本發(fā)明涉及一種檢測原漿啤酒酵母的方法，目的在于從下面啤酒酵母中快速、方便、靈敏地檢測出原漿啤酒酵母，屬食品分析技術(shù)領(lǐng)域。
(二)
背景技術(shù)：
下面啤酒是我國主要的傳統(tǒng)啤酒類型。但隨著啤酒行業(yè)競爭的日趨激烈與消費(fèi)者口味需求的多樣化，越來越多的啤酒企業(yè)使用不同的啤酒酵母來生產(chǎn)風(fēng)格各異的啤酒產(chǎn)品。原漿啤酒是近幾年迅速崛起的新型啤酒產(chǎn)品，深受廣大消費(fèi)者青睞。然而對同時生產(chǎn)下面啤酒與原漿啤酒的企業(yè)而言，下面啤酒酵母與原漿啤酒酵母互為污染酵母。與下面啤酒酵母不同的是：原漿啤酒酵母發(fā)酵的啤酒具有典型的酵母發(fā)酵特征，如濃郁的水果香、酚香和酯香等。倘若下面啤酒被原漿啤酒酵母污染，后者的發(fā)酵特征就會在下面啤酒中呈現(xiàn)，導(dǎo)致下面啤酒出現(xiàn)雜味，并且嚴(yán)重影響下面啤酒的品質(zhì)。如何及時準(zhǔn)確的判斷下面啤酒被原漿啤酒酵母污染的可能性，是啤酒生產(chǎn)者保證啤酒產(chǎn)品質(zhì)量的有效手段。因此，研究快速檢測原漿啤酒酵母的方法，及時對下面啤酒發(fā)酵過程中的潛在危害進(jìn)行預(yù)警，對保障下面啤酒品質(zhì)具有重要意義。
目前關(guān)于啤酒釀造中野生酵母的研究報道較多。例如吳文芳等早在1994年就介紹了啤酒中野生酵母的分類及危害，野生酵母的檢測方法及對各方法的評價；林先軍研究認(rèn)為在麥芽浸出物、酵母浸出物、葡萄糖和蛋白胨(MYGP)的瓊脂培養(yǎng)基中補(bǔ)充195mg/L的CuSO4制備的培養(yǎng)基可有效的選擇性分離野生酵母，能從80％的污染樣品中檢測到野生酵母；并且這種培養(yǎng)基既能檢測釀酒酵母屬酵母，也能檢測非釀酒酵母屬野生酵母。所謂野生酵母，是指在啤酒釀造過程中出現(xiàn)的除培養(yǎng)酵母之外的所有酵母，威爾斯對野生酵母的定義則是：任何未經(jīng)嚴(yán)密選用與控制的酵母，即為野生酵母。隨著原漿啤酒產(chǎn)品的日益盛行，作為非野生酵母屬原漿啤酒酵母的研究也引起研究者的廣泛興趣。但對下面啤酒酵母與原漿啤酒酵母交叉污染情況及其分離、鑒別手段的研究目前尚未見報道。
(三)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種從下面啤酒酵母中快速檢測原漿啤酒酵母的方法；發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，原漿啤酒酵母的最高生長溫度為36℃，且耐受30mg/L的結(jié)晶紫；而下面啤酒酵母在36℃條件下不生長，在含30mg/L結(jié)晶紫的培養(yǎng)基上也不生長；該方法適用于所有存在形式的下面啤酒酵母，如啤酒種酵母液、啤酒發(fā)酵液與回收酵母泥。
一種從下面啤酒酵母中快速檢測原漿啤酒酵母的方法，是先將待測樣品冰浴超聲5～10min，快速除去樣品中的CO2，并打散酵母細(xì)胞；然后取1mL超聲處理后的樣品(或超聲處理后再經(jīng)系列梯度稀釋的樣品)于9cm的平板培養(yǎng)皿中，倒入45～50℃的酵母氮源-葡萄糖-結(jié)晶紫-溴甲酚綠-瓊脂培養(yǎng)基(YNB-GVBA培養(yǎng)基)，混勻；待YNB-GVBA培養(yǎng)基凝固后，36℃培養(yǎng)2～3d，觀察YNB-GVBA培養(yǎng)基上的菌落生長情況；如果YNB-GVBA培養(yǎng)基上有菌落生成，且菌落周邊由綠色變?yōu)辄S色，表明下面啤酒酵母中混入有原漿啤酒酵母；如果培養(yǎng)基上沒有菌落生成，則表明下面啤酒酵母中沒有混入原漿啤酒酵母。
進(jìn)一步的，所述YNB-GVBA培養(yǎng)基采用雙料YNB-GVBA培養(yǎng)基，待測樣品中原漿啤酒酵母的檢出率可提高10倍。
所述YNB-GVBA培養(yǎng)基的制備方法為：先稱取YNB培養(yǎng)基0.67g，葡萄糖2.0g，結(jié)晶紫與溴甲酚綠各3.0mg，瓊脂1.8g，溶解到100mL的去離子水中，121℃滅菌15min，得到Y(jié)NB-GVBA培養(yǎng)基。
所述雙料YNB-GVBA培養(yǎng)基的配制方法為：將YNB-GVBA培養(yǎng)基中除去離子水外的其它組分按重量比加倍溶解到100mL去離子水中，121℃滅菌15min得到雙料YNB-GVBA培養(yǎng)基。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明針對下面啤酒酵母中可能混有原漿啤酒酵母，從而影響下面啤酒風(fēng)味的問題提出，是一種快速、方便、靈敏的從下面啤酒酵母中檢出原漿啤酒酵母的方法。
YNB-GVBA培養(yǎng)基價格便宜，制備方便，其中的原料YNB培養(yǎng)基來源廣泛，可市購得到；冰浴超聲5～10min即可快速有效的除去被測樣品中的CO2并打散酵母細(xì)胞，適用于同時處理大量樣品；采用30mg/L的結(jié)晶紫與36℃培養(yǎng)雙重柵欄因子，可有效抑制下面啤酒酵母生長，測定方法的準(zhǔn)確性高，適應(yīng)性廣；本發(fā)明同時適用于下面啤酒的種酵母液、發(fā)酵液和酵母泥的檢測；下面啤酒酵母中原漿啤酒酵母的最低檢出限為340個細(xì)胞/mL，采用雙料培養(yǎng)基時，檢出率可提高10倍，靈敏度更高；本發(fā)明方法的操作時間僅2～3d，便可實(shí)現(xiàn)對啤酒酵母交叉污染的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防和早處理。另外，本發(fā)明的實(shí)施不需要增加額外的儀器設(shè)備，不需要專門的人員培訓(xùn)，應(yīng)用性強(qiáng)，對保障啤酒品質(zhì)、實(shí)現(xiàn)啤酒類型的多樣化、安全性生產(chǎn)意義重大。
(四)具體實(shí)施方式
本實(shí)施例中YNB培養(yǎng)基可購自青島海博生物技術(shù)有限公司。
實(shí)施例1由下面啤酒種酵母液中檢出原漿啤酒酵母
1、原漿啤酒酵母-下面啤酒種酵母混合液的制備
將待檢原漿啤酒酵母培養(yǎng)液冰浴超聲5min，快速除去其中的CO2，并打散酵母細(xì)胞。用無菌吸管吸取打散酵母細(xì)胞后的啤酒酵母培養(yǎng)液1mL，沿管壁緩緩注入含9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦振蕩，混合均勻，制成10-1的樣品勻液。再用無菌吸管吸取10-1的樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入含9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦振蕩，混合均勻，制成10-2的樣品勻液。以此類推，分別制成10-3、10-4、10-5、10-6的原漿啤酒酵母稀釋液。
將下面啤酒種酵母液冰浴超聲5min，快速除去其中的CO2并打散酵母細(xì)胞。將打散的下面啤酒種酵母與原漿啤酒酵母按表1比例加入到無菌試管中，充分混勻，得到不同比例的酵母混合液。
表1原漿啤酒酵母與下面啤酒種酵母混合比例
注：下面啤酒種酵母液細(xì)胞濃度為4600萬個細(xì)胞/mL(w/mL)；原漿啤酒酵母培養(yǎng)液細(xì)胞濃度為3400萬個細(xì)胞/mL(w/mL)。w代表酵母數(shù)量“萬個”。
2、檢測
分別用無菌吸管吸取1mL酵母混合液于9cm的平板培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中倒入45℃的YNB-GVBA培養(yǎng)基20mL，充分混勻，靜置凝固后36℃培養(yǎng)2d，檢測結(jié)果如表1所示，即每毫升下面啤酒種酵母液中含有340個原漿啤酒酵母細(xì)胞數(shù)時便可被檢出。
分別用無菌吸管吸取10mL酵母混合液于9cm的培養(yǎng)皿中，倒入50℃的YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基10mL，充分混勻，靜置凝固后36℃培養(yǎng)2d，檢測結(jié)果如表2所示(含單料培養(yǎng)基檢測結(jié)果)。
表2原漿啤酒酵母與下面啤酒種酵母混合比例及檢測結(jié)果
注：“+”代表檢出；“-”代表未檢出；雙料培養(yǎng)基檢測過程中，原漿啤酒酵母培養(yǎng)液細(xì)胞液濃度為4000萬個細(xì)胞/mL(w/mL)。w代表酵母數(shù)量“萬個”。
采用YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基時，下面啤酒種酵母液中原漿啤酒酵母的最低檢出限則為40個細(xì)胞/mL，即每毫升下面啤酒種酵母液中含有40個原漿啤酒酵母細(xì)胞數(shù)時便可被檢出。
實(shí)施例2由下面啤酒發(fā)酵液中檢出原漿啤酒酵母
1、原漿啤酒酵母-下面啤酒發(fā)酵液混合液的制備
將待檢原漿啤酒酵母培養(yǎng)液冰浴超聲5min，快速除去其中的CO2，并打散酵母細(xì)胞。用無菌吸管吸取打散酵母細(xì)胞后的啤酒酵母培養(yǎng)液1mL，沿管壁緩緩注入含9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦振蕩，混合均勻，制成10-1的樣品勻液。再用無菌吸管吸取10-1的樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入含9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦振蕩，混合均勻，制成10-2的樣品勻液。以此類推，分別制成10-3、10-4、10-5、10-6的原漿啤酒酵母稀釋液。
將下面啤酒發(fā)酵液冰浴超聲10min，快速除去其中的CO2，并打散酵母細(xì)胞。將下面啤酒發(fā)酵液中打散的酵母細(xì)胞與原漿啤酒酵母按表3比例加入到無菌試管中，充分混勻，得到不同比例的酵母混合液。
表3原漿酵母與下面啤酒發(fā)酵液混合比例及檢測結(jié)果
注：“+”代表檢出，“-”代表未檢出；本實(shí)施例測試過程中，原漿啤酒酵母培養(yǎng)液細(xì)胞濃度為390萬個細(xì)胞/mL(w/mL)。w代表酵母數(shù)量“萬個”。
2、檢測
分別用無菌吸管吸取1mL、10mL酵母混合液于9cm的培養(yǎng)皿中。盛1mL酵母混合液的培養(yǎng)皿中倒入50℃的YNB-GVBA培養(yǎng)基20mL，充分混勻，靜置凝固后36℃培養(yǎng)3d；盛10mL酵母混合液的培養(yǎng)皿中倒入50℃的YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基10mL，充分混勻，靜置凝固后36℃培養(yǎng)3d，檢測結(jié)果如表3所示。下面啤酒發(fā)酵液中原漿啤酒酵母的最低檢出限為：
YNB-GVBA單料培養(yǎng)基中為390個細(xì)胞/mL，即每毫升下面啤酒發(fā)酵液中含有390個原漿啤酒酵母細(xì)胞數(shù)時便可在YNB-GVBA培養(yǎng)基中被檢出；
YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基中為39個細(xì)胞/mL，即每毫升下面啤酒發(fā)酵液中含有39個原漿啤酒酵母細(xì)胞數(shù)時便可在YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基中被檢出。
實(shí)施例3由下面啤酒回收酵母泥中檢測原漿啤酒酵母
1、原漿啤酒酵母-下面啤酒回收酵母泥混合液的制備
將待檢原漿啤酒酵母培養(yǎng)液冰浴超聲10min，快速除去其中的CO2，并打散酵母細(xì)胞。用無菌吸管吸取打散酵母細(xì)胞后的啤酒酵母培養(yǎng)液1mL，沿管壁緩緩注入含9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦振蕩，混合均勻，制成10-1的樣品勻液。再用無菌吸管吸取10-1的樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入含9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦振蕩，混合均勻，制成10-2的樣品勻液。以此類推，分別制成10-3、10-4、10-5、10-6的原漿啤酒酵母稀釋液。
將稀釋10倍的下面啤酒回收酵母泥冰浴超聲10min，快速除去其中的CO2，并打散酵母細(xì)胞。將稀釋并打散酵母細(xì)胞后的下面啤酒回收酵母泥與原漿啤酒酵母按表4比例加入無菌試管中，充分混勻，得到不同比例的酵母混合液。
2、檢測
分別用無菌吸管吸取1mL、10mL酵母混合液于9cm的培養(yǎng)皿中。盛1mL酵母混合液的培養(yǎng)皿中倒入50℃的YNB-GVBA培養(yǎng)基20mL，充分混勻，靜置凝固后36℃培養(yǎng)3d；盛10mL酵母混合液的培養(yǎng)皿中倒入50℃的YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基10mL，充分混勻，靜置凝固后36℃培養(yǎng)3d，檢測結(jié)果如表4所示。下面啤酒發(fā)酵液中原漿啤酒酵母的最低檢出限為：
YNB-GVBA單料培養(yǎng)基中為370個細(xì)胞/mL，即每毫升下面啤酒回收酵母泥中含有370個原漿啤酒酵母細(xì)胞數(shù)時便可在YNB-GVBA培養(yǎng)基中被檢出；
YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基中為37個細(xì)胞/mL，即每毫升下面啤酒回收酵母泥中含有37個原漿啤酒酵母細(xì)胞數(shù)時便可在YNB-GVBA雙料培養(yǎng)基中被檢出。
表4原漿啤酒酵母與下面啤酒回收酵母泥混合比例及檢測結(jié)果
注：“+”代表檢出，“-”代表未檢出；本實(shí)施例測試過程中，原漿啤酒酵母培養(yǎng)液細(xì)胞濃度為370萬個細(xì)胞/mL(w/mL)。w代表酵母數(shù)量“萬個”。