本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種NF-κB活化因子1(NF-κB activator 1，ACT1)作為藥物靶標在篩選治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的藥物中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征、嚴重危害人類健康的代謝性疾病。臨床上主要以I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠型糖尿病為主；其中，II型糖尿病最多見，約占總糖尿病患者的90％-95％?，F(xiàn)在全球患II型糖尿病的人數(shù)已超過20年前的兩倍。在2015年，國際糖尿病聯(lián)合會估計全球患糖尿病的人數(shù)已超過4.15億。糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素的復合病因引起的，可能與胰島素抵抗和胰腺β細胞功能缺陷有關(guān)，但其病因和發(fā)病機制仍未完全闡明；且長期碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害，導致眼、腎、神經(jīng)、心臟和血管等組織器官發(fā)生慢性進行性病變和功能減退甚至衰竭。

肝臟是物質(zhì)代謝的中樞，具有諸如調(diào)控葡萄糖和脂質(zhì)以及其他物質(zhì)的合成與分解的重要生理功能。脂肪肝是指各種原因引起肝細胞發(fā)生脂肪變性和脂質(zhì)積聚。當肝臟中脂質(zhì)的流入和合成超過脂質(zhì)的流出和分解時，即可形成脂肪肝。糖尿病和脂肪肝可互相影響，糖尿病可促進脂肪肝進一步發(fā)展為脂肪肝肝炎、肝硬化、甚至肝細胞性肝癌；而脂肪肝可促進糖尿病發(fā)生急性嚴重代謝紊亂，如糖尿病酮癥酸中毒和高滲高血糖綜合征等。研究結(jié)果顯示，在糖尿病人群中，非酒精性脂肪肝患病率可高達80％。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，II型糖尿病合并脂肪肝的患病率正逐年增加。

NF-κB活化因子1(NF-κB activator 1，ACT1)是活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的重要蛋白分子。ACT1由574個氨基酸組成，包含2個腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)結(jié)構(gòu)域、1個螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域和1個SEFIR結(jié)構(gòu)域(1)。在IL-17的刺激下，IL-17受體可通過SEFIR-SEFIR結(jié)構(gòu)域相互作用，來招募ACT1(2)：ACT1可與Traf6和TAK1相互作用來激活NF-κB信號通路；I Kappa B激酶i(IKKi)磷酸化ACT1，促發(fā)ACT1的構(gòu)象發(fā)生改變，可減少ACT1對Traf6親和力，并促進ACT1與Traf2/5結(jié)合，從而激活促分裂原活化蛋白激酶信號(MAPK)信號通路(3-5)。因此，ACT1是IL-17受體下游信號通路中關(guān)鍵接頭蛋白分子。且有研究表明，高濃度的IL-17與諸如哮喘、類風濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等自身免疫性疾病和炎癥性疾病有關(guān)(4，6，7)。

參考文獻：

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(3)Chang SH,Park H,Dong C.Act1 adaptor protein is an immediate and essential signaling component of interleukin-17 receptor.The Journal of biological chemistry.2006 Nov 24；281(47):35603-7.

(4)Qian Y,Liu C,Hartupee J,Altuntas CZ,Gulen MF,Jane-Wit D,Xiao J,Lu Y,Giltiay N,Liu J,Kordula T,Zhang QW,Vallance B,Swaidani S,Aronica M,Tuohy VK,Hamilton T,Li X.The adaptor Act1 is required for interleukin 17-dependent signaling associated with autoimmune and inflammatory disease.Nature immunology.2007 Mar；8(3):247-56.

(5)Schwandner R,Yamaguchi K,Cao Z.Requirement of tumor necrosis factor receptor-associated factor(TRAF)6 in interleukin 17 signal transduction.The Journal of experimental medicine.2000Apr 3；191(7):1233-40.

(6)May MJ.IL-17R signaling:new players get in on the Act1.Nature immunology.2011 Sep；12(9):813-5.

(7)Shembade N,Harhaj EW.IKKi:a novel regulator of Act1,IL-17 signaling and pulmonary inflammation.Cellular&molecular immunology.2011 Nov；8(6):447-9.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種ACT1基因的表達與脂肪肝和Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一種ACT1作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用，進而提供一種ACT1的抑制劑在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以野生型C57小鼠與ACT1基因敲除小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究ACT1基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對比，ACT1基因敲除小鼠的體重、空腹血糖水平明顯低于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)，ACT1基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯增強。從小鼠肝臟重量、肝臟/體重比和脂質(zhì)成分含量測定等均說明HFD組(High fat diet，高脂飲食)的ACT1-KO小鼠脂肪肝病變明顯好轉(zhuǎn)，脂質(zhì)蓄積顯著減少。這表明ACT1基因敲除會顯著改善脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，ACT1基因具有惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用，為研究防治脂肪肝和II型糖尿病的新靶點和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。

因此，ACT1基因可作為藥物靶點，構(gòu)建ACT1基因過表達的體外細胞模型或動物模型，用于篩選預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物；

ACT1基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計并制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物和/或生物學試劑，通過基因工程技術(shù)達到預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以ACT1為靶基因，設(shè)計可干擾ACT1表達的雙鏈siRNA，通過化學方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使ACT1基因沉默來治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿??；還可以設(shè)計并構(gòu)建ACT1的突變體，注射后進入細胞，競爭ACT1原形的作用底物，從而抑制ACT1的功能，起到治療目的；此外，還可以以ACT1為靶點設(shè)計小分子化合物抑制劑，利用ACT1基因過表達的體外細胞模型或動物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制ACT1的分子，從而為脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治療提供新的治療性分子。

針對ACT1的上述功能，提供ACT1作為藥物靶標在篩選保護肝臟及糖代謝的藥物中的應(yīng)用。

針對ACT1的上述功能，提供ACT1作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

針對ACT1的上述功能，提供ACT1的抑制劑在制備保護肝臟及糖代謝的藥物中的應(yīng)用。

針對ACT1的上述功能，提供ACT1的抑制劑在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

一種保護肝臟及糖代謝的藥物，包含ACT1的抑制劑。

一種預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物，包含ACT1的抑制劑。

所述的ACT1的抑制劑優(yōu)選為ACT1基因的siRNA、ACT1基因的RNA干擾載體，ACT1的抗體及其他能夠抑制ACT1表達的抑制劑。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ACT1基因的新功能，即ACT1基因能夠惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。

(2)基于ACT1基因在惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能，其為研制預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物提供靶標。

(3)ACT1的抑制劑可用于制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。

附圖說明

圖1是WT和ACT1-KO小鼠的體重和空腹血糖結(jié)果圖；

A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計圖(*：p＜0.05vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT NC組，#：p＜0.05vs WT HFD組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖2是WT和ACT1-KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；

A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統(tǒng)計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(area under the curve，AUC)比較圖(**：p＜0.01vs WT NC組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖3是WT和ACT1-KO小鼠的肝臟重量和肝臟脂質(zhì)含量結(jié)果圖；

肝臟脂質(zhì)含量包括肝臟甘油三酯、肝臟膽固醇和肝臟游離脂肪酸(##：p＜0.01vs WT HFD組)。

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實驗用動物及飼養(yǎng)：

實驗動物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6(WT)小鼠和ACT1基因敲除小鼠(ACT1-KO)小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司；ACT1-KO小鼠購自美國TIGM公司，登記號：NM_134000。

實驗動物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。

動物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學SPF級實驗動物中心。每12小時交替照明，溫度24±2℃，濕度40％-70％，小鼠自由飲水進食。

【實施例1】小鼠脂肪肝和Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)獲得

(1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和ACT1-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個組別。

(2)模型通過高脂飼料誘導操作流程：

采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，進行表型相關(guān)分析，明確ACT1基因?qū)χ靖魏廷蛐吞悄虿“l(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和ACT1-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個組別。每周均詳細記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔4周檢測1次。實驗第22周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對葡萄糖耐受能力，第24周終末取材，取出小鼠肝臟，測定肝臟脂質(zhì)含量。

【實施例2】小鼠體重和血糖水平測定

(1)小鼠空腹體重，食量檢測

1)體重檢測。

①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實驗操作。

②稱重：分別在第0周、4周、8周、12周、16周、20周和24周稱重，將一塑料小桶放在動態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測：待稱體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。

(2)空腹血糖水平檢測實驗

將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時后開始實驗操作。

①血糖儀準備：檢查血糖儀(美國強生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進入待測狀態(tài)。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示讀數(shù)。

Ⅱ型糖尿病損傷嚴重程度的評估指標主要包括體重和血糖等水平，體重和血糖變化結(jié)果如圖1所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與ACT1-KO小鼠24周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第8周開始HFD組的ACT1-KO小鼠體重明顯低于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第24周(見圖1A)；經(jīng)空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第4周、8周、12周、16周、20周和24周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對照組升高，HFD組的ACT1-KO小鼠空腹血糖水平也明顯低于WT組小鼠空腹血糖水平(見圖1B)。表明ACT1基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，ACT1基因敲除能顯著改善小鼠的糖代謝能力，這些結(jié)果表明ACT1基因在高脂誘導引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。

【實施例3】葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

實驗第22周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對糖耐受能力。

(1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計算葡萄糖的注射體積。

(2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進針定位及注射：從腹部一側(cè)進針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進針，回抽，注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。

(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測時間。

進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第22周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和ACT1-KO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增達到峰值，隨著時間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時血糖)，在2小時時恢復至空腹血糖水平，且ACT1-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時一直處于低于WT小鼠的血糖水平(圖2A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，發(fā)現(xiàn)WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，ACT1-KO HFD組的AUC顯著小于WT HFD組的AUC(圖2B)，表明ACT1基因敲除能夠顯著促進糖代謝穩(wěn)態(tài)。

【實施例4】肝臟質(zhì)量及肝臟組織脂質(zhì)成分測定

(1)終末肝臟組織取材

1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。

2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速拍照，稱重。

(2)肝臟脂質(zhì)成分測定

①從-80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育過夜。

②以12000g高速離心15min后，收集管底脂質(zhì)層物質(zhì)，風干，以去除水分。

③將分離出的脂質(zhì)層物質(zhì)溶于200μL含1％Triton X-100的PBS溶液中，仔細吹吸混勻。

④開啟電腦labman軟件，打印機，再開啟生化分析儀；

⑤選擇并清洗檢測探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設(shè)定的參考范圍；

⑥在labman軟件上檢查所需檢測指標試劑是否足夠，設(shè)定檢測指標和檢測順序等。

⑦將制得的混勻液上機檢測，分析。

在HFD組的ACT1-KO小鼠肝臟重量較HFD組的WT小鼠低(如圖3)。對肝臟中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸進行檢測，發(fā)現(xiàn)在HFD組的ACT1-KO小鼠肝臟中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸均較HFD組的WT小鼠低(如圖3)。這些結(jié)果說明ACT1基因敲除小鼠的脂肪肝明顯改善。

上述結(jié)果顯示ACT1-KO小鼠在HFD的誘導下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變明顯好轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明ACT1基因能顯著促進糖代謝紊亂、促進肝臟脂質(zhì)形成和脂肪肝形成。本發(fā)明結(jié)果說明ACT1基因在脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的惡化作用。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。