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神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法與流程

文檔序號:12166943閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種基于外周血單核細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液,其特征在于,所述培養(yǎng)液包括:體積比為1:0.8~1.2的DMEM/F12培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以及腺苷酸環(huán)化酶激活劑、血清替代物、L-抗壞血酸、L-谷氨酰胺衍生物、ALK抑制劑、GSK-3抑制劑、ALK-2,3,6,AMPK抑制劑和ALK-4,5,7抑制劑。

2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液,其特征在于,所述腺苷酸環(huán)化酶激活劑為毛喉素;所述L-谷氨酰胺衍生物為GlutaMAX-I二肽;所述血清替代物為N2和/或B27;所述ALK抑制劑為LDK378和/或GSK1838705A;所述GSK-3抑制劑為CHIR-98014、CHIR-99021HCl和/或SB216763;所述ALK-2,3,6,AMPK抑制劑為Dorsomorphin、Dorsomorphin 2HCl和/或LDN-193189;所述ALK-4,5,7抑制劑為A83-01和/或SB431542。

3.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)液,其特征在于,所述腺苷酸環(huán)化酶激活劑濃度為3~8μmol/L,所述血清替代物濃度為3~9mmol/L,L-抗壞血酸濃度為0.06~0.15mmol/L,所述L-谷氨酰胺衍生物濃度為5~15mmol/L,所述ALK抑制劑濃度為1~3mmol/L,所述GSK-3抑制劑濃度為0.55~0.65mmol/L,所述ALK-2,3,6,AMPK抑制劑濃度為1.5~2.5mmol/L,所述ALK-4,5,7抑制劑濃度為1.6~2.7mmol/L。

4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)液,其特征在于,DMEM/F12培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比為1:1,所述腺苷酸環(huán)化酶激活劑濃度為4~6μmol/L優(yōu)選5μmol/L,所述血清替代物濃度為5~7mmol/L優(yōu)選6mmol/L,L-抗壞血酸濃度為0.08~0.12mmol/L優(yōu)選0.1mmol/L,所述L-谷氨酰胺衍生物濃度為8~12mmol/L優(yōu)選10mmol/L,所述ALK抑制劑濃度為1.6~2.2mmol/L優(yōu)選2mmol/L,所述GSK-3抑制劑濃度為0.58~0.62mmol/L優(yōu)選0.60mmol/L,所述ALK-2,3,6,AMPK抑制劑濃度為1.8~2.3mmol/L優(yōu)選2mmol/L,所述ALK-4,5,7抑制劑濃度為2.0~2.2mmol/L優(yōu)選2mmol/L。

5.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)液,其特征在于,其還包括青霉素和/或鏈霉素,青霉素的濃度為50~300μg/mL優(yōu)選100~150μg/mL更優(yōu)選100μg/mL,鏈霉素的濃度為50~400μg/mL優(yōu)選100~200μg/mL更優(yōu)選100μg/mL。

6.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)液,其特征在于,其還包括視黃酸,視黃酸濃度范圍為0.05~0.15mmol/L優(yōu)選0.09~0.12mmol/L更優(yōu)選0.1mmol/L。

7.一種由外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)用權(quán)利要求1~6任一項所述的培養(yǎng)液對外周血單核細(xì)胞進行定向分化培養(yǎng)得到原代培養(yǎng)物;

2)原代培養(yǎng)物用所述培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)4~6代得到神經(jīng)干細(xì)胞。

8.如權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于:

步驟1)具體為,于35~39℃優(yōu)選37℃、3~7%優(yōu)選5%CO2條件下,用所述培養(yǎng)液對外周血單核細(xì)胞進行定向分化培養(yǎng)4~6天,移除未貼壁的細(xì)胞,定向分化培養(yǎng)期間每1~2天優(yōu)選2天更換一次培養(yǎng)液;再用所述培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2~6天得到原代培養(yǎng)物,繼續(xù)培養(yǎng)期間所述培養(yǎng)液1~2天優(yōu)選1天更換一次;

步驟2)具體為,將步驟1)得到的原代培養(yǎng)物消化下來,于35~39℃優(yōu)選37℃、3~7%優(yōu)選5%CO2條件下用所述培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)4~5代得到神經(jīng)干細(xì)胞。

9.如權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法,其特征在于,所述外周血單核細(xì)胞用Ficoll-Paque密度梯度離心法分離患者血樣得到。

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