本發(fā)明屬于干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基和方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有高度分化潛能的干細(xì)胞，因能分化為間質(zhì)組織而得名。MSCs主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，具有高度的分化功能和免疫調(diào)控功能，能夠分泌多種細(xì)胞因子，是繼造血干細(xì)胞之后細(xì)胞治療臨床應(yīng)用研究最多，也是相對較為成熟的一種成體干細(xì)胞。MSCs可以向多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞分化，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及多種血管內(nèi)皮細(xì)胞，甚至神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。

從1995年首次報道MSCs應(yīng)用于臨床試驗開始，國內(nèi)外已將MSCs應(yīng)用于臨床治療移植物抗宿主病(GVHD)、充血性心衰及心梗、脊髓損傷、2型糖尿病、骨和軟骨損傷、燒傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森病等。但由于直接從人體獲得的MSCs數(shù)量有限，要達(dá)到臨床應(yīng)用的細(xì)胞數(shù)量級，必須經(jīng)過體外的擴(kuò)增培養(yǎng)。而在體外培養(yǎng)的過程中，適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)體系是MSCs培養(yǎng)效率和安全性的關(guān)鍵。選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)體系才能保證MSCs在經(jīng)過數(shù)次傳代培養(yǎng)后，基因型與表型保持穩(wěn)定。常用的MSCs體外培養(yǎng)體系由DMEM基本培養(yǎng)基和胎牛血清構(gòu)成。但在培養(yǎng)過程中，血清蛋白和其他血清活性成分容易殘留在細(xì)胞的胞漿中，給患者帶來潛在過敏反應(yīng)的風(fēng)險，因此臨床用MSCs必需采用無血清培養(yǎng)基。

無血清培養(yǎng)基(Serum-Free Media，SFM)，顧名思義，就是在細(xì)胞培養(yǎng)中不需要添加血清，但是在某些應(yīng)用中可能要添加生長因子或細(xì)胞因子。無血清培養(yǎng)基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素等，能減少血清帶來的不利因素，使細(xì)胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)體系成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可簡化純化和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序，避免病毒污染造成的危害。

近年國內(nèi)外均有報道，多種臨床用細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC細(xì)胞等的體外培養(yǎng)，對培養(yǎng)體系中的特殊細(xì)胞因子均有不同要求，需要針對不同的細(xì)胞類型進(jìn)行定制化培養(yǎng)。而體外培養(yǎng)臨床研究用MSCs時，除需添加特殊的細(xì)胞因子保持MSCs的形態(tài)及功能穩(wěn)定外，還需要各類粘附貼壁因子如纖連蛋白等特殊的成分以保持MSCs在體外環(huán)境的充分生長。市場中現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)基，如STEMCELL的MESENCULT、LONZA的MSCGM-CD、GIBICO的STEMPRO MSC SFM CTS、PAN的POWERSTEM MSC1等，普遍采用大量昂貴的重組纖連蛋白加入培養(yǎng)基或包被培養(yǎng)皿以保證MSCs在體外的生長，該方法不僅成本較高，而且操作流程復(fù)雜且生物安全性難以保障。同時，由于市售通用型的無血清培養(yǎng)基未對臨床用MSCs進(jìn)行定制優(yōu)化，故未能最大化的保證體外培養(yǎng)數(shù)代后的MSCs表型以及功能的穩(wěn)定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基和方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)效果不理想、成本高的問題。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DKK-1、凝血酶、纖粘連蛋白、人血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、白血病抑制因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、硝酸鐵、亞硒酸鈉、硫酸銅和硫酸鋅、維生素E、還原性谷胱甘肽、氫化可的松、孕酮、抗壞血酸磷酸酯、乙醇胺、亞油酸、膽固醇和半乳糖。

優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12或L-DMEM。

優(yōu)選的，在上述無血清培養(yǎng)基中每毫升所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含：DKK-1 10-1000ng、凝血酶0.1-0.4IU、纖粘連蛋白10-100ng、人血白蛋白1-50μg、轉(zhuǎn)鐵蛋白10-200ng、堿性成纖維細(xì)胞生長因子1-100ng、血小板衍生生長因子1-100ng、胰島素樣生長因子1-100μg、白血病抑制因子1-50ng、表皮生長因子1-10ng、轉(zhuǎn)化生長因子-β1-10ng、硝酸鐵0.1-1μg、亞硒酸鈉0.01-0.1μg、硫酸銅0.001-0.1μg、硫酸鋅0.1-5μg、維生素E 1-10ng、還原性谷胱甘肽1-10μg、氫化可的松1-100μg、孕酮1-100nmol、抗壞血酸磷酸酯1-10μg、乙醇胺1-10μg、亞油酸1-10μg、膽固醇1-10μg和半乳糖10-50μg。

更優(yōu)選的，在上述無血清培養(yǎng)基中每毫升所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含：DKK-1 200ng、凝血酶0.2IU、纖粘連蛋白50ng、人血白蛋白2μg、轉(zhuǎn)鐵蛋白50ng、堿性成纖維細(xì)胞生長因子5ng、血小板衍生生長因子10ng、胰島素樣生長因子10μg、白血病抑制因子8ng、表皮生長因子2ng、轉(zhuǎn)化生長因子-β1ng、硝酸鐵0.1μg、亞硒酸鈉0.01μg、硫酸銅0.001μg、硫酸鋅0.5μg、維生素E 1ng、還原性谷胱甘肽1.5μg、氫化可的松10μg、孕酮20nmol、抗壞血酸磷酸酯2.5μg、乙醇胺1μg、亞油酸0.2μg、膽固醇2μg和半乳糖20μg。

本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括：將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于上述無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的條件為37℃和體積濃度為5％的CO₂。

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，針對MSCs體外培養(yǎng)定制化地對基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-L或DMEM/F12及多種添加成分進(jìn)行了復(fù)配，使得培養(yǎng)基中各組分之間起到了協(xié)同增效的作用；尤其是DKK-1的使用，極大改善了體外培養(yǎng)MSCs的穩(wěn)定性及成功率，而且還采用了無動物源成分的配方，提高了所培養(yǎng)細(xì)胞在臨床研究中的安全性。與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明培養(yǎng)基極大地提高了體外培養(yǎng)MSCs的增值效率，維持了MSCs的細(xì)胞生長形態(tài)及其細(xì)胞表型穩(wěn)定，為臨床應(yīng)用中的MSCs培養(yǎng)提供了新型的高效穩(wěn)定安全的培養(yǎng)體系，具有很高的科研和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為實施例3中MSCs的細(xì)胞生長曲線；

圖2為實施例3中MSCs的細(xì)胞形態(tài)測定結(jié)果，其中，左圖為實驗組MSCs的光學(xué)顯微鏡照片，右圖為對照組2MSCs的光學(xué)顯微鏡照片；

圖3為實施例3中MSCs細(xì)胞ROS生成的檢測結(jié)果，左圖為實驗組MSCs的熒光顯微照片，右圖為對照組2中MSCs的熒光顯微照片。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DKK-1、凝血酶、纖粘連蛋白、人血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、白血病抑制因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、硝酸鐵、亞硒酸鈉、硫酸銅和硫酸鋅、維生素E、還原性谷胱甘肽、氫化可的松、孕酮、抗壞血酸磷酸酯、乙醇胺、亞油酸、膽固醇和半乳糖。

本發(fā)明培養(yǎng)基中無任何動物血清，不會帶來任何支原體和病毒。在本發(fā)明中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為DMEM/F12或L-DMEM，更優(yōu)選為DMEM/F12。其中，L-DMEM為低糖型的DMEM培養(yǎng)基。本發(fā)明對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基即可，如采用其市售商品。

DKK(Dickkopf)是一種分泌型糖蛋白，包括DKK-1～4四個成員。在本發(fā)明中，DKK-1優(yōu)選為人重組DKK-1。本發(fā)明對DKK-1的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DKK-1即可，如采用其市售商品。

凝血酶是一種多功能的絲氨酸蛋白酶，不僅能通過調(diào)節(jié)血小板聚集促進(jìn)凝血過程，還能通過凝血酶受體激發(fā)多種細(xì)胞產(chǎn)生許多不同的生物學(xué)反應(yīng)，如趨化作用、促細(xì)胞增殖、促胞外基質(zhì)合成和釋放細(xì)胞因子。在本發(fā)明中，凝血酶能促進(jìn)MSCs分泌纖粘連蛋白，促進(jìn)MSCs自身分泌細(xì)胞外基質(zhì)和增殖，促進(jìn)MSCs增殖及其貼壁生長。本發(fā)明對凝血酶的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的凝血酶即可，如采用其市售商品。

在本發(fā)明中，纖粘連蛋白、人血白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白均優(yōu)選為人重組蛋白。本發(fā)明培養(yǎng)基中添加了較為全面的細(xì)胞因子組合，優(yōu)選為堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、白血病抑制因子、表皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子。在本發(fā)明中，所添加的生長因子組合優(yōu)選為人重組細(xì)胞因子。本發(fā)明培養(yǎng)基中還包含微量元素組合和脂類，微量元素組合優(yōu)選為硝酸鐵、亞硒酸鈉、硫酸銅和硫酸鋅，脂類優(yōu)選為膽固醇和亞油酸。DKK-1、凝血酶、蛋白、細(xì)胞生長因子組合、微量元素組合、脂類、乙醇胺、孕酮、抗壞血酸磷酸酯、維生素E、半乳糖、還原性谷胱甘肽和氫化可的松協(xié)同增效，共同促進(jìn)MSCs的增殖。本發(fā)明對蛋白、細(xì)胞生長因子組合、微量元素組合、脂類、乙醇胺、孕酮、抗壞血酸磷酸酯、維生素E、半乳糖、還原性谷胱甘肽和氫化可的松的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的即可，如采用其市售商品。

本發(fā)明的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)：采用更為全面的細(xì)胞因子組合，微量元素組合等，并突破性的添加對維持MSCs表型及功能具有重要作用的DKK-1，以及促進(jìn)MSCs分泌纖連蛋白的凝血酶，可以極大的改善現(xiàn)有MSCs無血清體外培養(yǎng)過程中存在的穩(wěn)定性及安全性等諸多問題，使所培養(yǎng)的MSCs更適用于在臨床中使用。

進(jìn)一步的，在本發(fā)明所提供的無血清培養(yǎng)基中每毫升所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含：DKK-1 10-1000ng，凝血酶0.1-0.4IU、纖粘連蛋白10-100ng、人血白蛋白1-50μg、轉(zhuǎn)鐵蛋白10-200ng、堿性成纖維細(xì)胞生長因子1-100ng、血小板衍生生長因子1-100ng、胰島素樣生長因子1-100μg、白血病抑制因子1-50ng、表皮生長因子1-10ng、轉(zhuǎn)化生長因子-β1-10ng、硝酸鐵0.1-1μg、亞硒酸鈉0.01-0.1μg、硫酸銅0.001-0.1μg、硫酸鋅0.1-5μg、維生素E 1-10ng、還原性谷胱甘肽1-10μg、氫化可的松1-100μg、孕酮1-100nmol、抗壞血酸磷酸酯1-10μg、乙醇胺1-10μg、亞油酸1-10μg、膽固醇1-10μg和半乳糖10-50μg。

更進(jìn)一步的，在上述間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中每毫升所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含：DKK-1 200ng、凝血酶0.2IU、纖粘連蛋白50ng、人血白蛋白2μg、轉(zhuǎn)鐵蛋白50ng、堿性成纖維細(xì)胞生長因子5ng、血小板衍生生長因子10ng、胰島素樣生長因子10μg、白血病抑制因子8ng、表皮生長因子2ng、轉(zhuǎn)化生長因子-β1ng、硝酸鐵0.1μg、亞硒酸鈉0.01μg、硫酸銅0.001μg、硫酸鋅0.5μg、維生素E 1ng、還原性谷胱甘肽1.5μg、氫化可的松10μg、孕酮20nmol、抗壞血酸磷酸酯2.5μg、乙醇胺1μg、亞油酸0.2μg、膽固醇2μg和半乳糖20μg。

本發(fā)明所提供的無血清培養(yǎng)基的配制可采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-L或DMEM/F12和多種添加成分進(jìn)行了復(fù)配，所有配置過程可按照現(xiàn)有常規(guī)完全培養(yǎng)基的配制條件及方法進(jìn)行配制。

在本發(fā)明的一些實施例中，所述無血清培養(yǎng)基優(yōu)選按照以下方法制得：

將L-DMEM或DMEM/F12干粉，使用超純水溶解至800-900mL，按配方稱取其他組分，依次添加至溶解好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并在室溫充分?jǐn)嚢枞芙猓罱K使用超純水將完全培養(yǎng)基定容至1000mL，采用0.22-0.1μm濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，步驟為：將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于上述無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

本發(fā)明對所述間充質(zhì)干細(xì)胞的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的間充質(zhì)干細(xì)胞即可，包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。如果可以采用市售商品，也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備間充質(zhì)干細(xì)胞的技術(shù)方案自行制備。

下面將結(jié)合本發(fā)明具體說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行修改或者對部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。

實施例1

1、配方

2、配制

稱量各組分，將10g L-DMEM干粉溶解于800mL超純水中，然后往其中添加其余各組分，室溫下使用磁力攪拌器使其充分溶解后加入超純水定容至1L，再用0.22μm孔徑濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2

1、配方

2、配制

稱量各組分，將10g DMEM/F12干粉溶解于800mL超純水中，然后往其中添加其余各組分，室溫下使用磁力攪拌器使其充分溶解后加入超純水定容至1L，再用0.22μm孔徑濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例3

1、配方

2、配制

稱量各組分，將10g L-DMEM干粉溶解于800mL超純水中，然后往其中添加其余各組分，室溫下使用磁力攪拌器使其充分溶解后加入超純水定容至1L，再用0.22μm孔徑濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例4

1、配方

2、配制

稱量各組分，將10g DMEM/F12干粉溶解于800mL超純水中，然后往其中添加其余各組分，室溫下使用磁力攪拌器使其充分溶解后加入超純水定容至1L，再用0.22μm孔徑濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例5

1、配方

2、配制

稱量各組分，將10g L-DMEM干粉溶解于800mL超純水中，然后往其中添加其余各組分，室溫下使用磁力攪拌器使其充分溶解后加入超純水定容至1L，再用0.22μm孔徑濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例6

1、配方

2、配制

稱量各組分，將10g DMEM/F12干粉溶解于800mL超純水中，然后往其中添加其余各組分，室溫下使用磁力攪拌器使其充分溶解后加入超純水定容至1L，再用0.22μm孔徑濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例7

1、受試培養(yǎng)基

實驗組選擇實施例1所提供的培養(yǎng)基；對照組1選擇添加了10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基；對照組2選擇添加了購于PALL的Ultroser G血清替代物的DMEM/F12培養(yǎng)基。

2、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的選取及其培養(yǎng)

選取第3代的人臍帶MSCs進(jìn)行復(fù)蘇，并轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)采用標(biāo)準(zhǔn)的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并置于37℃及5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。首次復(fù)蘇2日后進(jìn)行換液，之后每3日進(jìn)行換一次液直至細(xì)胞融合度達(dá)到約70％時進(jìn)行細(xì)胞傳代。

3、細(xì)胞周期的確定

分別收集第5代MSCs和第10代MSCs，經(jīng)消化及PBS漂洗3次后使用70％的預(yù)冷乙醇進(jìn)行固定，并在4℃靜置16小時后添加PI(碘化丙啶)及RNaseA，4℃孵育30分鐘后上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，每組設(shè)5次重復(fù)，記錄G0/G1期、G2/M期及S期的比例，其中重點對比G0/G1期細(xì)胞的比例。表1為流式細(xì)胞檢測結(jié)果，結(jié)果顯示使用本發(fā)明培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的MSCs具有較高的G0/G1期細(xì)胞比例，表明應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)的MSCs能夠保持較長時間的細(xì)胞生長和較高的分化能力。

表1

4、細(xì)胞生長曲線的測定

收集培養(yǎng)至第5代的MSCs，經(jīng)消化及計數(shù)后，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔含1000個細(xì)胞，每組設(shè)5個孔，隨后每隔24小時對各組細(xì)胞進(jìn)行換液，換液時每孔添加100μL DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10μL MTT(5mg/ml)，然后重新置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4h后取出，每孔加入100μL SDS-HCL溶液并混勻，于室溫避光放置4h后使用分光光度讀板機(jī)測定570nm的讀值并作圖。圖1為MSCs體外培養(yǎng)第一天至第八天的生長曲線，如圖1結(jié)果所示，使用本發(fā)明培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的MSCs生長速度明顯優(yōu)于對照組。

5、細(xì)胞形態(tài)的測定

收集第5代MSCs繼續(xù)培養(yǎng)24小時后進(jìn)行顯微鏡觀察，對比實驗組和對照組2的MSCs細(xì)胞形態(tài)及其貼壁狀態(tài)。圖2為P5代MSCs的細(xì)胞形態(tài)測定結(jié)果，其中左圖為實驗組MSCs的光學(xué)顯微鏡照片，右圖為對照組2中MSCs的光學(xué)顯微鏡照片，結(jié)果顯示使用本發(fā)明培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)及貼壁程度明顯優(yōu)于對照組2。

6、細(xì)胞ROS生成的測定

收集培養(yǎng)至第10代的MSCs傳代并接種于預(yù)置圓形蓋玻片的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)至約70％細(xì)胞融合度時進(jìn)行免疫熒光染色。根據(jù)貼壁細(xì)胞免疫熒光染色的常規(guī)方法，將貼于蓋玻片的細(xì)胞使用PBS進(jìn)行清洗并使用4％甲醛于室溫固定10分鐘，隨后使用PBS清洗3次并使用封閉抗體在室溫封閉1小時。清洗后的蓋玻片將使用ROS抗體在4℃染色過夜，隨后使用綠色熒光二抗于室溫避光孵育1小時。蓋玻片經(jīng)清洗后反轉(zhuǎn)將細(xì)胞一面貼于載玻片上使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。由于ROS的大量表達(dá)將導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞的死亡及形態(tài)功能發(fā)生變化，故產(chǎn)生ROS較低的一組細(xì)胞較優(yōu)。圖3為MSCs細(xì)胞ROS生成的檢測結(jié)果，左圖為實驗組MSCs的熒光顯微照片，右圖為對照組2中MSCs的熒光顯微照片，結(jié)果顯示使用本發(fā)明培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞產(chǎn)生的ROS含量明顯低于對照組2。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。