mM，瓊脂15g/L，pH 7.0-7.2；將菌株S13接種于SOC培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)48小時；

2、種子液的制備

種子培養(yǎng)用SOB液體培養(yǎng)基，SOB液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，氯化鉀2.5mM，氯化鎂10mM，pH 7.0-7.2；將活化好的菌株S13用無菌生理鹽水配制成10⁸CFU/mL的菌懸液，以1％的接種量接種于SOB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)時間為24-36h；

3、發(fā)酵罐發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)采用TB發(fā)酵培養(yǎng)基，TB發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10-15g/L，酵母提取物8-15g/L，甘油4-6ml/L，KH₂PO₄ 2-5g/L，K₂HPO₄15-20g/L，亞硒酸鹽3mM，pH 7.0；控制培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的60-80％，將種子液按照2-4％的接種量接入發(fā)酵罐，控制發(fā)酵溫度為35-38℃，攪拌速度為160-260rpm，通氣量為1：0.4-0.8，罐壓1.3-1.7F/cm²，發(fā)酵80-120小時。發(fā)酵液下罐，測得發(fā)酵液中納米硒含量為2.6mM。

4、生物納米硒的分離純化

(1)納米硒的收集、清洗與濃縮

發(fā)酵液下罐，4500-12000rpm離心10-20min收集菌體沉淀，用無菌生理鹽水4500-12000rpm離心10-20min清洗2-3遍，并用發(fā)酵液1/10體積的無菌純凈水重懸沉淀，將納米硒濃縮至發(fā)酵液濃度的10倍，達到26mM。

(2)生物納米硒的分離純化

a、發(fā)酵液下罐，將發(fā)酵液置于冰上進行超聲破碎細胞，設(shè)置變幅桿為Φ10，占空比40-80％，功率500-800W，頻率20KHz，啟停間隔5-10s，破碎30-40min，得到菌體裂解液；

b、菌體裂解液于4000-10000rpm離心10-30min，所得沉淀用無菌生理鹽水4000-10000rpm離心20-30min清洗3-5遍；將沉淀重懸于發(fā)酵液1/2體積的無菌純凈水中，得到納米硒懸液；

c、將納米硒懸液轉(zhuǎn)移至萃取塔中，按照發(fā)酵液0.4-0.7倍體積的量加入正己烷萃取3-6次，收集下層水相，冷凍干燥，即得納米硒干粉；

d、獲得高純度、分散性較好生物納米硒懸液，透射電子顯微鏡觀察結(jié)果見圖7。

(3)冷凍干燥與生物納米硒制備

將步驟(1)中制備的生物納米硒，用液氮冷凍10-15min，放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強20-100Pa，加熱板溫度為20-35℃，樣品厚度為10-25mm；干燥時間在48-72小時，得到生物納米硒干粉A。

將步驟(2)中制備的生物納米硒，用液氮冷凍10-15min，放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)為壓強20-65Pa，加熱板溫度為20-25℃，樣品厚度為10-14mm；干燥時間在36-48小時，得到純生物納米硒干粉B。

實施例8生物納米硒在富硒肥料、飼料、功能食品、保健品和藥品中的應(yīng)用

1、將生物納米硒干粉A和B分別懸浮于純凈水中，配制成1-5g/L的富硒肥料A和富硒肥料B。將肥料A和B用于小麥、水稻、玉米等糧食作物種植，用于大豆、花生、谷子、紅薯等雜糧的種植，并在金針菇、香菇、木耳等食用菌養(yǎng)殖中施用，用于番茄、茄子、黃瓜等蔬菜的種植，以及用于蘋果、獼猴桃等水果和茶葉種植中，獲得可再加工的富硒作物、富硒食用菌、富硒水果、富硒茶葉。富硒糧食和雜糧硒含量為100-300μg/kg，富硒蔬菜和水果硒含量為20-100μg/kg，富硒食用菌硒含量為150-5000μg/kg。

2、將生物納米硒干粉A或B按照50-800μg/kg比例與飼料原料混合均勻，配制成富硒飼料A和富硒飼料B。將飼料A和B飼喂蛋雞、肉雞、豬、羊、牛等畜禽后，獲得可再加工的富硒雞蛋、富硒雞肉、富硒豬肉、富硒羊肉、富硒牛肉。富硒雞蛋硒含量為200-1000μg/kg，富硒畜禽肉硒含量為200-800μg/kg。

3、將生物納米硒干粉B按照10-2500μg/kg的比例與小米面粉、植物油和純凈水(三者的重量百分比為55％、10％和35％)混合均勻，投入膨化機中擠壓膨化，烘干裝袋，獲得膨化小米富硒功能食品?；蛘?，將小米面粉替換為玉米粉、蕎麥粉或豆粉，可獲得膨化玉米、蕎麥或豆粉富硒功能食品。

4、將生物納米硒干粉B(10-500mg/Kg)與淀粉(g/Kg)、維生素E(0-22g/Kg)和β胡蘿卜素(0-5g/Kg)混合均勻，加入潤濕劑，在制粒機中制成微粒，將微粒烘干并填充到膠囊殼中，控制每粒膠囊重0.3-0.6g，按100粒每瓶裝瓶，封口包裝入庫。

5、將生物納米硒干粉B(50-800mg/Kg)與淀粉和植物蛋白粉(淀粉和植物蛋白粉的重量比為95：4.9)混合均勻，將粘合劑HPMC加入到上述混合物中，在混合機中攪拌均勻，將原料投入壓片機中開車壓片，烘干，每粒片重0.4-0.6g，按100粒每瓶裝瓶，封口包裝入庫。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 利用地衣芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應(yīng)用

<130> KHP161117069.3

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1344

<212> DNA

<213> 地衣芽孢桿菌

<400> 1

ggaccgacgg gagcttgctc ccttaggtca gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 60

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgattga 120

accgcatggt tcaatcataa aaggtggctt ttagctacca cttgcagatg gacccgcggc 180

gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga 240

gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 300

ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 360

tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct 420

tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480

ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc 540

tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 600

agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 660

cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc 720

gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg 780

gtttccgccc tttagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg 840

caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 900

attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac cctagagata 960

gggcttcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020

gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag 1080

ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1140

catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc 1200

gaagccgcga ggctaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa 1260

ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1320

ttcccgggcc ttgtacacac cgcc 1344

<210> 2

<211> 1282

<212> DNA

<213> 地衣芽孢桿菌

<400> 2

gattgggcga ttgagctgcc cttgaagtca tcatgaccgt tctgcacgct ggtgggaagt 60

ttgacggaag cggatataaa gtttcaggcg gtttgcacgg cgttggtgca tctgttgtta 120

acgccctttc aaccgagctc gatgtaacgg tttacagaga tggaaaagtc cattaccagg 180

aatttgaacg gggcgttccg aaagctgatt tgaaagtcat cggagatacg gaagtgacgg 240

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atgatacgct tgccactcgt gtccgggagc tcgctttctt gacaaaaggc gtcaaaatca 360

cgattgaaga caagcgagaa ggaaaagaac gcaagaatga ttactgctat gaaggcggta 420

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gctcgcacat ccgactgcaa gg 1282