本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及百合組培苗枯萎病抗性快速鑒定方法。

背景技術(shù)：

百合(Lilium spp.)被譽(yù)為“球根花卉之王”，是世界五大鮮切花之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2009年全球種球生產(chǎn)面積為35,749公頃,其中荷蘭種植面積為23,561公頃，占66％，英國(guó)種植面積為5,400公頃，占15％，中國(guó)種植面積為4,680公頃，占13％。全球百合種球的貿(mào)易額已達(dá)20多億美元，年貿(mào)易量達(dá)25億粒以上。據(jù)農(nóng)業(yè)部的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2013年百合鮮切花銷(xiāo)售額達(dá)42.95億元，位居鮮切花銷(xiāo)售額的首位，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)是引起百合枯萎病的土傳真菌，全世界百合種植區(qū)域均有被其感染和危害。云南作為我國(guó)重要的百合優(yōu)質(zhì)鮮切花產(chǎn)區(qū)，枯萎病時(shí)有爆發(fā)，輕者導(dǎo)致產(chǎn)量損失20-30％，嚴(yán)重時(shí)可造成百合絕收，且污染種植土壤，極大影響云南百合花卉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。鐮刀菌是一種在許多作物上引起嚴(yán)重病害的土傳真菌，很難進(jìn)行有效控制。因此選育和利用抗病品種成為主要的防治措施，對(duì)百合品種資源、雜交親本及雜交后代進(jìn)行抗病性快速鑒定，可加速百合抗病品種選育的進(jìn)程。

近年來(lái)，百合枯萎病的相關(guān)研究開(kāi)展的較多，針對(duì)抗性鑒定通常采用鱗片接種法、百合植株噴霧接種法，鱗片接種法主要措施是：將百合鱗片包埋(接種)于混合有尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型的土壤中培育，調(diào)查鱗片的發(fā)病情況，從而鑒定出百合種質(zhì)資源材料或品種的抗性。該方法存在接種土壤準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)，且無(wú)法確定接種的濃度,調(diào)查時(shí)間長(zhǎng)需要到60d之后才能調(diào)查等不足。百合植株噴霧接種的主要措施是配制一定濃度的孢子懸浮液，然后接種于百合植株上并調(diào)查植株的發(fā)病情況，從而鑒定出百合種質(zhì)資源材料或品質(zhì)的抗性，該方法存在所需的百合植株較多，溫濕度不好控制，需配備一定的植物生長(zhǎng)箱或接種溫室等不足。因此，目前還缺乏快速抗性鑒定的較好方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述缺乏百合枯萎病快速鑒定的技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明提供一種百合組培苗枯萎病抗性的快速鑒定方法。

本發(fā)明提供一種百合組培苗枯萎病抗性的快速鑒定方法：包括以下步驟：

(1)接種孢子懸浮液的準(zhǔn)備：將尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型(Fusarium oxysproum f.sp.lilii)菌種用PSA培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10d后，取尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型菌種用無(wú)菌水配成尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型菌種孢子為1.0×10⁶個(gè)/ml的接種孢子懸浮液；

(2)供試百合組培苗的準(zhǔn)備：將供試的百合組培苗切根后置于盛有百合組培苗水培液的水培瓶中待接種，每個(gè)水培瓶裝入20ml百合組培苗水培液，每個(gè)水培瓶放置10株切根的百合組培苗；所述百合組培苗水培液由大量元素母液10ml、微量元素母液10ml、鐵鹽母液10ml、有機(jī)母液10ml混合后，再加去離子水稀釋至1L然后滅菌而成；

所述大量元素母液的配制：稱(chēng)取NH₄NO₃165g、KNO₃190g、CaCl₂·2H₂O 44g、MgSO₄·7H₂O 37g、KH₂PO₄17g，加去離子水定容至1L，備用；

所述微量元素母液的配制：稱(chēng)取H₃BO₃0.62g、MnSO₄·H₂O 2.23g、ZnSO₄·7H₂O 0.86g、KI 0.83g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.025g、CuSO₄·5H₂O 0.0025g、CoCl₂·6H₂O 0.0025g，加去離子水定容至1L，備用；

所述鐵鹽母液的配制：稱(chēng)取FeSO₄·7H₂O 2.78g、EDTA 3.73g，加去離子水定容至1L，備用；

所述有機(jī)母液的配制：稱(chēng)取肌醇10g、甘氨酸0.2g、煙酸0.05g、硫胺素0.01g、吡哆醇0.05g，加去離子水定容至1L，備用；

(3)取步驟(1)所述的接種孢子懸浮液加入步驟(2)所述的水培瓶中，每個(gè)水培瓶加入2ml接種孢子懸浮液，每品種設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)接種30株切根的百合組培苗；以清水為對(duì)照，接種后，將水培瓶放入25℃玻璃溫室中日常管理；

(4)按如下0-4級(jí)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行發(fā)病程度分級(jí)，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)??；1級(jí)：1～2片葉片葉緣卷曲萎蔫；2級(jí)：3-4片葉片卷曲萎蔫；3級(jí)：4-6片葉片卷曲萎蔫；4級(jí)：葉片全部萎蔫或死亡。

(5)病情調(diào)查：接種后7d、14d、21d調(diào)查發(fā)病情況，記錄發(fā)病率及病情指數(shù)；抗性以高抗、中抗、中感、高感表示，按每個(gè)種質(zhì)或每個(gè)品種的供試百合組培苗的平均病情指數(shù)劃分百合種質(zhì)或百合品種對(duì)病菌的抗性等級(jí)，平均病情指數(shù)≤20.0的為高抗，病情指數(shù)為20.1～50.0的為中抗，病情指數(shù)為50.1～80.0的為中感，病情指數(shù)≥80.1的為高感；

平均病情指數(shù)＝三個(gè)重復(fù)的病情指數(shù)的平均數(shù)；

病情指數(shù)按下列公式計(jì)算：

其中：代表數(shù)值為：病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的級(jí)數(shù)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明直接采用組培苗水培接種鑒定，與百合植株噴霧接種相比，避免了環(huán)境溫度和濕度對(duì)鑒定結(jié)果的影響，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性；本發(fā)明將孢子懸浮液加入水培液中的方法，使得接種時(shí)易于操作；組培苗在室內(nèi)進(jìn)行抗病性篩選條件較易控制，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力。本發(fā)明方法鑒定周期為30d，現(xiàn)有的鱗片法鑒定周期為80d，百合植株噴霧接種鑒定周期為35d(但存在如上所述易受環(huán)境溫度和濕度對(duì)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響)。

本發(fā)明為鑒定百合資源、雜交親本、雜交后代對(duì)百合枯萎病的抗性提供了簡(jiǎn)單易行的方法，為加速百合抗病品種的選育奠定了較好的技術(shù)基礎(chǔ)，具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用前景。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是ITS引物的上游引物ITS1的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是ITS引物的下游引物ITS4的堿基序列。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例中所用的尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型(Fusarium oxysproum f.sp.lilii)菌種為申請(qǐng)人分離鑒定保存的菌種，具體分離方法為：取發(fā)病植株病健交界處的組織，將組織切為0.2cm²大小的小塊，用0.1％的升汞消毒1min，再用無(wú)菌水清洗三次后接種于PSA培養(yǎng)基上，待菌長(zhǎng)出后鏡檢，初步從形態(tài)確定其為尖孢鐮刀菌(形態(tài)確定依據(jù)《百合枯萎病病原鑒定與ITS序列分析》(作者楊秀梅)，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010年6月，1914-1916。)，再用瓊膠稀釋平板法純化培養(yǎng)，之后用ITS引物擴(kuò)增后經(jīng)Genbank BLAST比對(duì)后進(jìn)一步鑒定為尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型。所述ITS引物由上游引物ITS1和下游引物ITS4組成，所述上游引物ITS1的堿基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物ITS4的堿基序列如SEQ ID NO：2所示。

ITS引物擴(kuò)增的25μL反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol·L^-1dNTP 2.5μL，20pmol/μL引物ITS10.5μL，20pmol/μL引物ITS4 0.5μL，5U/TaqDNA聚合酶0.5μL，20ng模板DNA 1μL，ddH₂O 17.5μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。所述尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型(Fusarium oxysproum f.sp.lilii)菌種已在2010年6月(頁(yè)碼1914-1916)的西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)《百合枯萎病病原鑒定與ITS序列分析》(作者楊秀梅)公開(kāi)，申請(qǐng)人保證自本專(zhuān)利申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放所述的生物材料尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型(Fusarium oxysproum f.sp.lilii)菌種。實(shí)施例中無(wú)特殊說(shuō)明的為常規(guī)方法。

實(shí)施例

(1)接種孢子懸浮液的準(zhǔn)備：

將滅菌后的PSA培養(yǎng)基倒在平板上，再將尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型(Fusarium oxysproum f.sp.lilii)菌種接種在平板上用PSA培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，取尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型菌種用無(wú)菌水配制成尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型菌種孢子為1.0×10⁶個(gè)/ml的接種孢子懸浮液；

所述PSA培養(yǎng)基即馬鈴薯蔗糖瓊膠培養(yǎng)基，其制備方法：將洗凈后去皮的馬鈴薯200g切碎，加水1000ml煮沸半小時(shí)，用紗布濾去馬鈴薯，在濾液中加水補(bǔ)足至1000ml，然后加蔗糖20g和瓊膠20g，于103.4kPa，121℃條件下滅菌15mim后即得PSA培養(yǎng)基。

(2)供試百合組培苗的準(zhǔn)備：

供試的百合品種為東方系列百合、亞州系列百合、OT系列百合、LA系列百合、野生百合等幾大系列的百合品種供44份材料，詳見(jiàn)表1。所有供試的品種均采用組培生根苗，將供試的百合組培苗切根后置于盛有百合組培苗水培液的水培瓶中待接種，每個(gè)水培瓶裝入20ml百合組培苗水培液，每個(gè)水培瓶放置10株切根的百合組培苗；所述百合組培苗水培液由大量元素母液10ml、微量元素母液10ml、鐵鹽母液10ml、有機(jī)母液10ml混合后，再加去離子水稀釋至1L然后于103.4kPa，121℃條件下滅菌15mim而成；

所述大量元素母液的配制：稱(chēng)取NH₄NO₃165g、KNO₃190g、CaCl₂·2H₂O 44g、MgSO₄·7H₂O 37g、KH₂PO₄17g，加去離子水定容至1L，備用；

所述微量元素母液的配制：稱(chēng)取H₃BO₃0.62g、MnSO₄·H₂O 2.23g、ZnSO₄·7H₂O 0.86g、KI 0.83g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.025g、CuSO₄·5H₂O 0.0025g、CoCl₂·6H₂O 0.0025g，加去離子水定容至1L，備用；

所述鐵鹽母液的配制：稱(chēng)取FeSO₄·7H₂O 2.78g、EDTA 3.73g，加去離子水定容至1L，備用；

所述有機(jī)母液的配制：稱(chēng)取肌醇10g、甘氨酸0.2g、煙酸0.05g、硫胺素0.01g、吡哆醇0.05g，加去離子水定容至1L，備用；

(3)取步驟(1)配制好的接種孢子懸浮液加入步驟(2)所述的水培瓶中，每個(gè)水培瓶加入2ml所述接種孢子懸浮液，每品種設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)接種30株切根的百合組培苗；以清水為對(duì)照，接種后，將水培瓶放入25℃玻璃溫室中日常管理；

(4)按如下0-4級(jí)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行發(fā)病程度調(diào)查，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)??；1級(jí)：1～2片葉片葉緣卷曲萎蔫；2級(jí)：3-4片葉片卷曲萎蔫；3級(jí)：4-6片葉片卷曲萎蔫；4級(jí)：葉片全部萎蔫或死亡。

(5)病情調(diào)查：接種后7d、14d、21d調(diào)查發(fā)病情況，記錄發(fā)病率及病情指數(shù)；抗性以高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS)表示，按每個(gè)品種的供試百合組培苗的平均病情指數(shù)劃分百合品種對(duì)尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型病菌的抗性等級(jí)，平均病情指數(shù)≤20.0的為高抗，平均病情指數(shù)為20.1～50.0的為中抗，平均病情指數(shù)為50.1～80.0的為中感，平均病情指數(shù)≥80.1的為高感。

病情指數(shù)按下列公式計(jì)算：

代表數(shù)值是指：病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的級(jí)數(shù)即0級(jí)—4級(jí)。

平均病情指數(shù)＝三個(gè)重復(fù)的病情指數(shù)的平均數(shù)。

鑒定的百合品種病情指數(shù)見(jiàn)表1。

表1中所列的百合材料均為市售，可通過(guò)http://www.lilycompany.nl/en購(gòu)買(mǎi)。

表1百合種質(zhì)資源對(duì)尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型病菌的抗性鑒定結(jié)果

注：表1中O：東方百合；A：亞洲百合；OT:OT系列百合；LA：LA系列百合；S：植物學(xué)種。

上述實(shí)施例直接采用組培苗在室內(nèi)水培接種鑒定，對(duì)大量百合資源或品種的抗性篩選而言，其操作容易，且抗性篩選條件較易控制，避免了環(huán)境溫度和濕度對(duì)鑒定結(jié)果的影響，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，鑒定周期為30d，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力，為鑒定百合資源、雜交親本、雜交后代對(duì)百合枯萎病的抗性提供了簡(jiǎn)單易行的方法，為加速百合抗病品種的選育奠定了較好的技術(shù)基礎(chǔ)。

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所

<120> 一種百合組培苗枯萎病抗性的快速鑒定方法

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<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ITS引物的上游引物ITS1

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tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ITS引物的下游引物ITS4

<400> 2

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