本發(fā)明涉及一種三葉青提取物體的用途，尤其是利用低濃度三葉青提取物能夠增殖人CD3AK細(xì)胞的原理，來制備殺傷腫瘤的藥物的用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來，腫瘤的生物治療已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。其中，CD3AK細(xì)胞是一類以CD3⁺CD8⁺T為主的異質(zhì)群細(xì)胞，具有擴(kuò)增能力強(qiáng)、體外存活時(shí)間長、細(xì)胞毒性活性高、分泌細(xì)胞因子能力強(qiáng)等顯著優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被用于臨床的抗腫瘤的細(xì)胞免疫治療。CD3AK細(xì)胞主要以組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)非限制性或限制性方式識(shí)別腫瘤，通過顆粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)等途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，并與其它固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞相互作用，輔助發(fā)揮抗腫瘤作用。人CD3AK細(xì)胞已經(jīng)成為腫瘤患者過繼免疫治療重要的效應(yīng)細(xì)胞。同時(shí)，CD3AK細(xì)胞還能與其它固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞相互作用，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。由此可見，有效擴(kuò)增人外周血CD3AK細(xì)胞，以滿足CD3AK細(xì)胞生物學(xué)功能研究和臨床過繼免疫治療的需要，提高CD3AK細(xì)胞增殖率和功能是十分重要和必要的。

三葉青為葡萄科崖爬藤屬，為植物三葉崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的干燥塊根，又名金絲吊葫蘆等，是我國的特有植物，主要分布于中國東南地區(qū)民間的常用藥物。三葉青的有效成分主要為含黃酮類化學(xué)成份，其性涼，味辛、苦，無毒，具有清熱解毒、活血止痛、祛風(fēng)化痰、活血止痛等功效，常用于高熱驚厥，小兒感冒發(fā)熱、喉癢腫痛、咳嗽、肺炎、肝炎、腸炎、痢疾等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，三葉青提取物具有較好的抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱作用等，參考文獻(xiàn)如：1、資古明,吉蘭,胡建成,等.金錢吊葫蘆消炎鎮(zhèn)痛的藥理研究〔J〕.中草藥，1989，20(2)：27-29；2、Cai X.LA study of Tetrastigma hemsleyanum on liver functions of rabbit by the application of 131I-rose bengal〔J〕.Chin Tradit Herb Drugs，1980，11(1):38-41；3、丁麗，紀(jì)其雄，呂雯婷等.三葉青水提物體內(nèi)、體外抗腫瘤作用的研究.中成藥.2013，35(5)：1076-1078；

并且，三葉青提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。一些運(yùn)用三葉青為主藥用于腫瘤臨床,發(fā)現(xiàn)在抑制腫瘤生長,延緩病人的生命,改善生命征象方面有獨(dú)特的效果。王靜等發(fā)現(xiàn)三葉青提取物能通過Caspase-3途徑誘導(dǎo)人肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞凋亡。余納等研究發(fā)現(xiàn)三葉青總黃酮能通過Wnt/β-catenin通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞周期及增殖。在體內(nèi)，三葉青提取物也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗瘤活性。王明義等對(duì)裸鼠進(jìn)行肝癌HepG2皮下移植瘤造模，用三葉青乙酸乙酯提取物進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該提取物能抑制腫瘤生長，且高劑量組能顯著提高IFN-水平。徐彩菊等制造小鼠S180移植瘤模型，然后灌胃給于三葉青提取物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三葉青提取物高劑量組抑瘤率達(dá)36％，且小鼠外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8均有改善趨于正常。

許多實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖的三葉青提取物的用量大多在10mg/ml左右，但是，這一結(jié)果與臨床實(shí)際用量明顯不符。我們的研究發(fā)現(xiàn)，雖然高濃度三葉青提取物能抑制腫瘤細(xì)胞生長，但相同濃度三葉青提取物對(duì)人正常免疫細(xì)胞(包括αβT細(xì)胞、NK細(xì)胞和γδT細(xì)胞等)也有明顯的抑制作用，說明高濃度三葉青提取物對(duì)腫瘤的抑制與藥物細(xì)胞毒性相關(guān)，而非藥物誘導(dǎo)的程序性死亡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，三葉青在體內(nèi)的抗腫瘤作用可能與激發(fā)體內(nèi)免疫細(xì)胞(包括CD3AK細(xì)胞)功能有關(guān)。

因此，本發(fā)明通過研究三葉青提取物誘導(dǎo)培養(yǎng)人CD3AK細(xì)胞增殖，來發(fā)現(xiàn)三葉青提取物新的醫(yī)藥用途，可為腫瘤免疫治療藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)存的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種三葉青提取物的新醫(yī)藥用途，利用低濃度三葉青提取物來提高CD3AK細(xì)胞增殖率和功能，從而制備殺傷腫瘤細(xì)胞藥物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種三葉青提取物體外誘導(dǎo)擴(kuò)增人CD3AK細(xì)胞的方法，包括如下具體步驟：

A、取健康人外周抗凝血，分離得到單個(gè)核細(xì)胞PBMC，將PBMC置于RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。

進(jìn)一步，所述的RPMI-1640培養(yǎng)液包括小牛血清100ml/L、AB血漿50ml/L、anti-CD31μg/ml、rhIL-21000IU/ml。

B、取上步培養(yǎng)后的人CD3AK細(xì)胞配成5×10⁴/mL的細(xì)胞懸液，加入三葉青提取物，培養(yǎng)48h。

進(jìn)一步，所述的三葉青提取物為經(jīng)有機(jī)溶劑提取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干制得的三葉青水提物Th-w4，濃度為0.15-2.44μg/ml。

本發(fā)明還提供一種三葉青提取物體制備殺傷腫瘤細(xì)胞藥物的用途，藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的功效是三葉青提取物通過促進(jìn)人CD3AK細(xì)胞的增殖，提高人CD3AK細(xì)胞的殺傷活性來實(shí)現(xiàn)的。

進(jìn)一步，所述的三葉青提取物為經(jīng)有機(jī)溶劑提取后的三葉青藥材用水煮后減壓回收蒸干制得的三葉青水提物Th-w4。

更進(jìn)一步，所述的藥物含有三葉青提取物的濃度為0.15-2.44μg/ml。

目前，國內(nèi)有荷小鼠經(jīng)三葉青提取物治療后提高體內(nèi)T細(xì)胞功能的報(bào)道，無用三葉青提取物在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)人CD3AK細(xì)胞研究，無三葉青對(duì)CD3AK細(xì)胞增殖試驗(yàn)和對(duì)其穿孔素、顆粒酶B和CD107a表達(dá)和Western Blot法檢測Bcl-2的實(shí)驗(yàn)研究。而經(jīng)過上述研究可知，低濃度三葉青提取物能夠顯著促進(jìn)人CD3AK細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其穿孔素、顆粒酶B和CD107a的表達(dá)，增加凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，明顯提高CD3AK細(xì)胞的殺傷活性，并具有一定的劑量依賴性，不僅能夠體外誘導(dǎo)擴(kuò)增人CD3AK細(xì)胞，還能夠?qū)崿F(xiàn)制備殺傷腫瘤細(xì)胞藥物的用途，為腫瘤免疫治療藥物研發(fā)提供了重大的實(shí)驗(yàn)參考價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中三葉青提取物的提取技術(shù)路線；

圖2為實(shí)施例2中培養(yǎng)前的CD3AK細(xì)胞的表型；

圖3為實(shí)施例2中培養(yǎng)后的CD3AK細(xì)胞的表型；

圖4為實(shí)施例2中不同濃度三葉青水提物對(duì)CD3AK細(xì)胞增殖的影響；

圖5為實(shí)施例3中不同濃度三葉青水提取物對(duì)三株腫瘤細(xì)胞的抑制率；

圖6為實(shí)施例4中不同濃度三葉青水提物對(duì)GranB、Perforin、CD107a表達(dá)的影響

圖7-1為實(shí)施例4中的同型對(duì)照；

圖7-2為實(shí)施例4中空白對(duì)照組的GranB表達(dá)；

圖7-3為實(shí)施例4中三葉青水提物濃度為0.15μg/ml組的GranB表達(dá)；

圖8為實(shí)施例4中三葉青水提物誘導(dǎo)的CD3AK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的影響；

圖9為實(shí)施例5中三葉青水提物對(duì)CD3AK細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響.

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。

實(shí)施例1：三葉青藥材的提取分離。

1-1實(shí)驗(yàn)材料：三葉青干燥塊根(寧波市鄞州醫(yī)藥藥材公司)；80％大孔吸附樹脂樹色譜儀；Yanaco顯微熔點(diǎn)測定儀(溫度計(jì)未校正)；Varian MAT-212型質(zhì)譜儀；Bruker-speckospin AC-600P型核磁共振儀；薄層色譜硅膠板與柱色譜硅膠(100-200目、200-300目)(山東煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)公司)；Sephadex LH-20(20-80μm)(Pharmacia公司)；ODS C18反相硅膠(Merck公司)；提取用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇為藥用級(jí)，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1-2實(shí)驗(yàn)方法：三葉青提取物的提取方法參照文獻(xiàn)[楊陽。甘西鼠尾草及頭花蓼化學(xué)成分研究。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文。上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2009]，如圖1所示，根據(jù)提取時(shí)所選用的制劑將提取液分為9組，分別命名為：TH-t、TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-w1、TH-w2、TH-w3和TH-w4，本發(fā)明所需的是三葉青水提物(含糖)TH-w4。

取三葉青干燥藥材200g，加5倍體積80％乙醇水溶液浸泡24h后，加熱回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，過濾，減壓回收蒸干，得總提取物TH-t。然后將乙醇提取后的三葉青干燥塊莖水煮，減壓回收蒸干，獲得三葉青水提物(含糖)TH-w4共2.1克。

實(shí)施例2：三葉青水提取物TH-w4對(duì)CD3AK細(xì)胞增殖的影響。

2-1實(shí)驗(yàn)材料：三葉青塊根(寧波市鄞州醫(yī)藥藥材公司)；FITC-CD8、PerCP-Cy5.5-CD3、PE-Granzyme B(GranB)、PE-Perforin、APC-CD107a(BD公司)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；Anti-CD3、重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)(廈門特寶生物工程股份有限公司)；GAPDH、Bcl-2(Abcam.)；人AB型血漿(徐州市血站)；CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)基(浙江博納生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(methlthiazolyl tetrazolium,MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sμlfoxide DMSO)(Sigma公司)；淋巴細(xì)胞分離液(中國科學(xué)院血液病研究所)；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會(huì)社)；Encore自動(dòng)生化分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司)；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；流式細(xì)胞儀分析軟件Cell Quest，每個(gè)標(biāo)本分析細(xì)胞數(shù)≥l×10⁴。

2-2實(shí)驗(yàn)方法。

2-2-1CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定。

取健康人外周抗凝血20ml，常規(guī)分離得到單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，將PBMC置于含100ml/L小牛血清、50ml/L AB血漿、anti-CD3(1μg/ml)、rhIL-2(1000IU/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，標(biāo)記FITC-CD8和PerCP-Cy5.5-CD3，避光孵育15min，PBS洗滌一次，重懸于0.5ml PBS中，流式細(xì)胞儀檢測其表達(dá)。

2-2-2CCK8法檢測不同濃度三葉青水提物對(duì)人CD3AK細(xì)胞生長的影響。

取上步培養(yǎng)7d的CD3AK細(xì)胞配成5×10⁴/mL的細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)組：共設(shè)11個(gè)濃度組，分別加入5×10⁴/mL的CD3AK細(xì)胞，180μl/孔；然后加入不同濃度的三葉青水提物TH-w4(終濃度分別為0.002、0.01、0.04、0.15、0.61、2.44、9.77、39.06、156.3、625、2500μg/ml)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物空白對(duì)照組，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4個(gè)小時(shí)每孔加入CCK820μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后于酶標(biāo)儀450nm處檢測各孔吸光值(OD)記錄結(jié)果。

并且，增殖率(％)＝(實(shí)驗(yàn)OD值)—(對(duì)照OD值)/(對(duì)照OD值)×100％。

統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P≤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2-3-1CD3AK細(xì)胞鑒定：培養(yǎng)前外周血中CD3^-CD56⁺的CD3AK細(xì)胞為31.27％。收集培養(yǎng)7d的CD3AK細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞表型，結(jié)果顯示：CD3^-CD56⁺的CD3AK細(xì)胞高達(dá)81.19％，見圖2和圖3。

2-3-2各濃度三葉青水提取物TH-w4對(duì)CD3AK細(xì)胞生長影響：外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC經(jīng)CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，CD3⁺CD8⁺T細(xì)胞的比例達(dá)到82.5％，提示細(xì)胞培養(yǎng)成功。CD3AK細(xì)胞經(jīng)三葉青水提物處理48h后，細(xì)胞出現(xiàn)增殖，在0.15-2.44μg/ml濃度范圍內(nèi)增殖最明顯，與對(duì)照組(0μg/ml)相比有顯著性差異，結(jié)果見圖4(*P<0.05，與0μg/ml組相比)。

可見，低濃度三葉青水提取物TH-w4能夠顯著促進(jìn)人CD3AK細(xì)胞的增殖，故而上述實(shí)施例可作為三葉青提取物體外誘導(dǎo)擴(kuò)增人CD3AK細(xì)胞的方法，且優(yōu)選三葉青水提物Th-w4，濃度為0.15-2.44μg/ml。

實(shí)施例3：三葉青水提取物TH-w4對(duì)三種腫瘤細(xì)胞株的抑制作用。

3-1實(shí)驗(yàn)材料：無血清培養(yǎng)基購于浙江博納生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(methlthiazolyl tetrazolium,MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide DMSO)購于Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液取自于中國科學(xué)院血液病研究所；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購于日本世諾臨床診斷制品株式會(huì)社；Encore自動(dòng)生化分析儀購于北京希亞克技術(shù)有限公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S購于日本Nikon公司；流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；流式細(xì)胞儀分析軟件Cell Quest，每個(gè)標(biāo)本分析細(xì)胞數(shù)≥l×10⁴。

3-2實(shí)驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌231、胃癌SGC-823和結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞，分別配成3×10⁷/L的細(xì)胞懸液，并加入96孔板，每孔180μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組；將培養(yǎng)板放入37℃、50mL/L CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.16、0.65、2.5、10、39、156、624、2496μg/ml的三葉青水提物TH-w4，同時(shí)設(shè)不加藥的對(duì)照組。于37℃、50mL/L CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h；在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入MTT 20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清，加入DMSO 150μl，使甲贊完全溶解，于酶標(biāo)儀495nm處檢測各孔吸光值(OD)記錄結(jié)果。

并且，細(xì)胞抑制率IR(％)＝(對(duì)照OD值)—(實(shí)驗(yàn)OD值)/(對(duì)照OD)×100％。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P≤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果：將乳腺癌231、胃癌SGC-823和結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞用三葉青水提物TH-w4進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，經(jīng)誘導(dǎo)72小時(shí)后，如圖5所示，高濃度的三葉青水提物TH-w4對(duì)三種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加抑制越明顯；但是，各濃度組對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制深度均在156μg/ml以上，低于10μg/ml時(shí)各組均無抑制現(xiàn)象。

可見，高濃度三葉青提取物能抑制腫瘤細(xì)胞生長，但相同濃度三葉青提取物對(duì)人正常免疫細(xì)胞(包括αβT細(xì)胞、NK細(xì)胞和γδT細(xì)胞等)也有明顯的抑制作用，說明三葉青提取物對(duì)腫瘤的抑制與藥物細(xì)胞毒性相關(guān)，而非藥物的活性誘導(dǎo)。

實(shí)施例4：三葉青水提物TH-w4對(duì)CD3AK細(xì)胞上穿孔素、CD107a和顆粒酶B的表達(dá)和殺傷活性的影響。

4-1實(shí)驗(yàn)材料：無血清培養(yǎng)基和CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)基(浙江博納生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(methlthiazolyl tetrazolium,MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sμlfoxide DMSO)(Sigma公司)；淋巴細(xì)胞分離液(中國科學(xué)院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21(廈門特寶生物公司)；INF-γ購于Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；FITC和PE標(biāo)記的CD3、FITC標(biāo)記的γδTCR、PE標(biāo)記的穿孔素(pore-forming protein，PFP)、顆粒酶B(Granzyme B，GrB)、APC標(biāo)記的CD107a(聯(lián)科生物有限公司)；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會(huì)社)；垂直式電泳裝置、電轉(zhuǎn)移槽(北京希亞克技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；Encore自動(dòng)生化分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；流式細(xì)胞儀分析軟件Cell Quest，每個(gè)標(biāo)本分析細(xì)胞數(shù)≥l×10⁴。

4-2實(shí)驗(yàn)方法。

4-2-1CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：同實(shí)施例2中2-2-1的步驟。

4-2-2流式細(xì)胞儀檢測CD3AK細(xì)胞上穿孔素(Perforin)、顆粒酶B(GranB)和CD107a的表達(dá)。

CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)7d后，以每孔1×10⁶個(gè)/3mL接種至6孔板內(nèi)，加入三葉青提取物(終濃度為0.04、0.15、0.61、2.44、9.77μg/ml)，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞洗滌，測CD107a的管內(nèi)加入FITC-CD8、PerCP-Cy5.5-CD3和APC-CD107a，避光孵育30min，PBS洗滌，棄上清，0.5ml PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。測GranB或Perforin的試管內(nèi)，先加入FITC-CD8、PerCP-Cy5.5-CD3避光孵育30min，再加入固定液孵育15min，PBS洗滌，棄上清，加入破膜劑、PE-GranB或PE-Perforin，避光孵育15min，PBS洗滌一次，棄上清，0.5ml PBS重懸，上機(jī)檢測。

4-2-3LDH釋放法檢測三葉青水提物TH-w4作用后的CD3AK細(xì)胞對(duì)三株腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。

取經(jīng)不同濃度(終濃度分別0.04、0.15、0.61、2.44、9.77μg/ml)三葉青水提物TH-w4誘導(dǎo)48h后的CD3AK細(xì)胞配成2×10⁹/L，作為效應(yīng)細(xì)胞；對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌231、胃癌SGC-823和結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞分別配成2×10⁸/L，作為靶細(xì)胞；將效靶細(xì)胞各取0.5ml等量混合(效靶細(xì)胞比例＝10:1)，同時(shí)設(shè)置不加三葉青水提物TH-w4為對(duì)照組。置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育6h后，輕輕混勻，重懸細(xì)胞，1500r/min離心10min，收集上清液。LDH試劑盒按說明書要求操作，340nm波長下Encore自動(dòng)生化分析儀測定LDH的活性單位(U/L)。每檢測樣本設(shè)3個(gè)復(fù)管，重復(fù)3遍，取平均值。

CD3AK細(xì)胞的殺傷活性＝(測定管LDH單位－效應(yīng)細(xì)胞自然釋放LDH管)/(靶細(xì)胞最大釋放LDH管－靶細(xì)胞自然釋放LDH管)×100％。統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P≤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4-3-1三葉青水提物TH-w4對(duì)Perforin、GranB、CD107a表達(dá)的影響。

將三葉青水提物作用于CD3AK后用流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)三葉青水提物TH-w4對(duì)CD107a、Perforin影響不是很明顯，而在0.15μg/ml濃度時(shí)對(duì)GranB具有明顯的促進(jìn)作用。結(jié)果見圖6(*P<0.05)三葉青水提物TH-w4對(duì)CD3AK細(xì)胞GranB、Perforin、CD107a表達(dá)的影響，圖7-1為同型對(duì)照，圖7-2為空白對(duì)照組GranB表達(dá)，圖7-3為三葉青水提物TH-w4濃度為0.15μg/ml組GranB表達(dá)。

4-3-2三葉青水提物TH-w4對(duì)三株腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的CD3AK殺傷活性的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：濃度為2.44-0.01μg/ml三葉青水提物TH-w4作用48h后的CD3AK細(xì)胞，對(duì)乳腺癌231、胃癌SGC-823和結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞的殺傷活性顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在0.125μg/ml時(shí)殺傷活性達(dá)最高(分別為66.4％、75.1％和79.7％)，與對(duì)照組(分別為38.4％、41.8％和41.2％)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。三葉青水提物TH-w4濃度高于2.44μg/ml時(shí)，殺傷活性隨濃度增高逐漸降低，當(dāng)濃度為39μg/ml時(shí)，可抑制CD3AK細(xì)胞對(duì)3株腫瘤細(xì)胞的殺傷活性(P＜0.05)，結(jié)果見圖8。

可見，低濃度三葉青水提物TH-w4能夠促進(jìn)CD3AK細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B和CD107a的表達(dá)，明顯提高CD3AK細(xì)胞的殺傷活性。

實(shí)施例5：三葉青水提物TH-w4對(duì)CD3AK細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響。

5-1實(shí)驗(yàn)材料：三葉青塊根(寧波市鄞州醫(yī)藥藥材公司)；Anti-CD3、重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)(廈門特寶生物工程股份有限公司)；GAPDH、Bcl-2(Abcam.)；人AB型血漿(徐州市血站)。無血清培養(yǎng)基和CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)基(浙江博納生物科技有限公司)；Encore自動(dòng)生化分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司)；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；流式細(xì)胞儀分析軟件Cell Quest，每個(gè)標(biāo)本分析細(xì)胞數(shù)≥l×10⁴。

5-2實(shí)驗(yàn)方法。

5-2-1CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：同實(shí)施例2中2-2-1的步驟。

5-2-2Western Blot檢測Bcl-2的表達(dá)。

收集培養(yǎng)7d后的CD3AK細(xì)胞，以每孔5×10⁵/3ml的細(xì)胞數(shù)加入6孔板內(nèi)，加入三葉青水提物TH-w4(終濃度為0.04、0.15、0.61、2.44、9.77μg/ml)，同時(shí)設(shè)不加藥的空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞并用1×PBS洗滌一次，用50μl細(xì)胞裂解液裂解胞提取蛋白，用BCA法測定蛋白樣品濃度后用10％SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后，用5％脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗4℃封閉過夜，二抗37℃孵育2h。然后按照BCIP/NTP堿性磷酸酯酶顯色試劑盒使用手冊(cè)進(jìn)行顯色，顯色結(jié)果用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照記錄。

5-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)三葉青水提物TH-w4在0.15μg/ml濃度下對(duì)Bcl-2促進(jìn)作用明顯，結(jié)果見圖9。

而Bcl-2是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的基因之一，是一個(gè)抑制凋亡的基因，上述實(shí)驗(yàn)說明，低濃度三葉青水提物TH-w4能增加凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而提高CD3AK細(xì)胞的殺傷活性。

綜上所述：1、高濃度三葉青水提物TH-w4能抑制腫瘤細(xì)胞生長，與藥物細(xì)胞毒性相關(guān)，而非藥物的活性誘導(dǎo)；2、低濃度三葉青水提物TH-w4能夠顯著促進(jìn)人CD3AK細(xì)胞的增殖，并能夠促進(jìn)CD3AK細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B和CD107a的表達(dá)，增加凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，明顯提高CD3AK細(xì)胞的殺傷活性，故而三葉青提取物體具有制備殺傷腫瘤細(xì)胞藥物的用途，且優(yōu)選三葉青水提物Th-w4，濃度為0.15-2.44μg/ml。