本發(fā)明涉及一株同時降解精氨酸和尿素的發(fā)酵乳桿菌，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一種2A類致癌物，被認為是食品中繼黃曲霉毒素之后的又一重要污染物。很多研究者在許多酒飲料和食品中檢測到了氨基甲酸乙酯的存在。自此，發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量受到廣泛關(guān)注。已有報道檢測了不同香型成品白酒中EC的含量，結(jié)果顯示白酒中EC平均含量約為100μg·L^-1，低于150μg·L^-1的國際限量標準。其中，清香型、醬香型、藥香型及特香型白酒中EC含量較低，而濃香型、芝麻香型、鳳香型等白酒中EC含量偏高。

已有報道顯示尿素與乙醇反應可以生成EC；同時發(fā)現(xiàn)葡萄汁發(fā)酵過程中EC的主要來源是由精氨酸分解而來的尿素。范文來、徐巖等也發(fā)現(xiàn)酒醅中尿素和EC的變化趨勢類似，二者之間具有一定的相互關(guān)系。

對發(fā)酵食品中乳酸菌的精氨酸代謝途徑研究，發(fā)現(xiàn)了乳酸菌的精氨酸脫亞胺途徑(arginine deiminasepathway，簡稱ADI途徑)，如下所示。最近，國外許多研究者對葡萄酒MLB的編碼ADI途徑酶的基因(編碼ADI、OTC、CK的基因分別為arcA、arcB、arcC)進行了克隆、測序和表達研究。利用arc基因簇的簡并引物合成的特異性標記探針與MLB的基因進行雜交,檢測到arc基因簇的菌株能降解精氨酸，而缺少arc基因簇的菌株不能降解精氨酸。

L-Arginine+H₂O→L-citrulline+NH₃(ADI)

L-Citrulline+Pi→carbamyl phosphate+L-Ornithine(OTC)

Carbamyl phosphate+ADP→ATP+NH₃+CO₂(CK)

Ough等研究了精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在葡萄酒發(fā)酵過程中對氨基甲酸乙酯形成方面的影響，發(fā)現(xiàn)由氨甲酰磷酸形成的EC含量很少，大部分EC是由精氨酸分解產(chǎn)生的尿素形成的，因此認為尿素是形成氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)。Wang等的研究表明相同條件下，相同時間內(nèi)同濃度尿素比瓜氨酸生成更多EC，且隨著發(fā)酵時間延長，這種差異更大。

采用MiSeq測序技術(shù)和Real-time PCR方法研究醬香型白酒發(fā)酵中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)組成及變化規(guī)律。研究表明乳酸菌是白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌。共得到8個乳酸菌屬，包含31個乳酸菌種，其中22個屬于乳桿菌屬。發(fā)酵酒醅中的乳酸菌群結(jié)構(gòu)中乳桿菌屬的比例達到了90％以上，甚至在發(fā)酵中后期尤其是中下層酒醅中超過了99％。乳酸菌可以直接貢獻乳酸、提供白酒中乳酸乙酯的主要前體。此外，乳酸菌的抑制作用可防止微生物過量生長，有助于穩(wěn)定釀造微生物區(qū)系平衡。然而，針對國內(nèi)對白酒中乳酸菌的研究還僅限于分離鑒定到單菌種、單菌種純培養(yǎng)條件下的發(fā)酵特性研究等，并未有關(guān)于乳酸菌在發(fā)酵過程中對食品安全作用的更深入研究。

因此，獲取能同時降解精氨酸和尿素的乳酸菌，對于以乳酸菌作為主要功能微生物的發(fā)酵食品的生產(chǎn)就顯得尤為重要，對于食品安全具有重要貢獻。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一株能夠同時高效降解精氨酸和尿素的發(fā)酵乳桿菌。

所述發(fā)酵乳桿菌，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12716，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

所述發(fā)酵乳桿菌CGMCC NO.12716是從白酒酒醅中篩選得到的。

所述發(fā)酵乳桿菌CGMCC NO.12716具有如下特性：

(1)本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌在高粱汁培養(yǎng)基中對尿素的降解能力高達1.96mmol·L^-1；

(2)本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌在高粱汁培養(yǎng)基中對精氨酸降解能力高達0.86mmol·L^-1且僅生成極少量的尿素；

(3)代謝物中酸類、醇類、酮類、酚類物質(zhì)的種類豐富；其中雙乙酰、3-羥基-2-丁酮、2-甲氧基苯酚的含量均大于30μg·L^-1，而雙乙酰、3-羥基-2-丁酮、2-甲氧基苯酚在白酒呈香中發(fā)揮一定的作用；其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、2-壬醇和2-十一醇的含量均大于50μg·L^-1，而這些飽和脂肪酸和飽和脂肪醇作為重要的風味化合物都曾在白酒中檢測到。

(4)CGMCC NO.12716于MRS培養(yǎng)基、30℃厭氧發(fā)酵2d后進入穩(wěn)定期，菌體濃度可達OD＝2.4，發(fā)酵液pH 4.3左右，乳酸含量為12g/L左右；發(fā)酵3d的乙酸產(chǎn)量可達6g/L。

本發(fā)明的第二個目的是提供含有所述CGMCC NO.12716菌株的微生物菌劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑含有CGMCC NO.12716菌體的活細胞、冷凍干燥得到的CGMCC NO.12716干菌體、固定化的CGMCC NO.12716細胞、CGMCCNO.12716的液體菌劑、CGMCC NO.12716的固體菌劑，或者以其他任何形式存在的CGMCCNO.12716菌株。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任何可以應用于食品或者食品制備的任意種屬的菌株，比如地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌等等。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任意能用于食品的載體。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述微生物菌劑在食品技術(shù)領(lǐng)域的應用，尤其是應用于發(fā)酵食品技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述CGMCC NO.12716菌株的應用，是應用于食品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是發(fā)酵食品技術(shù)領(lǐng)域。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用，是應用于釀造酒、蒸餾酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黃酒、果酒方面。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用，是將CGMCC NO.12716菌株添加到白酒、葡萄酒、黃酒或者果酒釀造過程中。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌，在高粱汁培養(yǎng)基中對尿素的降解能力高達1.96mmol·L^-1；對精氨酸降解能力高達0.86mmol·L^-1且僅生成極少量的尿素；是目前能同時降解精氨酸和尿素且降解效果最好的發(fā)酵乳桿菌。同時還能夠代謝酸類、醇類、酮類、酚類等物質(zhì)，為白酒提供重要的風味化合物；其于MRS培養(yǎng)基、30℃厭氧發(fā)酵2d后進入穩(wěn)定期，菌體濃度可達OD₆₀₀＝2.4，發(fā)酵液pH 4.3左右，乳酸含量為12g/L左右；發(fā)酵3d的乙酸產(chǎn)量可達6g/L。

生物材料保藏

本發(fā)明所提供的發(fā)酵乳桿菌，分類學命名為發(fā)酵乳桿菌Lactobacillusfermentum，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12716，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

附圖說明

圖1：生長曲線；

圖2：生長過程中pH變化趨勢；

圖3：生長過程中乳酸變化趨勢。

具體實施方式

EC含量測定參照文獻：頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用定量蒸餾酒中氨基甲酸乙酯[J].食品工業(yè)科技,2012,33(14):60-63。

酒醅中尿素含量的測定參照文獻：Jimenez-Martin E,Ruiz J,Perez-Palacios T,et aL.Gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of free amino acids as their dimethyl-tert-butylsilyl(TBDMS)derivatives in animal source food[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2012,60(10):2456-2463。

實施例1：本發(fā)明的乳酸菌對精氨酸、尿素的降解情況

根據(jù)酒醅中精氨酸和尿素檢測結(jié)果設(shè)計代謝實驗中精氨酸添加量為300mg L^-1(高粱汁培養(yǎng)基中本身含有一定的精氨酸，額外添加300mg L^-1后總精氨酸含量約690mg/L，接近真實酒醅中精氨酸含量)，尿素添加量為200mg L^-1。發(fā)酵采用高粱汁對實驗菌株L.diolivorans2-10、L.buchneri N5、L.casei X1、Lpontis JSB7、P.acidilactici JJB1、Lfermentum JSA30及L.plantarum JD19進行精氨酸、尿素的代謝實驗。

實驗及對照組設(shè)定：

空白1：高粱汁培養(yǎng)基按2％接種量接種，不添加精氨酸及尿素；

實驗組1：添加300mg L^-1精氨酸的高粱汁培養(yǎng)基按2％接種量接種；

實驗組2：添加200mg L^-1尿素的高粱汁培養(yǎng)基按2％接種量接種；

其中，實驗菌株是按2％接種量接種到培養(yǎng)基中，30℃下靜置培養(yǎng)72h。測定發(fā)酵起點、發(fā)酵終點的發(fā)酵液中精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、尿素的含量以及活菌數(shù)。

高粱汁培養(yǎng)基：將高粱:水＝1:4(M:V)，加淀粉酶蒸煮液化，60℃加糖化酶糖化，過濾離心，調(diào)節(jié)糖度至10°Bx。

醬香型白酒發(fā)酵過程中篩選得到了多株乳酸菌，其中的7株優(yōu)勢乳酸菌對精氨酸都有一定的代謝能力，但有強有弱，具體結(jié)果見表1。其中L.pontis JSB7、L.fermentum JSA30、L.plantarum JD19、L.buchneri N5、L.casei X1和P.acidilactici JJB1對精氨酸的降解能力較強，均超過0.5mmol·L^-1，而L.diolivorans 2-10對精氨酸的降解能力較弱，只有0.06mmol·L^-1。其中JSA30、JSB7和N5均為專性異型發(fā)酵乳酸菌(Obligatory heterofermentative)，都可以降解精氨酸，存在ADI途徑中的關(guān)鍵酶基因arcA、arcB、arcC，具體見表2。表1中可以看到JD19和X1均能很好的利用精氨酸，且存在arcA基因。JJB1對精氨酸的降解能力雖然也較強，但是其不能降解尿素。

發(fā)明人考察了上述白酒中篩到的對精氨酸和/或尿素代謝能力相對較強的優(yōu)勢乳酸菌對精氨酸和尿素的降解能力。從表1中看出L.fermentum JSA30表現(xiàn)出了突出的尿素降解能力，其次是L.plantarum JD19，L.buchneri N5對尿素的降解能力明顯弱于L.fermentum JSA30和L.plantarum JD19。

表1 7株乳酸菌對精氨酸和尿素的代謝能力

注：“–”表示幾乎沒有含量變化。

表2 7株乳酸菌arc基因存在情況

注：“+”表示在樣品中有檢出相應基因的存在，“–”表示沒有檢測到該基因的存在。

其中L.fermentum JSA30，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12716，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

L.plantarum JD19，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12717，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。實施例2：乳酸菌生理生化特征

將發(fā)酵乳桿菌L.fermentum JSA30接種于MRS培養(yǎng)基，于30℃厭氧發(fā)酵2d后，兩株乳酸菌進入穩(wěn)定期。如圖1所示，發(fā)酵2d后，L.fermentum JSA30的生物量OD₆₀₀可達2.4。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g·L^-1，牛肉膏10.0g·L^-1，酵母膏5.0g·L^-1，檸檬酸氫二銨2.0g·L^-1，葡萄糖20.0g·L^-1，吐溫801.0mL·L^-1乙酸鈉5.0g·L^-1，磷酸氫二鉀2.0g·L^-1，硫酸鎂0.58g·L^-1，硫酸錳0.25g·L^-1，瓊脂18.0g·L^-1。

乳酸菌生長代謝導致環(huán)境pH下降，可能對于釀造體系中其他不耐酸微生物的生長產(chǎn)生抑制，尤其是抑制雜菌生長，從而達到調(diào)控釀造環(huán)境的作用，維持正常發(fā)酵。圖2為乳酸菌生長過程中pH變化趨勢。

酸是白酒中的重要呈味物質(zhì)，它與其他香味物質(zhì)共同構(gòu)成白酒所特有的芳香。含酸量小的酒，酒味寡淡，后味短。適量的酸在酒中能起到緩沖的作用，可消除飲后上頭和口味不諧調(diào)等現(xiàn)象。酸還能促進酒質(zhì)的甜味感。乙酸和乳酸是白酒中含量最大的，其含量對白酒口感影響很大。

兩株乳酸菌主要代謝產(chǎn)物是乳酸，L.fermentum JSA30在生長過程中也產(chǎn)生大量的乳酸。乳酸是白酒主要酸之一，不但影響到白酒的口感，而且也是白酒風味物質(zhì)-乳酸乙酯的前體物質(zhì)，對白酒的品質(zhì)影響重大。由圖3可知，L.fermentum JSA30發(fā)酵2d、3d后乳酸含量分別達12g/L、14g/L。

L.fermentum JSA30是異型乳酸菌，發(fā)酵糖類除產(chǎn)乳酸外，還能夠產(chǎn)生乙酸、CO₂等其他代謝產(chǎn)物。L.fermentum JSA30發(fā)酵3d后乙酸產(chǎn)量為6g/L。

實施例3：菌株的應用

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：稱250g高粱，加入350mL蒸餾水，于70-80℃培養(yǎng)箱中浸泡24h。將水瀝干，稱取500g高粱于真空袋中，再加入25mL蒸餾水。121℃，滅菌20min。加酶糖化1d。

對照組：在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10wt％的高溫大曲，30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵6d。

實驗組：將保藏編號為CGMCC NO.12716的發(fā)酵乳桿菌的種子液以終濃度10⁷CFU/g酒醅的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，并接種10wt％的大曲，放置30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵6d。

結(jié)果顯示，實驗組得到的發(fā)酵物中，尿素的降低量為對照組的2倍以上，精氨酸的降低量遠遠大于對照組。而且，實驗組得到的產(chǎn)品風味更佳優(yōu)良。

可以理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護范圍。