本發(fā)明涉及一種檢測同型半胱氨酸的試劑盒。
背景技術(shù)：
：：同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)是一種含硫的氨基酸，是蛋氨酸的代謝產(chǎn)物。近年的研究發(fā)現(xiàn)HCY可引起神經(jīng)管畸形(neuraltubedefects,NTDs)及先天性心臟畸形(congenitalheartdefect,CHD)等出生缺陷類疾病，而且HCY與動脈粥樣硬化的發(fā)病也密切相關(guān)。早在40年前，McCully博士就首先發(fā)現(xiàn)并探討了同型半胱氨酸與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，伴有同型半胱氨酸尿癥的患者，常在其十幾至二十多歲的青少年時期即發(fā)生嚴重的心血管疾病。近期研究發(fā)現(xiàn)有10-20％的心血管疾病患者與膽固醇水平、吸煙及高血壓等危險因素無關(guān)，而是由于同型半胱氨酸升高所致。遺傳和飲食習慣是導致患者同型半胱氨酸升高的主要原因，因此為了預防心血管疾病的發(fā)生，除注意控制血脂水平以外，同型半胱氨酸水平也是非常重要的危險因素，應積極預防。同型半胱氨酸的檢測方法主要有以下幾種：放射免疫分析法(RaduiebzynucAssays)：由Refesum等1985年建立，該方法靈敏度高，特異性強，但操作繁瑣且有放射污染，同時同位素易衰變及對人體有危害，限制了使用。氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)：由Stabler1987年首先報道了氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用測定同型半胱氨酸，特異性強，靈敏度高重復好等優(yōu)點。但因需要的設備昂貴，難以適合常規(guī)臨床化學實驗室使用，此法操作十分復雜，耗時長，儀器設備要求高，普及很困難。高效液相色譜(HPLC)法應用最廣泛，費用也比其他方法低。根據(jù)檢測方法的不同又分為熒光法和電化學法。根據(jù)衍生方式的不同又分為柱前或柱后衍生法。高效液相熒光檢測法(HPLC-FD)采用柱前衍生的技術(shù)，然后用HPLC將衍生物分離，并用熒光檢測。Fiskerstrand等首先于1993年采用全自動HPLC法對血漿和尿液的HCY和硫醇物進行測定，該方法較有代表性。近年來，國內(nèi)郭健等對HPLC進行改進。該法檢測原理為血漿中同型半胱氨酸、混合型-硫化物及蛋白質(zhì)結(jié)合的同型半胱氨酸經(jīng)巰基還原劑處理之后，再與巰基特異結(jié)合的熒光物質(zhì)SBD-F充分反應形成帶有共軛結(jié)構(gòu)的化合物，其受紫外光激發(fā)后，能輻射出熒光，而且在一定條件下，熒光強度和樣品的濃度成正比。另外，因所形成的不同化合物結(jié)構(gòu)有差異，其極性也就有所不同，在色譜中的保留時間也就不一樣，故此可利用熒光檢測器檢測出血漿中的HCY的濃度。但是需要專門的儀器，費用較高，對技術(shù)人員要求比較高。高效液相電化學法(HPLC-ED)具有樣本處理簡單，無需衍生等特點，又有較高的靈敏性、專一性和穩(wěn)定性，應用較廣泛。該法中有兩種電極均可使用(H2/H+-玻璃電極，Ag/AgCl-碳糊電極)。缺點主要是由于電化學檢測器的檢測池易受污染和電極使用后易受污染，極易老化。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法是一種無需預處理的方法，基本原理為：1)二硫蘇糖醇(DTT)還原，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)催化HCY和腺苷反應生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)；2)加入SAHase抑制劑終止反應后，用腺苷酶(Adoase)降解殘余腺苷除去干擾；3)由抗SAH單克隆抗體組成的競爭性酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)定量測定SAH。Frantzen等用該法測定HCY線性等試劑性能良好，膽紅素，溶血，血脂的干擾較小，并且該法與HPLC法有良好的相關(guān)性。但是操作比較繁瑣，耗時比較長。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種檢測同型半胱氨酸的試劑盒，本發(fā)明能降低使用酶量，提高反應的穩(wěn)定性，提高循環(huán)檢測靈敏度。本發(fā)明提供的檢測同型半胱氨酸的試劑盒，它包括試劑R1和試劑R2；所述試劑R1的組成及濃度如下：所述試劑R2的組成及濃度如下：本發(fā)明中，所述緩沖液的濃度指的是所述緩沖液在所述試劑R1或試劑R2中的濃度。本發(fā)明中，所述絲氨酸簡稱SER；所述乳酸脫氫酶簡稱LDH；所述還原性輔酶Ⅰ簡稱NADH。本發(fā)明中，所述胱硫醚β-合成酶的1個酶活力單位指的是在37℃、pH8.0條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾的絲氨酸所需的酶量；所述胱硫醚β-裂解酶的1個酶活力單位指的是在37℃、pH8.0條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾的L-胱硫醚所需的酶量；所述乳酸脫氫酶的1個酶活力單位指的是在37℃溫度、pH8.0條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾的丙酮酸所需的酶量。上述的試劑盒中，所述緩沖液為4-羥乙基哌嗪乙磺酸(簡稱Hepes)、Tris-HCl、三乙醇胺(簡稱TEA)和3-(N-嗎啉基)丙磺酸(簡稱MOPS)中的至少一種；所述試劑盒中，R1中各組分混合后的pH值為8.0～8.5，R2中各組分混合后的pH值為7.5～8.0；R1和R2的體積比為1～12：1；具體可為10:1，R1和R2按照10:1比例混合后pH值為8.0～8.5。上述的試劑盒中，所述同型半胱氨酸還原劑為巰基還原劑。上述的試劑盒中，所述巰基還原劑為二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦和β-巰基乙醇中的至少一種。上述的試劑盒中，所述輔酶為磷酸吡哆醛；所述防腐劑為疊氮鈉和/或液體生物防腐劑(簡稱為PC300)。上述的試劑盒中，所述試劑盒還包括如下濃度的組份：酶穩(wěn)定劑5～150g/L；表面活性劑1～100g/L。上述的試劑盒中，所述表面活性劑為曲拉通450(又稱TritonX-450)、曲拉通100(又稱TritonX-100)、Tween20和Tween80，Brij35，SDS中的至少一種；所述輔酶和所述表面活性劑的質(zhì)量比為1:100～20000，優(yōu)選比例為1:500～3000；所述酶穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白、丙三醇、甘露醇、山梨醇和乙二醇中的至少一種。本發(fā)明中，所述試劑盒具體可由下述R1和R2混合組成，其中各組分濃度為R1和R2分別配制濃度：R1為MOPS100mmol/L；疊氮鈉0.5g/L；絲氨酸3mmol/L；三(2-羥乙基)膦5mmol/L；TritonX-101g/L；磷酸吡哆醛0.5mg/L；乳酸脫氫酶35KU/L；還原性輔酶Ⅰ0.6g/L；甘露醇50ml/L；R2為MOPS100mmol/L；甘露醇50ml/L；磷酸吡哆醛1.58mg/L；疊氮鈉0.5g/L；TritonX-1005g/L；胱硫醚β-合成酶10KU/L；胱硫醚β-裂解酶1KU/L。本發(fā)明還提供了一種同型半胱氨酸含量的檢測方法，包括如下步驟：將待測樣品依次與所述的試劑盒組分中R1和R2混合，反應，檢測，即得到所述待測樣品中同型半胱氨酸含量。本發(fā)明具體的檢測方法的條件和步驟如下：分析方法：速率法反應方向：下降反應校準方式：兩點線性測定波長：主波長：340nm，副波長：405nm測定溫度：37℃樣本：R1:R2＝16.5:250:25(μL)具體操作步驟：加入樣本16.5μL，試劑R1250μL，37℃孵育5分鐘，測定吸光度A1，然后加入試劑R225μL，反應2分鐘后，開始測定吸光度，連續(xù)監(jiān)測3分鐘，得到ΔA/min。采用2點定標法，用日立7100全自動生化分析儀檢測吸光度，根據(jù)已知濃度的校準品和樣本吸光度ΔA/min進行比較得到樣本檢測結(jié)果。本發(fā)明中，所述試劑盒檢測同型半胱氨酸的反應原理如下：待測樣品與所述緩沖液和所述同型半胱氨酸還原劑反應，得到游離的同型半胱氨酸；游離的同型半胱氨酸與所述絲氨酸，在所述胱硫醚β合成酶催化下反應，得到L-胱硫醚；然后L-胱硫醚與所述還原性輔酶Ⅰ和所述胱硫醚β裂解酶，所述L-胱硫醚在所述胱硫醚β裂解酶的分解下，得到同型半胱氨酸和丙酮酸的混合液；所述同型半胱氨酸再次參加與所述絲氨酸的反應中；所述丙酮酸與所述還原性輔酶Ⅰ在所述乳酸脫氫酶催化下發(fā)生顯色反應，檢測，即得到所述待測樣品中同型半胱氨酸含量。本發(fā)明中，所述輔酶和所述表面活性劑的加入，降低所述胱硫醚β合成酶和所述胱硫醚β裂解酶的使用量，能提高反應的穩(wěn)定性，提高循環(huán)檢測靈敏度。上述的檢測方法中，所述待測樣品為血清、肝素抗凝血漿和EDTA抗凝血漿中的至少一種；所述檢測采用吸收光譜法測定，具體可采用紫外可見分光光度計或全自動生化分析儀檢測。本發(fā)明所述的試劑盒在檢測血清或血漿同型半胱氨酸含量中的應用。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明試劑盒能降低使用酶量，提高檢測的穩(wěn)定性，提高循環(huán)檢測靈敏度，準確度高，適用范圍廣。本發(fā)明方法與HPLC法相關(guān)性良好，無需樣本預處理，在全自動生化分析儀上檢測自動化，速度快。附圖說明圖1為本發(fā)明在2015年度兩次室間質(zhì)評結(jié)果，其中圖1a)為第一次室間質(zhì)評結(jié)果，圖1b)為第二次室間質(zhì)評結(jié)果。圖2為本發(fā)明使用日立7100系統(tǒng)與AU400系統(tǒng)測試的結(jié)果比較。圖3為本發(fā)明使用日立7100系統(tǒng)與東芝40系統(tǒng)測試的結(jié)果比較。圖4為本發(fā)明使用AU400系統(tǒng)與東芝40系統(tǒng)測試的結(jié)果比較。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、同型半胱氨酸的試劑盒，由下述R1和R2組成，混合后的pH值為8.0～8.5。1、R1的各組分濃度及名稱，如表1所示。表1R1各組分濃度及名稱2、R2的各組分濃度及名稱，如表2所示。表2R2各組分濃度及名稱檢測結(jié)果：1、準確度HCY試劑檢測三個不同水平質(zhì)控品，檢測結(jié)果與靶值比較，結(jié)果偏移應≤5％。參加2015年度衛(wèi)生部室間質(zhì)評，結(jié)果應在偏移要求范圍內(nèi)。1)室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果，檢測三個水平的質(zhì)控品，檢測結(jié)果偏差均小于5％，結(jié)果如表1所示。表1HCY室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果(μmol/L)2)室間質(zhì)評結(jié)果，參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心主辦的心肌類室間質(zhì)評，一年兩次，每次5個樣本，盲樣檢測，結(jié)果如圖1所示，最大偏移為5.31％，絕對平均偏移為3.08％，兩次回報結(jié)果成績均為100％通過。2、靈敏度檢測方法，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會EP17-A文件，進行空白檢出限LOB，檢出限LOD，定量檢出限LOQ的檢測。依據(jù)上述EP17-A，重復檢測水空白60遍及10個低濃度血清樣本，濃度分別為2.64、0.70、0.34、0.31、0.29、0.26、0.25、0.24、0.16、0.13μmol/L20遍，得到HCY試劑的空白檢測限是0.13μmol/L，檢出限是0.20μmol/L，定量檢出限是0.30μmol/L。3、穩(wěn)定性檢測方法，4度冷藏實時放置檢測，吸光度下降不能大于20％。開蓋穩(wěn)定性1個月，質(zhì)控偏差不能大于10％。1)HCY試劑盒放置4度冷藏18個月，與零時間相比，本發(fā)明試劑盒定標吸光度下降不超過15％，結(jié)果如表2所示。表2冷藏18個月穩(wěn)定性2)開蓋穩(wěn)定性。將HCY試劑開蓋后，放置到儀器試劑倉中，每天檢測，連續(xù)檢測1個月，本發(fā)明試劑盒檢測的偏差不大于5％。4、不同機型結(jié)果比較，選取市場上有代表性的3個廠家全自動生化分析儀：日立7100，AU400，東芝40，使用同一批號試劑、校準和質(zhì)控，檢測40份臨床血清樣本，進行相關(guān)比較，以評價同型半胱氨酸試劑在不同儀器使用的一致性。使用同一批號試劑、校準和質(zhì)控，檢測40份臨床血清樣本，進行兩兩相關(guān)比較，日立7100系統(tǒng)與AU400系統(tǒng)比較相關(guān)系數(shù)r為0.9954，如圖2所示。日立7100系統(tǒng)與東芝40系統(tǒng)比較相關(guān)系數(shù)r為0.9970，如圖3所示。AU400系統(tǒng)與東芝40系統(tǒng)比較相關(guān)系數(shù)r為0.9990，如圖4所示。三個系統(tǒng)間均具有良好的相關(guān)性。本發(fā)明試劑盒在不同儀器系統(tǒng)結(jié)果一致性良好，適用范圍廣。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3