本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種陰溝腸桿菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

化學(xué)農(nóng)藥具有適用范圍廣、防治對象多、生產(chǎn)成本低、防治效果好以及經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，其廣泛適用極大地促進了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的勞動效率和機械化程度。但是不可避免地，大量使用農(nóng)藥殺傷昆蟲天敵和有益微生物、使有害生物產(chǎn)生抗性、造成人、畜中毒、易對植物產(chǎn)生藥害等問題，進入環(huán)境中的化學(xué)農(nóng)藥，一部分可通過陽光照射、土壤中微生物等的作用，而逐步降解失效；另一部分最終會通過“食物鏈”的作用，進入人體，對人造成長期危害。各類化學(xué)農(nóng)藥目前已廣泛進入全球空氣及大氣沉降物、水體、土壤、底泥級生物體等自然環(huán)境中，成為環(huán)境中無所不在的污染物，因此探索對農(nóng)藥殘留進行有效降解的方法成為研究人員長期努力的一個重要研究方向。而在該領(lǐng)域研究中，近年來廣泛興起的使用微生物對農(nóng)藥殘留進行生物降解成為熱點領(lǐng)域，通過微生物作用將農(nóng)藥大分子分解成小分子化合物，并使其喪失活性。由于微生物個體小、繁殖迅速、比表面大等特點。它們較之其它生物更易適應(yīng)環(huán)境，并可通過自然突變產(chǎn)生新菌種，產(chǎn)生新的酶系統(tǒng)，具有新的代謝功能，從而可參與對人工新合成化合物的降解與轉(zhuǎn)化作用，因此微生物對降解農(nóng)藥殘留具有巨大潛力。

假單胞菌科的1屬，兼性厭氧的革蘭氏染色陰性無芽胞、無莢膜桿菌，呈粗短桿狀。菌體大小(0.6～1.1)×(1.2～3)微米。有周身鞭毛(6～8條鞭毛)動力陽性。大多數(shù)菌的適溫為30℃。DNA中的G+C克分子含量為58～70％。陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)屬于假單胞菌屬rRNA I群熒光DNA同源組,是植物根際最普遍的微生物類群具有分布廣、數(shù)量多、營養(yǎng)需要簡單、繁殖快、競爭定殖力強的特點。世界許多國家均有人報道分離到抗植物病害的陰溝腸桿菌，而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質(zhì)，抗多種植物病害。其作用機制包括：抗生素的作用、噬鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、有效的根際定殖等。隨著分子生物學(xué)的廣泛滲入，通過對這些作用機制的遺傳性狀進行分析，采用遺傳工程加以改良，使得陰溝腸桿菌具有更誘人的生防效果。因此獲得對化學(xué)農(nóng)藥的高效降解菌株并運用于實踐，對降低農(nóng)藥殘留對環(huán)境的危害具有現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種陰溝腸桿菌菌株及其應(yīng)用，旨在解決降解高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留的問題，提供一種高效降解高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留的微生物菌種,該菌能高效降解高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留，該菌可以用于水體、土壤及表面殘留的甲霜靈的生物降解。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種陰溝腸桿菌菌株，所述陰溝腸桿菌菌株保藏編號為：CGMCC No.12819。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種陰溝腸桿菌菌株的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括：將所述的陰溝腸桿菌菌絲體接種到直徑60毫米平皿培養(yǎng)基上，在28-30℃，平皿培養(yǎng)基上生長3-5天；

解剖刀刮取菌體，接入液體培養(yǎng)基中，2個培養(yǎng)皿刮取的菌絲接種到100ml培養(yǎng)液中，于28-30℃，240rmp/min轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)3-5天，獲得包含其分泌的胞外降解酶的培養(yǎng)液，其為菌絲及菌液的混合菌劑；

優(yōu)選的，所述的平皿LB培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，pH7.5；

優(yōu)選的，所述的液體LB培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH7.5。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述陰溝腸桿菌菌株降解水體、土壤及煙葉表面的甲霜靈農(nóng)藥殘留的應(yīng)用。

優(yōu)選的，在經(jīng)過培養(yǎng)的培養(yǎng)液100ml中，加入最終濃度5-10mg/L的甲霜靈農(nóng)藥，于30℃，轉(zhuǎn)速240rmp/min，搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間48小時以上。

本發(fā)明提供的陰溝腸桿菌菌株，是煙草根部土壤中分離得到的一株高效降解殺菌劑—甲霜靈的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。該陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)是一株具有極高活力，其培養(yǎng)方法簡單，生長速度快，不易變異，實驗表明該菌能夠在LB培養(yǎng)基中利用甲霜靈作為唯一碳源和能源而生長，并使甲霜靈降解；在添加外源營養(yǎng)物的液體培養(yǎng)條件下，該菌48h能夠?qū)⒒烊肱囵B(yǎng)基中5mg/L的甲霜靈降解90％以上，并且在較寬的pH范圍內(nèi)均有較好的降解效果，充分說明該菌可以用于水體、土壤及表面殘留的甲霜靈的生物降解，具有農(nóng)藥殘留生物降解的工業(yè)化應(yīng)用前景，也可以作為研究陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)對甲霜靈農(nóng)藥殘留降解機制的模式菌株。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的陰溝腸桿菌菌株分離方法流程圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施例的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)菌株，該菌株命名為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期是2016年8月8日，保藏編號為：CGMCC No.12819。

所述陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)菌株為粗短桿狀，0.6μm～1.1μm×1.2μm～3.0μm，革蘭氏染色陰性，無芽孢無莢膜，有周身鞭毛(6～8條鞭毛)動力陽性，能運動，兼性厭氧。在KMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可形成1.2mm菌落，菌落可產(chǎn)生紅色色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊，為化能異養(yǎng)型，能夠利用植物根分泌的大部分養(yǎng)分迅速定殖于植物的根部，是最有潛力的促進植物生長的根圍細菌之一。

所述陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)菌株培養(yǎng)過程為：將所述的陰溝腸桿菌菌絲體接種到直徑60毫米平皿培養(yǎng)基上，在28-30℃，平皿培養(yǎng)基上生長3-5天；解剖刀刮取菌體，接入液體培養(yǎng)基中，2個培養(yǎng)皿刮取的菌絲接種到100ml培養(yǎng)液中，于28-30℃，240rmp/min轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)3-5天，獲得包含其分泌的胞外降解酶的培養(yǎng)液，其為菌絲及菌液的混合菌劑；

所述的平皿LB培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，pH7.5；

所述的液體LB培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH7.5。

在經(jīng)過培養(yǎng)的培養(yǎng)液100ml中，加入最終濃度5-10mg/L的甲霜靈農(nóng)藥，于30℃，轉(zhuǎn)速240rmp/min，搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間48小時以上。

如圖1所述，本發(fā)明提供的陰溝腸桿菌菌株，是煙草根部土壤中分離得到的一株高效降解殺菌劑—甲霜靈的陰溝腸桿菌菌株。陰溝腸桿菌菌株分離方法如下：

S101：培養(yǎng)基配制：菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml，pH7.5；加水定容至IL；菌種活化培養(yǎng)基(固體，1L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；液體培養(yǎng)基(液體，IL)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH7.5，加水定容至IL，培養(yǎng)基均在高壓鍋中121℃滅菌25分鐘；

S102：菌種活化：挑去降解菌的菌絲，接種于加有菌種保藏培養(yǎng)基的60ml培養(yǎng)皿中，于28-30℃，培養(yǎng)3-5天，然后用手術(shù)刀刮取培養(yǎng)基表面菌絲，接菌入液體培養(yǎng)基中，于28-30℃，240轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)3-5天，獲得包含其分泌的胞外降解酶的培養(yǎng)。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步的描述。

實施例1菌體的培養(yǎng)：用接種針挑取陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)菌絲接種到上述菌種活化培養(yǎng)基平皿中，在溫度為28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，菌株為粗短桿狀，0.6μm～1.1μm×1.2μm～3.0μm，革蘭氏染色陰性，無芽孢、無莢膜，有周身鞭毛(6～8條鞭毛)動力陽性，能運動，兼性厭氧。用手術(shù)刀刮取菌體，接種到裝有500ml經(jīng)121℃、0.1MPa下高壓滅菌20min的培養(yǎng)液的錐形瓶中。再置于30℃，轉(zhuǎn)速240rmp/min，搖床震蕩培養(yǎng)4天，獲得菌絲及菌液混合菌劑。

實施例2補充碳源固態(tài)培養(yǎng)基中甲霜靈殘留的降解:在菌種活化培養(yǎng)基滅菌降溫到40℃時，混入經(jīng)過紫外滅菌30分鐘的甲霜靈農(nóng)藥，濃度為5mg/L，充分混勻后，倒入直徑60ml的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿3mL培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基呈粉紅色。將實施例1中培養(yǎng)好的菌絲沿菌落邊緣用6mm沒直徑的打孔器打成小片。待混有甲霜靈農(nóng)藥的培養(yǎng)基冷凝后，接入菌絲小片，菌絲向下緊貼培養(yǎng)基表面。置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，培養(yǎng)基中的粉紅色已褪去，甲霜靈農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)被降解，培養(yǎng)基呈奶油色半透明狀。

實施例3:降解菌菌劑對高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留的降解

(1)在經(jīng)過培養(yǎng)的培養(yǎng)液100ml中，加入5mg/L的甲霜靈農(nóng)藥，于30℃，轉(zhuǎn)速240rmp/min，搖床震蕩培養(yǎng)，以未經(jīng)接種的培養(yǎng)液中加入相等濃度的甲霜靈農(nóng)藥作為對照組；

(2)每隔12h取樣一次，取3ml樣品置于5OmL所述陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)降解水體、土壤及煙葉表面的甲霜靈農(nóng)藥殘留的應(yīng)用如下：塑料離心管中，加入乙睛1OmL，在振蕩器上振蕩30min，3000rmp/min下離心，取出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，提取培養(yǎng)液中的甲霜靈農(nóng)藥殘留后，在固相萃取裝置中經(jīng)佛羅里硅土固相萃取柱(規(guī)格:500mg3ml)凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40℃以下)，-20℃下冷凍干燥，再用少量乙睛溶解提取到的農(nóng)藥殘留，對其進行氣相色譜分析。

其降解率：降解率(％)＝(A-B)/A×100。

其中A為對照組甲霜靈農(nóng)藥殘留值(48小時后殘留值為4.7mg/L)，B為經(jīng)降解菌劑降解后的甲霜靈農(nóng)藥殘留值(48小時后殘留值為0.5mg/L)。

以陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)為菌種，以殺菌劑為補充碳源，降解甲霜靈。取3ml樣品置于5OmL塑料離心管中，加入乙睛1OmL，在振蕩器上振蕩30min，3000rmp/min下離心，取出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，提取培養(yǎng)液中的甲霜靈農(nóng)藥殘留后，在固相萃取裝置中經(jīng)佛羅里硅土固相萃取柱(規(guī)格:500mg3ml)凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40℃以下)，-20℃下冷凍干燥，再用少量乙睛溶解提取到的農(nóng)藥殘留，對其進行氣相色譜分析。計算降解率:降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中A為對照組甲霜靈農(nóng)藥殘留值(48小時后殘留值為4.7mg/L)，B為經(jīng)降解菌劑降解后的甲霜靈農(nóng)藥殘留值(48小時后殘留值為0.5mg/L)。在該培養(yǎng)條件下，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)對高濃度甲霜靈農(nóng)藥殘留的降解率48小時內(nèi)可達90％以上。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。