本發(fā)明屬于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞，包括神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。而利用轉(zhuǎn)分化技術(shù)可實(shí)現(xiàn)NSCs在體外大量繁殖、自我更新及多向分化。而從人體(如中樞神經(jīng)系統(tǒng))分離得到的少量NSCs通過增殖達(dá)到一定濃度和標(biāo)準(zhǔn)移植入人體后，在體內(nèi)微環(huán)境的影響下，可分化為相應(yīng)的NSCs，使受損的神經(jīng)的功能得到修復(fù)，而且植入的NSCs可以向神經(jīng)病變部位遷移和聚焦，促進(jìn)宿主神經(jīng)系統(tǒng)受損功能的恢復(fù)。這些使得神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的治療有了新的策略方向，NSCs的研究已成為治療神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)損傷的熱點(diǎn)。另外，NSCs也成為了生物醫(yī)學(xué)工程以及體外模型研究中所必須的種子細(xì)胞。

NSCs的來源主要包括以下幾種：

胚胎源NSCs：包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)誘導(dǎo)分化得到的NSCs和胚胎來源的NSCs。誘導(dǎo)分化得到的NSCs與直接分離培養(yǎng)得到的NSCs有相似的能力，能在體外擴(kuò)增、穩(wěn)定傳代，可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。體外誘導(dǎo)人ESCs分化為NSCs，為帕金森病肌萎縮側(cè)索硬化癥、腦和神經(jīng)損傷等疾病的治療帶來了希望，成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。胚胎來源的NSCs被應(yīng)用于移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，通過移植NSCs至神經(jīng)受損部位來治療脊髓損傷、肌肉萎縮等神經(jīng)損傷引起的疾病。但是人胚NSCs來源十分有限，目前主要是從流產(chǎn)人胚胎組織中獲取，一直受到爭議。另外，免疫排斥及致癌作用一直限制其使用。因此，胚胎源NSCs應(yīng)用于臨床在來源及效果方面也有很大的障礙。

成體腦源NSCs：腦組織是NSCs的主要來源，胚胎腦和成體腦組織均能分離得到NSCs。然而胚胎腦組織獲取NSCs需要分離流產(chǎn)的人胚腦組織，來源及倫理都受到限制。而成體腦組織由于技術(shù)限制，難以從自體或異體獲取，阻礙了NSCs的臨床應(yīng)用。

成體脊髓源性NSCs：NSCs可以從脊髓中直接分離得到，原代培養(yǎng)的脊髓NSCs在體外可生長為細(xì)胞球，誘導(dǎo)分化時貼壁較快，可形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，脊髓源性NSCs雖有多向分化潛能，但分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的潛能最大。

其它的還有骨髓源性NSCs、臍血源性NSCs、脂肪源性NSCs等，限制性因素也較多。

綜上NSCs的來源往往受到現(xiàn)有技術(shù)或倫理的限制，從而影響NSCs在臨床中治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的應(yīng)用和研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中NSCs的來源受到限制的技術(shù)問題，目的在于提供一種無來源限制，可避免道德爭議的基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化培養(yǎng)液和增殖培養(yǎng)液。

本發(fā)明的基于外周血單核細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液包括：體積比為1:0.8～1.2的DMEM/F12培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal medium)，以及腺苷酸環(huán)化酶激活劑、血清替代物、L-抗壞血酸、L-谷氨酰胺衍生物、ALK抑制劑、GSK-3抑制劑、ALK-2,3,6,AMPK抑制劑和ALK-4,5,7抑制劑。

所述培養(yǎng)液的各組分可協(xié)同誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞。其中，DMEM/F12和神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合作為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，DMEM/F12含有體積比為1:1的DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分豐富；而神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為神經(jīng)細(xì)胞生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。所述腺苷酸環(huán)化酶激活劑選用毛喉素(Forskolin，購自MedChem Express)，用于通透細(xì)胞，激活腺苷酸環(huán)化酶，從而升高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平。所述血清替代物可選用N2和/或B27，用于神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)中有絲分裂后期神經(jīng)元的生長和表達(dá)。L-抗壞血酸作為培養(yǎng)基中的生長因子。所述L-谷氨酰胺衍生物為GlutaMAX-I二肽(購自Thermo Fisher Scientific)作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。所述ALK抑制劑可選用LDK378(5-氯-N2-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(哌啶-4-基)苯基)-N4-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-2,4-二胺，又稱色瑞替尼，英文名Ceritinib，CAS號為1032900-25-6)和/或GSK1838705A(2-[[2-[[1-[2-(二甲胺基)乙?；鵠-5-甲氧基-2,3-二氫吲哚-6-基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-基]氨基]-6-氟-N-甲基苯甲酰胺，CAS號為1116235-97-2)，作用于IGF-1R(胰島素樣生長因子1受體)和InsR(胰島素受體)。所述GSK-3抑制劑可選用CHIR-98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-二氨基吡啶，CAS號為252935-94-7)、CHIR-99021HCl(6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-氨基)乙胺基)煙腈鹽酸鹽，CAS號為252917-06-9)和/或SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮，CAS號為280744-09-4)。所述ALK-2,3,6,AMPK抑制劑可選用Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶，CAS號為866405-64-3)、Dorsomorphin 2HCl和/或LDN-193189(6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-A]嘧啶，CAS號為1062368-24-4)。所述ALK-4,5,7抑制劑可選用A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-苯基-4-(4-喹啉)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺，CAS號為909910-43-6)和/或SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧戊環(huán)-5-基)-5-(2-吡啶基)-咪唑-2-苯甲酰胺，CAS號為301836-41-9)。

所述腺苷酸環(huán)化酶激活劑濃度為3～8μmol/L，所述血清替代物濃度為3～9mmol/L，L-抗壞血酸濃度為0.06～0.15mmol/L，所述L-谷氨酰胺衍生物濃度為5～15mmol/L，所述ALK抑制劑濃度為1～3mmol/L，所述GSK-3抑制劑濃度為0.55～0.65mmol/L，所述ALK-2,3,6,AMPK抑制劑濃度為1.5～2.5mmol/L，所述ALK-4,5,7抑制劑濃度為1.6～2.7mmol/L。

進(jìn)一步的，DMEM/F12培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比優(yōu)選1:1，所述腺苷酸環(huán)化酶激活劑濃度優(yōu)選4～6μmol/L更優(yōu)選5μmol/L，所述血清替代物濃度優(yōu)選5～7mmol/L更優(yōu)選6mmol/L，L-抗壞血酸濃度優(yōu)選0.08～0.12mmol/L更優(yōu)選0.1mmol/L，所述L-谷氨酰胺衍生物濃度優(yōu)選8～12mmol/L更優(yōu)選10mmol/L，所述ALK抑制劑濃度優(yōu)選1.6～2.2mmol/L更優(yōu)選2mmol/L，所述GSK-3抑制劑濃度優(yōu)選0.58～0.62mmol/L更優(yōu)選0.60mmol/L，所述ALK-2,3,6,AMPK抑制劑濃度優(yōu)選1.8～2.3mmol/L更優(yōu)選2mmol/L，所述ALK-4,5,7抑制劑濃度優(yōu)選2.0～2.2mmol/L更優(yōu)選2mmol/L。

本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中，其還包括青霉素和/或鏈霉素，青霉素的濃度為50～300μg/mL優(yōu)選100～150μg/mL更優(yōu)選100μg/mL，鏈霉素的濃度為50～400μg/mL優(yōu)選100～200μg/mL更優(yōu)選100μg/mL。

本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中，其還包括視黃酸，用于調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)定向分化作用，視黃酸濃度范圍為0.05～0.15mmol/L優(yōu)選0.09～0.12mmol/L更優(yōu)選0.1mmol/L。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

1)用所述培養(yǎng)液對外周血單核細(xì)胞進(jìn)行定向分化培養(yǎng)得到原代培養(yǎng)物；

2)原代培養(yǎng)物用所述培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)4～6代得到神經(jīng)干細(xì)胞。

本發(fā)明的一較佳實(shí)施例的所述方法中，步驟1)具體為，于35～39℃優(yōu)選37℃、3～7％優(yōu)選5％CO₂條件下，用所述培養(yǎng)液對外周血單核細(xì)胞進(jìn)行定向分化培養(yǎng)4～6天，移除未貼壁的細(xì)胞，定向分化培養(yǎng)期間每1～2天優(yōu)選2天更更換一次培養(yǎng)液；再用所述培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2～6天得到原代培養(yǎng)物，繼續(xù)培養(yǎng)期間所述培養(yǎng)液1～2天優(yōu)選1天更換一次；

步驟2)具體為，將步驟1)得到的原代培養(yǎng)物消化下來，于35～39℃優(yōu)選37℃、3～7％優(yōu)選5％CO₂條件下用所述培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)4～5代得到神經(jīng)干細(xì)胞。

所述外周血單核細(xì)胞用Ficoll-Paque密度梯度離心法分離患者血樣得到。

對培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過進(jìn)行細(xì)胞類型鑒定后，包括神經(jīng)干細(xì)胞特征性蛋白表達(dá)(免疫熒光)及細(xì)胞純度(流式細(xì)胞儀)的鑒定，即可低溫貯藏或者用于醫(yī)學(xué)研究。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：使用所述培養(yǎng)液，經(jīng)所述培養(yǎng)方法，可將外周血單核細(xì)胞定向分化培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)得到純度較高的神經(jīng)干細(xì)胞。一方面取材方便，所述外周血單核細(xì)胞可取自患者血液，且無數(shù)量限制，可避免道德爭議；另一方面，與現(xiàn)有的動物模型相比，本發(fā)明培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞提供了最接近人體的體外細(xì)胞模型，降低了或無免疫排斥反應(yīng)。

附圖說明

圖1為外周血單核細(xì)胞的顯微鏡照片；

圖2為實(shí)施例1培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的顯微鏡照片；

圖3為實(shí)施例1培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的免疫熒光的顯微鏡照片；

圖4為實(shí)施例2培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的免疫熒光的顯微鏡照片；

圖5為實(shí)施例3培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的免疫熒光的顯微鏡照片；

圖6為實(shí)施例4培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的免疫熒光的顯微鏡照片；

圖7為實(shí)施例1培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的流式分析圖譜；

圖8為實(shí)施例2培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的流式分析圖譜；

圖9為實(shí)施例3培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的流式分析圖譜；

圖10為實(shí)施例4培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞的流式分析圖譜。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1～4利用外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)成神經(jīng)干細(xì)胞

一、培養(yǎng)液

實(shí)施例1～4的培養(yǎng)液包括由DMEM/F12培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal medium)混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以及添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑。各實(shí)施例的DMEM/F12培養(yǎng)基和神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的混合的體積比例、添加劑及其含量如表1所示。

表1培養(yǎng)液的組分及含量

備注：表1所述各物質(zhì)均為市場上購得

二、培養(yǎng)過程

實(shí)施例1～4分別使用表1所示的對應(yīng)的培養(yǎng)液按照以下步驟培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。

1、通過Ficoll-Paque密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞

通過SepMate^TM管中間小孔向管內(nèi)加入3.5mL Ficoll-Paque(相對密度1.077)，液面超過管子內(nèi)置管，保持SepMate^TM管直立放置于離心管架子上。

取5mL DPBS+2％FBS至于15mL離心管中，然后加入5mL外周血血樣，蓋好后輕輕地來回顛倒4次混勻，混勻后用移液管取10mL沿著SepMate^TM管側(cè)壁緩慢地加在Ficoll-Paque上，1200×g離心10分鐘。

外周血單核細(xì)胞位于SepMate^TM管最上層，將最上層細(xì)胞懸液緩慢倒入新的15mL離心管，向離心管中加入5mL DPBS+2％FBS，300×g離心8分鐘。棄去上清，輕彈離心管底部，再加入5mL DPBS+2％FBS，300×g離心5分鐘。棄去上清液，輕彈離心管底部用剩余未吸走的DPBS+2％FBS重懸細(xì)胞得到外周血單核細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞的顯微鏡照片如圖1所示。

2、神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化培養(yǎng)

將得到的外周血單核細(xì)胞平均分到一塊12孔板中，并加入培養(yǎng)液(1mL/孔)(若培養(yǎng)液存放于4℃冰箱中，需提前取出室溫預(yù)熱20分鐘)，于37℃，5％CO₂的孵箱里培養(yǎng)n₁天，培養(yǎng)液每2天更換一次。

將12孔板置于無菌操作臺中，輕輕晃動12孔板，使用吸引泵吸去培養(yǎng)液，用2mL移液管將死細(xì)胞以及未貼壁的細(xì)胞移除。

用5mL移液管沿著孔壁緩慢加入新鮮的培養(yǎng)液(1mL/孔)，繼續(xù)放入孵箱中培養(yǎng)n₂天，培養(yǎng)液每天更換一次。

3、神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

鋪好三塊傳代用的新的12孔板，加入基質(zhì)膠(BD Matrigel^TM hESC-qualified Matrix)(0.5mL/孔)，置于37℃孵箱中孵育1個小時備用。

取出孵箱中定向分化培養(yǎng)后的12孔板，輕輕搖晃板，吸去培養(yǎng)液后，每孔加入1mL的DPBS(pH7.4)洗一次，然后每孔加入0.5mL的EDTA，37℃孵箱內(nèi)消化n₃分鐘后在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞群中間出現(xiàn)小孔即可停止消化。輕輕晃動12孔板，吸去消化液。然后加入新鮮的培養(yǎng)液(1mL/孔)，用1mL的移液槍盡可能的將細(xì)胞從板上吹下來(不用反復(fù)吹打，避免傳代后細(xì)胞團(tuán)過小，影響細(xì)胞貼壁生長)。

吸取孔中培養(yǎng)液分配于鋪好加有基質(zhì)膠的12孔板，每孔的培養(yǎng)液分別平均分配至三個含有基質(zhì)膠的孔中，即傳代比例為1:3。分配好后左右搖板各6下使板中細(xì)胞分布均勻，然后置于37℃，5％CO₂的孵箱里培養(yǎng)。

重復(fù)步驟3，繼續(xù)培養(yǎng)n₄代。

其中實(shí)施例1～4的培養(yǎng)過程中的時間參數(shù)n₁～n₄如表2所示

表2各實(shí)施例的時間參數(shù)

效果實(shí)施例1免疫熒光法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞特征性蛋白表達(dá)

分別對實(shí)施例1～4所得的細(xì)胞按照以下步驟進(jìn)行鑒定。

1)固定細(xì)胞

取培養(yǎng)完成的12孔板，吸去培養(yǎng)液后，沿12孔板板壁緩緩加入1×PBS(pH7.4，下同，1mL/孔)，洗2次；然后沿板壁緩慢加入4％的多聚甲醛(PFA)(1mL/孔)，室溫放置18分鐘固定細(xì)胞，輕柔地吸去PFA，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。

2)一抗孵育

加入0.3％Triton×100(0.5mL/孔)，于37℃孵育30分鐘；再加入5％的BSA(0.5mL/孔)封閉，于37℃孵育30分鐘；直接在封閉液中加入一抗，于37℃孵育1小時；加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。

其中，一抗為Sox1抗體(山羊來源，購自RD Systems)、Sox2抗體(兔子來源，購自life technologies)、Nestin抗體(老鼠來源，購自BD Biosciences)和/或β-Tubulin III抗體(老鼠來源，購自Sigma)，加入后稀釋比例分別為1:100、1:100、1:200和1:1000。

3)二抗孵育

加入用1％BSA稀釋(稀釋比例1:200)后的二抗(0.5mL/孔)，37℃避光孵育30分鐘；吸去二抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)，每次5分鐘；然后加入用1×PBS配好的終濃度為1μg/mL的DAPI(0.5mL/孔)，染色1分鐘，吸去DAPI；加入1×PBS洗2次(1mL/孔/次)；最后加入1×PBS(0.5mL/孔)，顯微鏡下觀察并拍照處理。

其中，二抗與一抗對應(yīng)，包括驢抗山羊二抗(對應(yīng)Sox1)、驢抗兔子二抗(對應(yīng)Sox2)、驢抗老鼠二抗(對應(yīng)Nestin)和驢抗老鼠二抗(對應(yīng)β-Tubulin III)(以上二抗均購自life technologies)。

鑒定結(jié)果如圖3～6所示，圖3中A～D分別顯示實(shí)施例1培養(yǎng)得到的細(xì)胞系表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特征性因子Sox1、Sox2、Nestin和β-Tubulin III；圖4中A～D分別顯示實(shí)施例2培養(yǎng)得到的細(xì)胞系表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特征性因子Sox1-Nestin，Sox2-Nestin，Nestin和β-Tubulin III；圖5中A～D顯示實(shí)施例3培養(yǎng)得到的細(xì)胞系表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特征性因子Sox1-Nestin，Sox2-Nestin，Sox1和Sox2；圖6中A～D顯示實(shí)施例4培養(yǎng)得到的細(xì)胞系表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特征性因子Sox1-Nestin，Sox2-Nestin，Nestin和β-Tubulin III。由此可知以外周血血樣為原料分離外周血單核細(xì)胞，再使用本發(fā)明的培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。

效果實(shí)施例2流式純度分析法分析神經(jīng)干細(xì)胞的純度

分別對實(shí)施例1～4所得的細(xì)胞按照以下步驟進(jìn)行純度分析。

取培養(yǎng)完成的12孔板，吸去培養(yǎng)液后，加入無Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS洗1次(1mL/孔)；然后加入0.25％的Trypsin-EDTA消化液(1mL/孔)，緩慢晃動12孔板，使消化液覆蓋整個底部。將12孔板置于37℃、5％CO₂孵育5分鐘，加入培養(yǎng)液(6mL/孔)終止反應(yīng)。用5mL移液管輕柔吹打使細(xì)胞成單細(xì)胞。室溫下200×g離心2分鐘，吸去上清液，向離心管中加入2mLFACS緩沖液(pH7.4)洗1次，室溫下200×g離心2分鐘，用吸引泵吸去上清液。向離心管中加入100μL用FACS緩沖液稀釋好的一抗，室溫孵育1小時后用2mL FACS緩沖液洗1次。室溫下200×g離心2分鐘，棄去上清液。向離心管中加入100μL用FACS緩沖液稀釋好的二抗(二抗稀釋比例為1:1000)，避光室溫孵育30分鐘后用2mL的FACS緩沖液洗1次。室溫下200×g離心2分鐘，棄去上清液。向離心管中加入400μL的FACS緩沖液，將離心管置于冰上進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

使用的一抗包括Nestin、Sox1、Sox2和β-Tubulin III(來源同效果實(shí)施例1)，稀釋比例分別為1:200，1:100，1:100，1:1000；二抗包括488抗老鼠抗體(對應(yīng)Nestin)、488抗山羊抗體(對應(yīng)Sox1)、488抗兔子抗體(對應(yīng)Sox2)、488抗老鼠抗體(對應(yīng)β-Tubulin III)(以上二抗均購自life technologies)。

純度檢測結(jié)果如圖7～10所示，各圖中前面的峰為陰性對照，后面的鋒即是陽性樣本。圖7顯示實(shí)施例1培養(yǎng)得到的細(xì)胞系經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表達(dá)干性基因Nestin，Sox1和Sox2的細(xì)胞純度均達(dá)98％以上；圖8顯示實(shí)施例2培養(yǎng)得到的細(xì)胞系經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表達(dá)干性基因Nestin，Sox1和Sox2的細(xì)胞純度均達(dá)97％以上；圖9顯示實(shí)施例3培養(yǎng)得到的細(xì)胞系經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表達(dá)干性基因Sox1，Nestin和β-Tubulin III的細(xì)胞純度均達(dá)95％以上；圖10顯示實(shí)施例3培養(yǎng)得到的細(xì)胞系經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表達(dá)干性基因Sox1，Nestin和β-Tubulin III的細(xì)胞純度均達(dá)94％以上?？梢姷玫降纳窠?jīng)干細(xì)胞流式分析的純度較高，可低溫貯藏或者用于醫(yī)學(xué)研究。