本發(fā)明涉及吡咯伯克霍爾德氏菌的應(yīng)用及其降解萘的方法，屬于環(huán)境微生物應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：萘(naphthalene,NAP)是環(huán)境中普遍存在的具有代表性的一類重要持久性有機污染物(persistentorganicpollutants，POPs)。大量研究已經(jīng)證明，NAP具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變的“三致”作用，是環(huán)境中一類危險而且需重點研究的、也是各國優(yōu)先控制的污染物。由于大氣沉降、污水灌溉、固體廢棄物填埋滲漏、油田開采和石油產(chǎn)品大量使用等，造成全球范圍內(nèi)地方土壤NAP污染，在我國許多地方已出現(xiàn)較嚴重污染的情況。NAP由于性質(zhì)穩(wěn)定、難于降解，在土壤環(huán)境中呈不斷積累的趨勢，嚴重危害著土壤的生產(chǎn)和生態(tài)功能、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人類健康。目前，治理土壤NAP污染的方法主要有物理修復、化學修復和生物修復。其中生物修復技術(shù)因具有成本低、無二次污染、可大面積應(yīng)用等獨特優(yōu)點而越來越受到人們的重視，是目前最具潛力的土壤修復技術(shù)之一。吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia），其應(yīng)用主要在促進植物生長和植物病害的生物防治；目前未見有關(guān)利用吡咯伯克霍爾德氏菌降解NAP的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能夠降解萘的新菌株；及該菌株的應(yīng)用和采用該菌株降解NAP的方法。技術(shù)方案本發(fā)明從土壤中篩選并分離出了一株新的菌株；屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，不能形成芽孢；經(jīng)鑒定，該菌株是一種吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）；命名為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號：CGMCCNo.12806；保藏日期：2016年7月21日。本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213能夠降解NAP；吡咯伯克霍爾德氏菌B1213對NAP的降解率可高達92.45%-96.89%。采用本發(fā)明的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解NAP的其中一種方法為：在酵母提取物存在的條件下，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213與NAP接觸。其中，酵母提取物的量會影響降解率。所以，上述方法，優(yōu)選的，在改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基存在的條件下，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213與NAP接觸；所述改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉4.0g，三水合磷酸鉀0.5g，七水合硫酸鎂0.4g，蒸餾水余量；pH7.0。具體的，是將NAP加入改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基；將吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液接種于改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，在在150-200rpm、30-35℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)。上述方法，優(yōu)選的，改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中酵母提取物的含量為10g/L。上述方法，優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速175rpm，溫度30℃；其他條件相同情況下，在此培養(yǎng)條件下菌B1213對NAP的降解率最高。上述方法，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液相對于改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的接種量的變化，對單位時間內(nèi)的NAP降解率有明顯影響；通常情況下，接種量越多，單位時間內(nèi)降解率越高；但是對最終降解率（發(fā)酵液中NAP含量達到穩(wěn)定時的降解率）沒有明顯影響。上述方法，所述吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液是由吡咯伯克霍爾德氏菌B1213培養(yǎng)獲得的。在獲得吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)操作即可以獲得吡咯伯克霍爾德氏菌B1213種子液。本發(fā)明中，對于某個成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比（w/w）。本發(fā)明所用專業(yè)術(shù)語說明：rpm是轉(zhuǎn)速單位，1rpm是指每分鐘旋轉(zhuǎn)一轉(zhuǎn)。有益效果：（1）首次分離培養(yǎng)出能夠降解萘的吡咯伯克霍爾德氏菌B1213；（2）吡咯伯克霍爾德氏菌B1213對萘的降解率高達為96.89%；（3）本發(fā)明降解萘的方法，與本發(fā)明之前細菌、真菌降解萘的方法相比，在菌種來源上具有新意，其對萘的降解率較高，降解周期短，操作簡單。保藏信息：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學院微生物研究所保藏日期：2016年7月21日保藏編號：CGMCCNo.12806分類命名：吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）。附圖說明圖1為本發(fā)明中所述吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的顯微鏡下形態(tài)特征；圖1中，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213為桿狀的革蘭氏陰性菌，不能形成芽孢；圖2為采用紫外分光光光度法獲得的吸光值（OD）-萘濃度標準曲線；圖3為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析；圖4為吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的recA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析。具體實施方式下述實施例中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常用方法；所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1菌株B1213的鑒定菌株B1213分離自土壤，其形態(tài)如圖1所示，屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，不能形成芽孢。提取其基因組DNA，并利用16srDNA和BCR1引物對于該基因組DNA進行聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,簡稱NCBI)數(shù)據(jù)庫進行菌株比對。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1492R：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，如SEQIDNO.2所示；擴增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全長為1411bp。將該擴增所得16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌株的基因序列進行比較，用MEGA4.1軟件進行序列比對，采用臨位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1213”與模式菌株BurkholderiastabilisLMG28156、同源性達99.7％。(2)recA基因序列分析BCR1基因正向引物：5'-TgACCgCCgAgAAgAgCAA-3'，如SEQIDNO.4所示；BCR2基因反向引物：5'-CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC-3'，如SEQIDNO.5所示；擴增所得recA基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全長為974bp。將該擴增所得recA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌株的基因序列進行比較，用用MEGA4.1軟件進行序列比對，采用臨位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出出菌株“B1213”與模式菌株BurkholderiapyrrociniaDSM10685T(CP011503)同源性達97.9％。因此可以判定B1213為一種全新的吡咯伯克霍爾德氏菌。經(jīng)過鑒定確認其所屬菌種后，吡咯伯克霍爾德氏菌B1213于2016年7月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號為CGMCCNo.12806；此生物材料已經(jīng)存活試驗測試并通過該試驗。實施例2吡咯伯克霍爾德氏菌B1213液體搖瓶培養(yǎng)液制備（1）斜面培養(yǎng)：吡咯伯克霍爾德氏菌B1213接種于斜面培養(yǎng)基上，在40℃下培養(yǎng)48小時，得斜面菌株。所用斜面培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、瓊脂1.8g、蒸餾水余量，pH為中性，115℃滅菌20min。（2）取斜面菌株接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在175rpm、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液。所述種子培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、瓊脂粉15g、酵母提取物5g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌25min。（3）將5.0mg的NAP以無菌操作加入含有50mL的改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的搖瓶中，將吡咯伯克霍爾德氏菌B1213的種子培養(yǎng)液以1mL的接種量接種到搖瓶中，在175r/min、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)72h；得發(fā)酵液。所述改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：酵母提取物5g、硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌15min。實施例3NAP標準曲線制定與含量測定（1）以正己烷為溶劑配制400mg/L的萘母液，分別稀釋20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、80倍、100倍、200倍以備用，取2.5mL不同稀釋倍數(shù)的萘溶液置于3mL石英比色皿中，用紫外分光光度計分別測定275nm波長下的吸光值，并以吸光值為縱坐標，萘的濃度作為橫坐標繪制標準曲線；標準曲線如圖2所示；進而獲得吸光值-濃度方程：y=0.0424x-0.0033，x為萘的濃度，y為吸光值。（2）取2.5mL實施例2獲得的發(fā)酵液置于3mL石英比色皿中，用紫外分光光度計分別測定275nm波長下的吸光值；然后根據(jù)吸光值-濃度方程計算出萘的濃度。（3）降解率的計算公式：降解率%=(C0-C)/C0*100%，C0為用吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解之前的NAP質(zhì)量濃度（mg/L）（即實施例2步驟（3）發(fā)酵之前搖瓶中混合液的NAP質(zhì)量濃度89.29mg/L）中，C為發(fā)酵液中的NAP殘留濃度（mg/L）。經(jīng)計算，實施例2的降解率為94.05%。實施例4吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解萘的優(yōu)化將實施例2步驟（3）中的種子液接種量依次改為2、3、4、5、6mL，其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發(fā)酵液的NAP濃度，進而計算NAP的降解率。在不同接種量條件下，NAP降解率如表1所示。實施例5吡咯伯克霍爾德氏菌B1213降解萘的優(yōu)化將實施例2步驟（3）中所用改良BSM基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基的酵母提取物的含量依次修改為2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L；其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發(fā)酵液的NAP濃度，進而計算NAP的降解率。在不同酵母提取物的含量條件下，NAP降解率如表2所示。表1種子液接種量（mL）NAP降解率（%）00194.05295.6396.6496.81596.9696.6；表2酵母提取物的含量（g/L）NAP降解率（%）00292.45393.25493.15594.05695.12796.36896.78996.711096.89<110>北京工商大學<120>吡咯伯克霍爾德氏菌的應(yīng)用及其降解萘的方法<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>2ACGGTTACCTTGTTACGACTT21<210>3<211>1411<212>DNA<213>人工合成<400>3ACATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAG60TAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCG120CATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGAT180GGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTG240AGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG300TGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG360CCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGCTCTAATACAGTCGGGG420GATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG480TAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAG540ACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGT600ATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAAT660ACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGA720GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGG780GATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCG840CAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTA900ATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCCGCTGAGAGG960TGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC1020GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAG1080AGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCT1140CATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAA1200CCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTC1260GAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTC1320CCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAG1380TCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTA1411<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4TgACCgCCgAgAAgAgCAA19<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5CTCTTCTTCgTCCATCgCCTC21<210>6<211>974<212>DNA<213>人工合成<400>6TCATGCGCATGGGCGACGGCGAGGCGGCCGAAGACATCCAGGTCGTCTCCACGGGTTCGC60TGGGGCTCGACATCGCGCTTGGCGTCGGCGGCTGCCGCGCGGCCGGGTGGTCGAGATCTA120CGGCCCGGAATCGTCCGGTAAAACCACGCTCACGCTGCAGGTCATCGCCGAACTGCAGAA180GATCGGCGGCACGGCCGCGTTCATCGACGCCGAACACGCGCTCGACGTTCAATATGCGTC240GAAGCTCGGCGTGAACGTGCCGGAACTGCTGATCTCGCAGCCGGACACCGGCGAACAGGC300ACTGGAAATCACCGATGCGCTGGTGCGCTCGGGCTCGGTCGACATGATCGTCATCGACTC360GGTCGCGGCGCTCGTGCCGAAGGCCGAAATCGAAGGCGAGATGGGCGATTCGCTGCCGGG420CCTGCAGGCTCGCCTGATGTCGCAGGCGCTGCGCAAGCTGACCGGCACGATCAAGCGCAC480GAACTGCCTGGTGATCTTCATCAACCAGATTCGCATGAAGATCGGCGTGATGTTCGGCAA540CCCGGAAACCACGACGGGCGGCAACGCGCTGAAGTTCTATGCGTCGGTGCGTCTCGATAT600CCGCCGGATCGGCTCGATCAAGAAGAACGACGAGGTGATCGGCAACGAAACCCGCGTGAA660GGTCGTCAAGAACAAGGTGTCGCCGCCGTTCCGCGAAGCGATCTTCGACATCCTGTATGG720CGAGGGCATTTCGCGTCAGGGCGAGATCATCGATCTCGGCGTGCAGGCAAAGATCGTCGA780CAAGGCGGGCGCCTGGTACAGCTACAACGGCGAGAAGATCGGCCAGGGCAAGGACAACGC840GCGTGAATTCCTGCGCGAGAATCCGGAAATCGCACGCGAGATCGAAAACCGCATCCGCGA900ATCGCTCGGCGTCGTCGCCAAGGCGCTGGCGGCCGCACTCGCGCAGATCGAGAAGCAGTT960CGGCAAAGGGTCGA974當前第1頁1 2 3