本發(fā)明涉及一種檢測酶活性的試劑盒，具體涉及一種檢測亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的試劑盒、方法及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

葉酸是體內(nèi)許多重要物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸、血紅蛋白等的合成中的甲基供體，葉酸缺乏或者葉酸代謝酶的缺乏，會導(dǎo)致細胞周期不正常，DNA、蛋白質(zhì)甲基化反應(yīng)異常、DNA堿基無法正常合成等多種生化反應(yīng)異常，從而導(dǎo)致諸多重大疾病。

葉酸的代謝是依靠一系列酶催化來實現(xiàn)的，葉酸要經(jīng)過轉(zhuǎn)化成為有活性的5-甲基四氫葉酸形式才能完成在體內(nèi)的正常功能，實現(xiàn)這一活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶就是5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，簡稱MTHFR）。其功能是催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，并和其他酶一起以5-甲基四氫葉酸作為同型半胱氨酸（Homocysteine，簡寫Hcy）的輔助底物將同型半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸。MTHFR不同程度的酶活性下降將導(dǎo)致葉酸代謝障礙，進而導(dǎo)致一系列疾病，如出生缺陷，我國常見的出生缺陷有神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、唇腭裂、唐氏綜合癥等，其中神經(jīng)管畸形占所有出生缺陷疾病的1/3左右。MTHFR酶活性缺陷導(dǎo)致的葉酸代謝障礙是引起高同型半胱氨酸血癥的主要因素，高同型半胱氨酸血癥進一步引發(fā)心腦血管疾病，包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、外周血管病、腦血管病及靜脈血栓的形成, 臨床上可表現(xiàn)為腦卒中、心肌梗死、肺栓塞、腎血管及外周血管病等等。此外，葉酸代謝障礙還引起其他一系列問題，如新生兒發(fā)育遲緩、意識和行動障礙、癲癇發(fā)作、神經(jīng)功能缺損、育齡女性的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊娠高血壓、男性精子生成障礙或精子活力低下等問題；還與阿爾茨海默病和其他形式的癡呆、孤獨癥、糖尿病、結(jié)腸癌和急性白血病等諸多疾病密切相關(guān)。

因此MTHFR酶活性的評估對于預(yù)防先天疾病，不孕不育，嚴重心腦血管疾病等諸多領(lǐng)域有非常重要的現(xiàn)實意義。

目前，國內(nèi)外尚無適用于臨床檢測的MTHFR酶活力檢測試劑或試劑盒。值得提出的是，在正常生理條件下，MTHFR酶是不可逆的催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，我們以此作為生理方向的反應(yīng)（正向反應(yīng)），在體外條件下，提取出的MTHFR具有三種酶活力，分別是生理正向反應(yīng)、生理反向反應(yīng)、NAD(P)H-甲萘醌氧還酶活性。

現(xiàn)有的科研用MTHFR酶活力檢測方法都是上個世紀(jì)80年代左右建立，主要包括兩種，一種是基于光吸收的變化來進行酶活力檢測，光吸收法檢測是建立在NAD(P)H在340nm下的光吸收變化來評估反應(yīng)的進程，且該方法檢測的是生理反向反應(yīng)。這種方法應(yīng)該只適用于提取純化后的MTHFR酶。對于復(fù)雜生物樣本的反應(yīng)體系（如臨床檢測），這種方法是不適用的。

另一種是采用放射性同位素標(biāo)記法來檢測，其原理是檢測MTHFR酶的生理反向反應(yīng)。因亞甲基四氫葉酸不穩(wěn)定，所以采用反方向檢測該酶的氧化能力方法來評估MTHFR的酶活力，這種方法也多用于研究人類MTHFR缺乏癥。由于同位素是一種相對不穩(wěn)定的放射性物質(zhì)，易造成環(huán)境污染，該方法也不適用于臨床。

現(xiàn)在迫切需要一種適用于臨床需求的檢測正常生理反應(yīng)方向MTHFR酶活力的方法和試劑。

有文獻報道采用HPLC方法檢測MTHFR的正常生理反應(yīng)，但這種方法用于檢測豬肝組織的提取物和培養(yǎng)的成纖維細胞，且首先要在反應(yīng)體系中由甲醛和四氫葉酸合成基本底物5,10-亞甲基四氫葉酸，再繼續(xù)后續(xù)的反應(yīng)，這點使得要精確確定天然底物的動力學(xué)參數(shù)很困難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，簡稱MTHFR，EC 1.5.1.20）酶活性的試劑盒，本發(fā)明試劑盒進行檢測時，以天然底物5,10-亞甲基四氫葉酸為底物，因此檢測的為人體內(nèi)正常生理反應(yīng)方向的酶活力，本發(fā)明的試劑盒具有較高的檢測靈敏度，可直接用于酶活性檢測；本發(fā)明的試劑盒可在手動或自動的液相色譜儀的熒光檢測設(shè)備上使用，且使用方便。

本發(fā)明提供了一種檢測亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的試劑盒，上述試劑盒包括獨立包裝的試劑1、試劑2、試劑3、試劑4和試劑5；

上述試劑1為由緩沖液1和酶活穩(wěn)定劑1組成的緩沖體系，上述試劑1的pH值為5~8；

上述試劑2為5,10-亞甲基四氫葉酸；

上述試劑3為NADPH；

上述試劑4為由終止試劑和酶活穩(wěn)定劑2組成的終止液；

上述試劑5為由緩沖液2和酶活穩(wěn)定劑2組成的稀釋液，上述試劑5的pH值為5~8。

可選的，上述試劑1中，上述緩沖液1的摩爾濃度為50~500mmol/L，上述酶活穩(wěn)定劑1的摩爾濃度為5~100mmol/L；

上述試劑2中，上述5,10-亞甲基四氫葉酸的摩爾濃度為0.05~0.5mmol/L；

上述試劑3中，上述NADPH的摩爾濃度可為0.05~2mmol/L；

上述試劑4中，上述終止液的體積百分比濃度可為20~80ml/L，上述酶活穩(wěn)定劑2的摩爾濃度可為10~100mmol/L；

上述試劑5中，上述緩沖液2的摩爾濃度可為20~200mmol/L，上述酶活穩(wěn)定劑2的摩爾濃度可為5~50mmol/L。

可選的，上述試劑1中，上述緩沖液1為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為80~150mmol/L，上述酶活穩(wěn)定劑1為二硫蘇糖醇，摩爾濃度為5mmol/L；

上述試劑2中，上述5,10-亞甲基四氫葉酸的摩爾濃度為0.15~0.5mmol/L；

上述試劑3中，上述NADPH的摩爾濃度可為1~2mmol/L；

上述試劑4中，上述終止液為高氯酸水溶液，體積百分比濃度為60~80ml/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為60mmol/L；

上述試劑5中，上述緩沖液2為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為60mmol/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為30mmol/L。

可選的，上述試劑1中，上述緩沖液1為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為80mmol/L，PH值為6.8，上述酶活穩(wěn)定劑1為二硫蘇糖醇，摩爾濃度為5mmol/L；

上述試劑2中，上述5,10-亞甲基四氫葉酸的摩爾濃度為0.5mmol/L；

上述試劑3中，上述NADPH的摩爾濃度可為2mmol/L；

上述試劑4中，上述終止液為高氯酸水溶液，體積百分比濃度為60ml/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為60mmol/L；

上述試劑5中，上述緩沖液2為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為60mmol/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為30mmol/L。

可選的，上述試劑1中，上述緩沖液1為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為100mmol/L，PH值為7.0，上述酶活穩(wěn)定劑1為二硫蘇糖醇，摩爾濃度為5mmol/L；

上述試劑2中，上述5,10-亞甲基四氫葉酸的摩爾濃度為0.4mmol/L；

上述試劑3中，上述NADPH的摩爾濃度可為1.5mmol/L；

上述試劑4中，上述終止液為高氯酸水溶液，體積百分比濃度為60ml/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為60mmol/L；

上述試劑5中，上述緩沖液2為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為60mmol/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為30mmol/L。

可選的，上述試劑1中，上述緩沖液1為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為150mmol/L，PH值為7.2，上述酶活穩(wěn)定劑1為二硫蘇糖醇，摩爾濃度為5mmol/L；

上述試劑2中，上述5,10-亞甲基四氫葉酸的摩爾濃度為0.15mmol/L；

上述試劑3中，上述NADPH的摩爾濃度可為1mmol/L；

上述試劑4中，上述終止液為高氯酸水溶液，體積百分比濃度為80ml/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為60mmol/L；

上述試劑5中，上述緩沖液2為磷酸鉀緩沖液，摩爾濃度為60mmol/L，上述酶活穩(wěn)定劑2為抗壞血酸水溶液，摩爾濃度為30mmol/L。

可選的，上述酶活穩(wěn)定劑為β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或抗壞血酸中至少一種。

本發(fā)明提供了一種采用上述試劑盒檢測亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的方法：

將上述試劑1、上述試劑2與待測樣本混合，上述待測樣本與上述試劑2和上述試劑1的體積比為1：（2~4）：（6~3），形成上述試劑1、上述試劑2與待測樣本的混合體系，再加入上述試劑3，上述試劑3與上述混合體系的比例為1:9，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后加入上述試劑4終止反應(yīng)并將上述待測樣本置于冰上30min，上述試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：10，終止后上述待測樣本管18000g離心5min，取上清液，加入上述試劑5，其中上清液與上述試劑5的比例為1：5，稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待HPLC檢測。

可選的，將上述試劑1、上述試劑2與待測樣本混合，上述待測樣本與上述試劑2和上述試劑1的體積比為1：2：6，形成上述試劑1、上述試劑2與待測樣本的混合體系，再加入上述試劑3，上述試劑3與上述混合體系的比例為1:9，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后加入上述試劑4終止反應(yīng)并將上述待測樣本置于冰上30min，上述試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：10，終止后上述待測樣本管18000g離心5min，取上清液，加入上述試劑5，其中上清液與上述試劑5的比例為1：5，稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待HPLC檢測。

本發(fā)明提供了一種將上述試劑盒在輔助診斷亞甲基四氫葉酸還原酶缺乏癥及葉酸利用障礙、葉酸缺乏的體檢篩查中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的試劑盒還可以用于分析和檢測源自人體或動物的各類標(biāo)本（包括各種體液、細胞或組織）中的亞甲基四氫葉酸還原酶酶活力，如可用于血液、血細胞、培養(yǎng)細胞及肝臟組織等，適用標(biāo)本范圍廣。

我們對人外周血白細胞中MTHFR酶活性檢測方法的研究，通過大量的實驗摸索，我們克服了諸多技術(shù)難題，最終建立了一套穩(wěn)定、敏感的MTHFR生理反應(yīng)方向的酶活力檢測方法，進一步結(jié)合基因測序驗證等手段，我們進行了臨床樣本驗證，證實了該方法的準(zhǔn)確性和特異性。

使用本發(fā)明提供的檢測試劑盒進行檢測時，可以獲得正常生理反應(yīng)方向的亞甲基四氫葉酸還原酶活性的定量結(jié)果，因此可以用于分析、檢測和診斷亞甲基四氫葉酸還原酶的酶活力異常導(dǎo)致的各種疾病及葉酸利用障礙、葉酸缺乏導(dǎo)致的各種疾病篩查。

附圖說明

圖1為實施例1中制作的5-甲基四氫葉酸濃度與峰面積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為實施例5中的5-甲基四氫葉酸HPLC檢測峰圖（其中5-MTHF指代5-甲基四氫葉酸）。

圖3為實施例6中的5-甲基四氫葉酸HPLC檢測峰圖（其中5-MTHF指代5-甲基四氫葉酸）。

圖4為實施例7中的5-甲基四氫葉酸HPLC檢測峰圖（其中5-MTHF指代5-甲基四氫葉酸）。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的檢測試劑盒，包括如下組分：

試劑1：

磷酸鉀緩沖液（pH6.8） 80mmol/L

二硫蘇糖醇 5mmol/L

試劑2：

5,10-亞甲基四氫葉酸水溶液 0.5mmol/L

試劑3：

NADPH水溶液 2mmol/L

試劑4：

高氯酸水溶液 60ml/L

抗壞血酸水溶液 60mmol/L

試劑5：

磷酸鉀緩沖液（pH6.8） 60mmol/L

抗壞血酸水溶液 30mmol/L

實施例2、亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的檢測試劑盒，包括如下組分：

試劑1：

磷酸鉀緩沖液（pH7.0） 100mmol/L

二硫蘇糖醇 5mmol/L

試劑2：

5,10-亞甲基四氫葉酸水溶液 0.4mmol/L

試劑3：

NADPH水溶液 1.5mmol/L

試劑4：

高氯酸水溶液 60ml/L

抗壞血酸水溶液 60mmol/L

試劑5：

磷酸鉀緩沖液（pH6.8） 60mmol/L

抗壞血酸水溶液 30mmol/L

實施例3、亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的檢測試劑盒，包括如下組分：

試劑1：

磷酸鉀緩沖液（pH7.2） 150mmol/L

二硫蘇糖醇 5mmol/L

試劑2：

5,10-亞甲基四氫葉酸水溶液 0.15mmol/L

試劑3：

NADPH水溶液 1mmol/L

試劑4：

高氯酸水溶液 80ml/L

抗壞血酸水溶液 60mmol/L

試劑5：

磷酸鉀緩沖液（pH6.8） 60mmol/L

抗壞血酸水溶液 30mmol/L

實施例4、樣本的制備

（1）白細胞分離

亞甲基四氫葉酸還原酶的樣品為健康志愿者的外周靜脈全血，從外周靜脈全血中分離白細胞，具體是通過如下方法制備的：用含EDTA.K₂抗凝劑的真空采血管收集健康成人的外周靜脈全血4ml，加入15ml裂解液（0.1mM EDTA），處理15min以破碎紅細胞，3000rpm離心10min，棄上清，收集沉淀即是白細胞，以生理鹽水洗滌白細胞兩次，3500rpm離心5min，棄上清，收集白細胞沉淀，白細胞沉淀可以凍存于-80℃條件下保存。

（2）亞甲基四氫葉酸還原酶粗酶液制備

向白細胞沉淀中加入1ml試劑1懸浮細胞，然后超聲，超聲10s，間歇10s，共超聲10次處理，然后用BCA法定蛋白濃度為1ug/ul，該懸浮液即為含有亞甲基四氫葉酸還原酶的粗酶液，定好濃度后放于4℃環(huán)境中待用。

實施例5、亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的檢測

（1）樣本酶活性的測定

采用實施例1所述試劑盒測定樣本酶活性，將試劑1、試劑2與40ug樣本混合，樣本與試劑2和試劑1的體積比為1：2：6，再加入試劑3，試劑3與前述混合體系的比例為1:9，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后加入試劑4終止反應(yīng)并將樣本置于冰上30min，試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：10。終止后樣品管18000g離心5min，取上清液，加入試劑5，其中上清液與試劑5的比例為1：5；

稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待檢測。

（2）空白對照的測定

將試劑1、試劑2與40ug樣本混合，樣本與試劑2和試劑1的體積比為1：2：6，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后再加入試劑3，試劑3與前述混合體系的比例為1:9，并立即加入試劑4終止反應(yīng)并將樣本置于冰上30min，試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：10。終止后樣品管18000g離心5min，取上清液，加入試劑5，其中上清液與試劑5的比例為1：5；

稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待檢測。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取不同濃度5-甲基四氫葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度分別為0、20、40、80、150、300 nmol/L，分別與所述試劑4和試劑5進行所述終止并稀釋反應(yīng)，并檢測所述反應(yīng)后的體系在激發(fā)波長290nm和發(fā)射波長350nm下的峰面積；以5-甲基四氫葉酸的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

（4）HPLC檢測

所用色譜柱為C18柱，250*4.6mm，內(nèi)徑5um，流動相為50mmol/L磷酸二氫鉀（pH 2.8）含10%乙腈，流速為1ml/min，柱溫保持25℃，進樣量為50ul，激發(fā)波長設(shè)置為290nm和發(fā)射波長設(shè)置為350nm。檢測時長為20min。

根據(jù)所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品的平均峰面積值與空白對照的平均峰面積值的差值，計算得出健康成人血液中亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性，其中，酶活性的單位定義為：以每毫克樣本每分鐘還原所述亞甲基四氫葉酸生成的5-甲基四氫葉酸的納摩爾數(shù)，表示為nmol/mg/min。

檢測結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出5-MTHF可以經(jīng)HPLC有效分離，峰圖清晰分辨較好，因此實施例1所述試劑盒可以有效檢測亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性。

實施例6 亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的檢測

（1）樣本酶活性的測定

采用實施例2所述試劑盒測定樣本酶活性，將試劑1、試劑2與40ug樣本混合，樣本與試劑2和試劑1的體積比為1：3：5，再加入試劑3，試劑3與前述混合體系的比例為1:9，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后加入試劑4終止反應(yīng)并將樣本置于冰上30min，試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：10。終止后樣品管18000g離心5min，取上清液，加入試劑5，其中上清液與試劑5的比例為1：5；

稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待檢測。

（2）空白對照的測定

將試劑1、試劑2與40ug樣本混合，樣本與試劑2和試劑1的體積比為1：3：5，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后再加入試劑3，試劑3與前述混合體系的比例為1:9，并立即加入試劑4終止反應(yīng)并將樣本置于冰上30min，試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：10。終止后樣品管18000g離心5min，取上清液，加入試劑5，其中上清液與試劑5的比例為1：5；

稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待檢測；

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)稀釋過濾后采用檢測方法如實施例5中（4）HPLC檢測所述。

檢測結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出5-MTHF可以經(jīng)HPLC有效分離，峰圖清晰分辨較好，因此實施例2所述試劑盒可以有效檢測亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性。

實施例7 亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性的檢測

（1）樣本酶活性的測定

采用實施例3所述試劑盒測定樣本酶活性，將試劑1、試劑2與40ug樣本混合，樣本與試劑2和試劑1的體積比為1：4：3，再加入試劑3，試劑3與前述混合體系的比例為1:8，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后加入試劑4終止反應(yīng)并將樣本置于冰上30min，試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：9。終止后樣品管18000g離心5min，取上清液，加入試劑5，其中上清液與試劑5的比例為1：5；

稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待檢測。

（2）空白對照的測定

將試劑1、試劑2與40ug樣本混合，樣本與試劑2和試劑1的體積比為1：4：3，混勻后將反應(yīng)體系置于37℃避光反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后再加入試劑3，試劑3與前述混合體系的比例為1:8，并立即加入試劑4終止反應(yīng)并將樣本置于冰上30min，試劑4與反應(yīng)體系的體積比為1：9。終止后樣品管18000g離心5min，取上清液，加入試劑5，其中上清液與試劑5的比例為1：5；

稀釋后的體系用0.45um的過濾器進行過濾，并放置于低溫、避光條件下待檢測；

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)稀釋過濾后采用檢測方法如實施例5中（4）HPLC檢測所述。

檢測結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出5-MTHF可以經(jīng)HPLC有效分離，峰圖清晰分辨較好，因此實施例3所述試劑盒可以有效檢測亞甲基四氫葉酸還原酶酶活性。

以上所述僅為本發(fā)明的可選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。