發(fā)明涉及一種產(chǎn)β-半乳糖苷酶的克雷伯氏菌及其應(yīng)用，屬于微生物分離、培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），全名為β-D-半乳糖水解酶（β-D-galactoside galcagalcato-hydrolase，EC.3.2.1.23），簡稱乳糖酶。β-半乳糖苷酶的應(yīng)用很廣泛，在食品加工、醫(yī)藥、免疫、環(huán)境監(jiān)測中均有體現(xiàn)，但以在食品中的應(yīng)用為主。一方面，它可以應(yīng)用到乳制品生產(chǎn)中，水解乳糖，提高乳制品甜度、改善風(fēng)味，降低乳制品中乳糖含量，進而適應(yīng)乳糖不耐癥患者的需求；由于乳糖在低溫下溶解性較差，因此當(dāng)乳糖含量降低時，可以有效防止乳制品冷凍時出現(xiàn)結(jié)晶，改善口感等。另一方面，酶的受體為乳糖或者半乳糖等時，可通過轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)生成低聚半乳糖；低聚半乳糖是一種新型功能性糖，它可以促進益生菌的生長繁殖，提高機體免疫力，同時又具有低能量、低甜度等功能特性。

β-半乳糖苷酶來源非常豐富，廣泛存在于植物、微生物、及動物腸道中。但目前用于工業(yè)生產(chǎn)的β-半乳糖苷酶僅來源于微生物；其中，細菌、酵母、霉菌均存在多種產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌種；而不同微生物來源的β-半乳糖苷酶的水解活性和轉(zhuǎn)糖苷活性的比例不同。某些微生物，如黑曲霉、乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母等所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶具有較強的水解活性；而保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和米曲霉等所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶則具有較強的轉(zhuǎn)糖苷活性。但是，目前的天然產(chǎn)酶菌株的所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的酶活普遍較低，優(yōu)良天然菌株資源匱乏，因此篩選新型高產(chǎn)酶優(yōu)良菌株具有主要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前的天然產(chǎn)酶菌株所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的的酶活普遍較低，優(yōu)良天然菌株資源匱乏的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種可產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株。

本發(fā)明還提供了上述可產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株的應(yīng)用及其通過發(fā)酵獲得β-半乳糖苷酶的方法。

技術(shù)方案

本發(fā)明從土壤中篩選并分離出了一株新的菌株，命名為B5582Y；該菌株B5582Y，于37℃在篩選平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)24h，菌落呈圓形，直徑2-5mm，中間凸起，表面光滑、粘稠，不易挑取；經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色，顯微鏡觀察為革蘭氏陰性菌短桿菌，無芽孢生成。所述篩選培養(yǎng)基：乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、瓊脂20g/L、水余量，pH為7.0。

對本發(fā)明的菌株B5582Y進行BIOLOG GEN III生理生化試驗，其生理生化特征與克雷伯氏菌相吻合。

對本發(fā)明的菌株B5582Y進行16s基因測序，序列SEQ ID NO.3所示。將所得菌株序列通過Genebank序列比對，利用MEGA6建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。通過16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株B5582Y鑒定為：克雷伯氏菌，Klebsiella michiganensis。

本發(fā)明的克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis）B5582Y，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏號：CGMCCNo.13035，保藏日期為2016年9月23日。

本發(fā)明的克雷伯氏菌B5582Y，能夠產(chǎn)β-半乳糖苷酶；所產(chǎn)β-半乳糖苷酶為胞內(nèi)酶；所產(chǎn)β-半乳糖苷酶具有水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種活性。

本發(fā)明的克雷伯氏菌B5582Y，產(chǎn)β-半乳糖苷酶的能力較強；通過搖瓶發(fā)酵10-24h，即可獲得水解酶活為12U/mL的發(fā)酵液。

本發(fā)明的克雷伯氏菌B5582Y，連續(xù)傳代10代以上，產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力不變。

因此，與現(xiàn)有的能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶菌株相比，本發(fā)明的克雷伯氏菌的特殊之處在于菌株較為新穎，所產(chǎn)β-半乳糖苷酶具有水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種活性，產(chǎn)β-半乳糖苷酶的能力較強，遺傳穩(wěn)定性好。

本發(fā)明還提供了克雷伯氏菌B5582Y的應(yīng)用，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。

一種采用克雷伯氏菌B5582Y產(chǎn)β-半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟：

發(fā)酵培養(yǎng)：將克雷伯氏菌B5582Y接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，于轉(zhuǎn)速160-200r/min、37℃的條件下恒溫培養(yǎng)10h-24h，即可獲得含有β-半乳糖苷酶的發(fā)酵液；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖10-40g/L、硫酸銨0-10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉0-10g/L、NaCl4g/L、水余量，pH為7.0。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖40g/L、硫酸銨10g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 4g/L、水余量，pH為8.0。此時，所獲得的發(fā)酵液的水解酶活力達到35.7U/mL。

上述方法，還可以包括以下步驟：

β-半乳糖苷酶粗酶液的制備：將發(fā)酵液于4℃以8000 rpm離心10 min，將沉淀用pH 6.7的鈉鹽PBS緩沖液洗滌、離心后，再次加入pH 6.7的PBS緩沖液，冰水浴超聲處理10min，然后于4℃以8000 rpm離心10min，取上清液即為β-半乳糖苷酶粗酶液；

超聲處理條件：500W、超聲1.5s、間歇2s。

上述方法，還可以包括以下步驟：克雷伯氏菌B5582Y接種到發(fā)酵培養(yǎng)基之前依次進行平板培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)；

平板培養(yǎng)：將克雷伯氏菌B5582Y接種到斜面培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h；

增殖培養(yǎng)：將平板培養(yǎng)后的克雷伯氏菌B5582Y取兩環(huán)接種到增殖培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速160-200r/min、37℃恒溫培養(yǎng)24h，得增殖菌液；

其中，所斜面培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基的pH均為7.0；

每1L斜面培養(yǎng)基含有以下成分：乳糖10g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，NaCl 4g，瓊脂20g，水余量；

每1L增殖培養(yǎng)基含有以下成分：胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，NaCl 4g，水余量。

本發(fā)明所用專業(yè)術(shù)語說明：

水解酶活力單位（U）定義：在上述條件下，酶催化oNPG反應(yīng)1 min生成1 μmol的oNP所需酶量定義為1個酶活力單位。

有益效果：

1、本發(fā)明的克雷伯氏菌B5582Y的液體發(fā)酵液中所產(chǎn)β-半乳糖苷酶具有水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種活力；

2、通過搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)酵周期12-24h，含有β-半乳糖苷酶的發(fā)酵液的水解酶活可達35.7U/mL；

3、與本發(fā)明之前的β-半乳糖苷酶相比，同時具備了較高的水解酶活力和較強的轉(zhuǎn)糖苷活力；

4、本菌株遺傳穩(wěn)定性好，操作簡單，連續(xù)傳代10代以上，產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力不變。

保藏信息

保藏單位 ： 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 中國科學(xué)院微生物研究所

保藏日期 ：2016年9月23日

保藏編號 ：CGMCCNo.13035

分類命名 ：克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis）。

附圖說明

圖1克雷伯氏菌B5582Y系統(tǒng)進化發(fā)育樹圖；

圖2克雷伯氏菌B5582Y菌落形態(tài)；

圖3克雷伯氏菌B5582Y顯微觀察；

圖4酶解前乳糖底物HPLC圖；

圖5酶解后產(chǎn)物的HPLC圖。

具體實施方式

在下面所述的具體實施例中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常用方法。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件（參考趙瑞香和Gul-Guvend的相關(guān)文獻）或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明實施例所用培養(yǎng)基如下：

篩選平板培養(yǎng)基：乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、瓊脂20g/L、水余量，pH為7.0；

斜面培養(yǎng)基：乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、瓊脂20g/L、水余量，pH為7.0；

增殖培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、水余量，pH為7.0；

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、水余量，pH為7.0。

實施例1克雷伯氏菌B5582Y篩選分離與鑒定

一、克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis）B5582Y篩選分離

稱取0.1g采集于河南省新鄉(xiāng)市金利爾乳制品廠附近的土樣，放進裝有無菌水的1.5mL的PE小管中充分震蕩均勻；然后用無菌水將其分別稀釋成體積濃度為1×10^-4、1×10^-5兩個梯度的稀釋液；分別用滅菌的槍頭吸取100μL不同梯度的稀釋液涂布于預(yù)先配制、滅菌的并涂有40mL的20mg/mL x-gal篩選平板培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24-36h。從篩選平板培養(yǎng)基上挑取帶有藍色水解圈的單菌落，劃線分離單菌落，將挑取的單菌落中的部分制片鏡檢判斷菌株純度（顯微鏡觀察菌體為同一形態(tài)特征）。如果不是純菌落，應(yīng)反復(fù)多次劃線分離單菌落，直至獲得純菌落為止。將獲得的純菌落用斜面培養(yǎng)基保存，得到菌株純培養(yǎng)體。

后續(xù)復(fù)篩：將有具有藍色透明圈的菌株進行搖瓶培養(yǎng)，制備粗酶液，測定水解酶活，選取水解酶活較高菌株，命名為B5582Y做進一步鑒定。

二、克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis）B5582Y的鑒定

1.形態(tài)特征

菌株B5582Y于37℃在篩選平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)24h，菌落呈圓形，直徑2-5mm，中間凸起，表面光滑、粘稠，不易挑取，結(jié)果見圖2。經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色，顯微鏡觀察為革蘭氏陰性菌短桿菌，無芽孢生成，結(jié)果見圖3。

2.16S rDNA 序列分析：

正向引物F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，SEQ ID NO：1；

反向引物R：5'-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，SEQ ID NO：2；

利用PCR 技術(shù)擴增該菌的16S rDNA；

PCR擴增反應(yīng)的具體操作如下（未具體說明的操作為常規(guī)操作）：

將反應(yīng)體系依次加入PE小管；打開PCR擴增儀擴增；完成反應(yīng)后關(guān)閉儀器；取出反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增DNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后測序，PCR擴增產(chǎn)物委托北京奧科鼎盛公司完成測序工作；擴增產(chǎn)物DNA序列表為：SEQ ID NO：3。將所得菌株序列通過Genebank序列比對，利用MEGA6建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。通過16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株B5582Y鑒定為：克雷伯氏菌，Klebsiella michiganensis。

PCR擴增反應(yīng)體系所涉及各種試劑及用量：PCR擴增反應(yīng)體系10×PCR Buffer（Mg^2＋Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mM）8μL，引物F（10 μmol/L）1μL，引物R（10 μmol/L）1μL，模板DNA 1μL，Taq（5 U/μl）0.5 μL，總體積為50μL，其余用滅菌后的ddH2O補充。

PCR擴增反應(yīng)條件: 95℃變性5min；95℃變性60s，57℃退火60s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。

3.生理生化特征

對菌株B5582Y進行BIOLOG GEN III生理生化試驗（見表1），其生理生化特征與克雷伯氏菌相吻合。

表1：生理生化反應(yīng)表

實施例2 含β-半乳糖苷酶、克雷伯氏菌B5582Y的發(fā)酵液的制備及發(fā)酵優(yōu)化

一、斜面培養(yǎng)

克雷伯氏菌B5582Y接種于斜面培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24h，得斜面菌株。

二、液體增殖培養(yǎng)及發(fā)酵

將得斜面菌株挑取2 環(huán)接入增殖培養(yǎng)基中，于37℃、180rpm培養(yǎng)24h，得增殖菌液；增殖菌液以 2%（v/v）的接種量接入到裝有50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37℃、180rpm培養(yǎng)24h，得發(fā)酵液。

三、發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對碳源種類及濃度、氮源種類及濃度、發(fā)酵液初始pH、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速進行優(yōu)化，得到產(chǎn)β-半乳糖苷酶的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖40g/L、硫酸銨10g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 4g/L、水余量，pH為8.0。將步驟（2）培養(yǎng)好的增殖菌液以4%的接種量接種到120℃滅菌20min的裝有50mL優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，30℃恒溫培養(yǎng)15h，轉(zhuǎn)速180r/min，水解酶活力達到最高為35.7U/mL。

實施例3 β-半乳糖苷酶的確認及酶活力的測定

一、粗酶液的制備

將實施例2中獲得的發(fā)酵液于4℃、8000 rpm離心10 min，將菌體沉淀用pH 6.7的PBS緩沖液（鈉鹽）洗滌、離心兩次后，再次加入與發(fā)酵液相同體積的pH 6.7 PBS緩沖液，冰水浴超聲處理（500W，超聲1.5s，間歇2s）10min，然后于4℃、 8000 rpm離心10min，取上清液即為β-半乳糖苷酶粗酶液。

二、β-半乳糖苷酶水解酶活力測定

準確稱取一定量的oNPG粉末，用0.05 mol/L、pH 6.7的PBS緩沖液配制2 mg/mL的oNPG溶液；取2mLoNPG溶液置于試管中，于50℃保溫10 min，然后加入0.5 mL適當(dāng)稀釋使最終反應(yīng)結(jié)束后，待測液的OD值在0.2-0.8之間，通常稀釋100倍左右。將步驟1中的酶液，振蕩混勻后在50℃下反應(yīng)10 min，加入2.5 mL的0.5mol/L Na₂CO₃溶液終止反應(yīng)。對照管先加2.5 mL的0.5mol/LNa₂CO₃溶液再加0.5mL適當(dāng)稀釋（100倍左右）的步驟1中的酶液。在420 nm下測定樣品的吸光度，根據(jù)oNP標準曲線計算酶活力。

三、β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活力測定

用0.05 mol/L、pH 6.7 的PBS緩沖液配制 0.5 mol/L的乳糖溶液；取500 μL乳糖溶液置于離心管中，50℃ 保溫10 min 后加入1000μL實施例3中步驟1中粗酶液，振蕩混勻繼續(xù)反應(yīng)4h，然后放入沸水浴中煮沸10 min滅酶。取適量酶解后液體經(jīng)0.22μm微孔過濾器過濾后，經(jīng)HPLC檢測乳糖水解活性與低聚半乳糖的生成情況，結(jié)果如圖4和5。圖4為酶解前底物乳糖的HPLC圖，圖5為酶解后乳糖的水解產(chǎn)物葡萄糖，半乳糖以及發(fā)生轉(zhuǎn)苷后產(chǎn)生的低聚糖的HPLC圖，兩圖對比方可看出加了乳糖酶后對乳糖的作用效果。

色譜測定條件：Agilent 1260高效液相色譜-示差折光檢測器；色譜柱：Inertsil HPLC Column NH₂ 5μm、4.6*250 mm；柱溫：30℃；流動相：乙腈:水=70:30；流速：1.0 mL/min。

<110>北京工商大學(xué)

<120>一種產(chǎn)β-半乳糖苷酶的克雷伯氏菌及其應(yīng)用

<160>3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ACGGTTACCT TGTTACGACT T 21

<210>3

<211>1461

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

CACATGCAGT CGAACGGTAG CACAGAGAGC TTGCTCTCGG GTGACGAGTG GCGGACGGGT 60

GAGTAATGTC TGGGAAACTG CCTGATGGAG GGGGATAACT ACTGGAAACG GTAGCTAATA 120

CCGCATAACG TCGCAAGACC AAAGAGGGGG ACCTTCGGGC CTCTTGCCAT CAGATGTGCC 180

CAGATGGGAT TAGCTAGTAG GTGGGGTAAC GGCTCACCTA GGCGACGATC CCTAGCTGGT 240

CTGAGAGGAT GACCAGCCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG 300

CAGTGGGGAA TATTGCACAA TGGGCGCAAG CCTGATGCAG CCATGCCGCG TGTATGAAGA 360

AGGCCTTCGG GTTGTAAAGT ACTTTCAGCG GGGAGGAAGG CGATAAGGTT AATAACCTCG 420

TCGATTGACG TTACCCGCAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT 480

ACGGAGGGTG CAAGCGTTAA TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGCAG GCGGTCTGTC 540

AAGTCGGATG TGAAATCCCC GGGCTCAACC TGGGAACTGC ATTCGAAACT GGCAGGCTGG 600

AGTCTTGTAG AGGGGGGTAG AATTCCAGGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATCTGGAGG 660

AATACCGGTG GCGAAGGCGG CCCCCTGGAC AAAGACTGAC GCTCAGGTGC GAAAGCGTGG 720

GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCTGTA AACGATGTCG ACTTGGAGGT 780

TGTTCCCTTG AGGAGTGGCT TCCGGAGCTA ACGCGTTAAG TCGACCGCCT GGGGAGTACG 840

GCCGCAAGGT TAAAACTCAA ATGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG 900

TTTAATTCGA TGCAACGCGA AGAACCTTAC CTACTCTTGA CATCCAGAGA ACTTAGCAGA 960

GATGCTTTGG TGCCTTCGGG AACTCTGAGA CAGGTGCTGC ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG 1020

TTGTGAAATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC TTATCCTTTG TTGCCAGCGA 1080

TTCGGTCGGG AACTCAAAGG AGACTGCCAG TGATAAACTG GAGGAAGGTG GGGATGACGT 1140

CAAGTCATCA TGGCCCTTAC GAGTAGGGCT ACACACGTGC TACAATGGCA TATACAAAGA 1200

GAAGCGACCT CGCGAGAGCA AGCGGACCTC ATAAAGTATG TCGTAGTCCG GATTGGAGTC 1260

TGCAACTCGA CTCCATGAAG TCGGAATCGC TAGTAATCGT GGATCAGAAT GCCACGGTGA 1320

ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAT GGGAGTGGGT TGCAAAAGAA 1380

GTAGGTAGCT TAACCTTCGG GAGGGCGCTT ACCACTTTG 1419