本發(fā)明屬于環(huán)境污染物的檢測方法領域，具體涉及一種節(jié)球藻毒素生物毒性的檢測方法。該方法運用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)進行檢測，建立了準確檢測節(jié)球藻毒素水樣生物毒性的方法。本方法最終結(jié)果準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，是對現(xiàn)有方法的有效改進。。

背景技術：

淡水藍藻水華過程中產(chǎn)生的藍藻毒素威脅著水域生態(tài)系統(tǒng)的健康，其中尤以藍藻毒素危害最為嚴重。其中節(jié)球藻毒素是最近發(fā)現(xiàn)的新型藻毒素。節(jié)球藻毒素是由泡沫節(jié)球藻產(chǎn)生的一種環(huán)五肽肝毒素，具有嚴重的肝毒性、基因毒性、胚胎毒性和遺傳毒性，同時還是腫瘤的引發(fā)劑和促進劑，并可以在生物和環(huán)境中進行富集和轉(zhuǎn)化。通常情況下水體中節(jié)球藻毒素含量極低，而在水華水體中卻可以達到幾百甚至幾千μg/L。此類毒素具有水溶性，長期攝入會對人體造成危害。我國目前常用的水處理工藝難以將其徹底去除，使人們的身體健康受到威脅。

目前采用藻類毒素的毒性檢測通常采用生物檢測法，如小鼠口服或注射來間接衡量毒性，毒性強弱用半致死劑量表示。此外還有用無脊椎動物如蝦、貝、水蚤及其卵進行毒性評價的研究，以發(fā)光細菌進行毒性試驗也有報道。此類方法只可較粗略地判斷藻提取物是否有急性毒性，靈敏度較低，毒素消耗量大，需要大量的動物試驗品，存在倫理問題，并且只能檢測總的毒性，不能檢測出細胞凋亡和壞死，對慢性毒性缺乏定量評價。而細胞毒性檢測技術不僅可以對毒素進行定性鑒定，并且能對其進行精確的定量測定。目前報道有使用鯽魚巨噬細胞、草魚淋巴細胞等水生動物細胞檢測毒性機理[1]，本發(fā)明將人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為生物標志物進行節(jié)球藻毒素的生物毒性評價，實現(xiàn)定量化檢測節(jié)球藻毒素對人體心血管的毒性效應，更具有針對性，水質(zhì)生物毒性評價的靈敏性和準確性更高，能為水體污染提供預警技術支持，保障供水水質(zhì)安全。

[1].張杭君等,節(jié)球藻毒素對草魚淋巴細胞凋亡毒性效應及機理.應用生態(tài)學報,2013(10):第2977-2982頁.

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有節(jié)球藻毒素生物毒性檢測方法中存在結(jié)果粗略，靈敏度較低，毒素消耗量大，需要大量的動物試驗品等問題，提供一種用于測試水中節(jié)球藻毒素生物毒性的檢測方法。本發(fā)明將人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為生物標志物進行節(jié)球藻毒素的生物毒性評價，實現(xiàn)利用細胞凋亡率和壞死率定量化檢測節(jié)球藻毒素對人體心血管的毒性效應。

本發(fā)明技術方案為：

一種用于檢測節(jié)球藻毒素生物毒性的制備方法，其特征在于，按如下步驟進行：

(1)人臍靜脈內(nèi)皮細胞置于溫度為37℃，空氣濕度為95％(含5％CO₂)的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)于含10-20％胎牛血清、60μg/mL內(nèi)皮細胞生長添加劑和1％青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液。

(2)取傳代2-3代的細胞，分別加入磷酸緩沖液(PBS)為空白樣品A,加入節(jié)球藻毒素水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩2小時。

(3)將樣品A和B用PBS洗滌細胞二次，并分別配成濃度為1×105-1×106cells/mL細胞懸液；

(4)A、B樣品均加入5μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5μL碘化丙啶(PI)，混勻；室溫、避光、反應5-15min；在1小時內(nèi)，進行流式細胞儀檢測。

(5)用流式細胞術(激發(fā)波長Ex＝488nm；發(fā)射波長Em＝530nm)檢測死細胞、活細胞和凋亡細胞的比例。

(6)結(jié)果計算：通過流式細胞儀自帶軟件(BD FACSCanto II Flow Cytometer,為現(xiàn)有通用方法)測出的樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可簡便、可靠的判定水質(zhì)毒性。

本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點：

(1)人臍靜脈內(nèi)皮細胞是介于血管壁組織和血液之間的一層單核細胞，它是血液中的化合物或毒素從血管管腔進入血管壁深層的第一道屏障，因而也將成為進入血液的藻毒素進攻的首道屏障。因此可用其細胞的凋亡率和死亡率簡便、可靠的判定水質(zhì)判斷對人體心血管的毒性作用。

(2)能定量測定細胞凋亡率和壞死率，結(jié)果準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能更細致的判斷節(jié)球藻毒素生物毒性。

該方法運用人臍靜脈內(nèi)皮細胞針對節(jié)球藻毒素進行生物毒性檢測，最終結(jié)果準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，影響因素少，是對現(xiàn)有方法的有效改進，具有較高的實用價值和應用潛力。

附圖說明

圖1為實施例1檢測的結(jié)果示意圖。

圖2為實施例2檢測的結(jié)果示意圖。

具體實施方式

實施例1

本發(fā)明應用于5μg/mL節(jié)球藻毒素(NOD)生物毒性檢測：

(1)人臍靜脈內(nèi)皮細胞置于溫度為37℃，空氣濕度為95％(含5％CO₂)的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)于含20％胎牛血清、60μg/mL內(nèi)皮細胞生長添加劑和1％青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液。

(2)取傳代3代的細胞，分別加入磷酸緩沖液(PBS)為空白樣品A,加入節(jié)球藻毒素水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩2小時。

(3)將樣品A和B用PBS洗滌細胞二次，并分別配成濃度約為1×10⁵cells/mL細胞懸液；

(4)A、B樣品均加入5μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5μL碘化丙啶(PI)，混勻；室溫、避光、反應5-15min；在1小時內(nèi)，進行流式細胞儀檢測。

(5)用流式細胞術(激發(fā)波長Ex＝488nm；發(fā)射波長Em＝530nm)檢測死細胞、活細胞和凋亡細胞的比例。

(6)結(jié)果計算：通過流式細胞儀自帶軟件(BD FACSCanto II Flow Cytometer,為現(xiàn)有通用方法)測出的樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可簡便、可靠的判定水質(zhì)毒性。

圖1是按上述方法檢測的結(jié)果示意圖。

將上述方法應用于模擬節(jié)球藻毒素水質(zhì)生物毒性檢測，得出細胞總死亡率為55.58％。

實施例2

本發(fā)明應用于10μg/mL節(jié)球藻毒素(NOD)生物毒性檢測：

(1)人臍靜脈內(nèi)皮細胞置于溫度為37℃，空氣濕度為95％(含5％CO₂)的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)于含10％胎牛血清、60μg/mL內(nèi)皮細胞生長添加劑和1％青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液。

(2)取傳代3代的細胞，分別加入磷酸緩沖液(PBS)為空白樣品A,加入節(jié)球藻毒素水樣為檢測樣品B，放置于混勻器上震蕩2小時。

(3)將樣品A和B用PBS洗滌細胞二次，并分別配成濃度約為5×10⁵cells/mL細胞懸液，；

(4)A、B樣品均加入5μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5μL碘化丙啶(PI)，混勻；室溫、避光、反應5-15min；在1小時內(nèi)，進行流式細胞儀檢測。

(5)用流式細胞術(激發(fā)波長Ex＝488nm；發(fā)射波長Em＝530nm)檢測死細胞、活細胞和凋亡細胞的比例。

(6)結(jié)果計算：通過流式細胞儀自帶軟件(BD FACSCanto II Flow Cytometer,為現(xiàn)有通用方法)測出的樣品B的凋亡率和死亡率對照空白樣品A，即可簡便、可靠的判定水質(zhì)毒性。

圖2是按上述方法檢測的結(jié)果示意圖。

將上述方法應用于模擬節(jié)球藻毒素水質(zhì)生物毒性檢測，得出細胞總死亡率為77.74％。