本發(fā)明涉及藥物的技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液及活性測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)屬黃病毒科(Fla.viviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)，呈球形，直徑約為40—70 nm，有包膜。黃熱病病毒屬于黃熱病科黃熱病毒屬的病毒，為RNA病毒，具有嗜內(nèi)臟性及嗜神經(jīng)性，在室溫下容易死基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為10.8Kb?；蚪M包含一個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)多聚蛋白。

寨卡病毒最早于1947年從烏干達(dá)森林中的獼猴身上分離出來。1952年首次從人體分離出來。截至上世紀(jì)末，寨卡病毒感染被認(rèn)為僅在赤周圍的非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)散發(fā)，被證實(shí)的人類感染病例僅14例。該病毒自2007年開始出現(xiàn)暴發(fā)流行。2015年底至2016年初，美洲出現(xiàn)寨卡疫情，并通過旅游者輸入到其他國(guó)家。截至2016年2月，美洲、非洲、亞洲等地已有超過30個(gè)國(guó)家出現(xiàn)寨卡病毒傳播。雖然寨卡病毒感染者大部分癥狀較輕微，通常在發(fā)病3—7天后可自行痊愈，但醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為這種快速傳播的病毒可能與異常增多的新生兒小頭畸形有關(guān)聯(lián)。2016年2月1日，世界衛(wèi)生組織召開緊急會(huì)議，宣布寨卡病毒的暴發(fā)和傳播已經(jīng)構(gòu)成全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件。之后越來越多的證據(jù)顯示寨卡病毒感染和胎兒畸形以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間存在因果關(guān)系。

因此測(cè)出寨卡病毒表達(dá)的蛋白酶的活性并篩選出好的活性抑制劑對(duì)殺死這種病毒的傳播起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定寨卡病毒NS2B-NS3的活性方法，通常為熒光共振能量轉(zhuǎn)移法，如何提高測(cè)量的靈敏度以及更加直觀的呈現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為該酶活測(cè)定方法中最需改進(jìn)的部分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液及活性測(cè)定方法。

本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是:

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液，緩沖成分包括:三羥甲基氨基甲烷 10～100mM，氯化鈉0～20mM，CHAPS 0～1mM，半乳糖 0～20mM，體積分?jǐn)?shù)為10～40%的甘油；緩沖液的PH值為8.0～9.0。

本發(fā)明還可以采用以下技術(shù)措施：

三羥甲基氨基甲烷 10～20mM，氯化鈉0～5mM，CHAPS 0～1mM，半乳糖 0～20mM，體積分?jǐn)?shù)為10～20%的甘油；緩沖液的PH值為8.5～9.0。

緩沖液的緩沖成分為:三羥甲基氨基甲烷 10mM，CHAPS 1mM，半乳糖 20mM，體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油；緩沖液的PH值為9.0。

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定方法，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1至10:1的比率混合在16℃下連接10到18h；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽性克??；

E、將D中所述的LB平板上挑取陽性克隆，培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí)；

F、以5000rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌5-6次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent熒光儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；

L、蛋白濃度為100nM,熒光底物濃度為100μM，數(shù)據(jù)處理使用GraphPad Prism 軟件處理；

M、選用權(quán)利要求1、2或3中所述的緩沖液；利用緩沖液將蛋白濃度稀釋到終濃度100 nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的發(fā)光底物，搖動(dòng)25s，讀取數(shù)據(jù)。

上述寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶為NS2B-NS3。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液能夠在寨卡病毒的酶活檢測(cè)過程中提高蛋白酶的活性，進(jìn)而使應(yīng)用該緩沖液的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定方法所得結(jié)果更加準(zhǔn)確，從而對(duì)寨卡病毒的蛋白酶活性抑制劑篩選起到引導(dǎo)作用，進(jìn)而推動(dòng)寨卡病毒的針對(duì)性藥物研發(fā)進(jìn)程。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液中的CHAPS對(duì)蛋白和底物反應(yīng)的示意圖；

圖2是本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液中的甘油對(duì)蛋白酶活性的作用示意圖；

圖3是本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液的PH值對(duì)蛋白酶活性的作用示意圖；

圖4是本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液中的氯化鈉對(duì)蛋白酶活性的作用示意圖；

圖5是本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液中的三羥甲基氨基甲烷對(duì)蛋白酶活性的作用示意圖；

圖6是本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液中的半乳糖對(duì)蛋白酶活性的作用示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液，緩沖成分包括:三羥甲基氨基甲烷 10～100mM，氯化鈉0～20mM，CHAPS 0～1mM，半乳糖 0～20mM，體積分?jǐn)?shù)為10～40%的甘油；緩沖液的PH值為8.0～9.0。

實(shí)施例一：

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液，緩沖成分包括:三羥甲基氨基甲烷 100mM，氯化鈉20mM，體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油；緩沖液的PH值為8.0。

該緩沖液具有提高寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的作用。

實(shí)施例二：

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液，緩沖成分包括:三羥甲基氨基甲烷 50mM，氯化鈉10mM，CHAPS 0.5mM，半乳糖 10mM，體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油；緩沖液的PH值為8.5。

該緩沖液具有提高寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的作用。

實(shí)施例三：

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液，緩沖成分包括:三羥甲基氨基甲烷 20mM，氯化鈉5mM，CHAPS 1mM，半乳糖 20mM，體積分?jǐn)?shù)為15%的甘油；緩沖液的PH值為8.7。

該緩沖液具有提高寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的作用。

實(shí)施例四：

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液，緩沖成分包括:三羥甲基氨基甲烷 15mM，氯化鈉2M，CHAPS 0.6mM，半乳糖 15mM，體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油；緩沖液的PH值為9.0。

該緩沖液具有提高寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的作用。

實(shí)施例五：

如圖1至圖6中所示的各組分在不同配比及緩沖液在不同PH值下對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的作用示意圖，圖中的縱坐標(biāo)為蛋白酶的活性，橫坐標(biāo)為時(shí)間。圖1中自上而下的1mMCHAPS和0mMCHAPS之間的圖像的對(duì)比能夠明確得出通過提高CHAPS能夠提高蛋白酶和底物的親和力；圖2中自上而下的甘油濃度為40mM、30mM、20mM和10mM，可見隨著濃度的升高蛋白活性是升高的；圖3中自上而下三種不同PH值PH=9.0、8.5和8.0的環(huán)境中，當(dāng)PH=9.0時(shí)寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性最高；圖4中自上而下三種氯化鈉濃度分別為5mM、10mM和20mM，可見濃度越高蛋白酶的活性越低；圖5中自上而下所示10mM、20mM、50mM、100mM和200mM五種不同濃度的三羥甲基氨基甲烷，三羥甲基氨基甲烷的濃度越高蛋白酶的活性越低；圖6中自上而下所示20mM和0mM兩種濃度的半乳糖，可見半乳糖能夠提高蛋白酶和底物的親和力。

優(yōu)選地，本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定緩沖液，緩沖成分包括:緩沖液的緩沖成分為:三羥甲基氨基甲烷 10mM，CHAPS 1mM，半乳糖 20mM，體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油；緩沖液的PH值為9.0。

本實(shí)施例中的緩沖液提升蛋白酶活性的效果最佳。

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定方法一，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1的比率混合在16℃下連接10h，其中目標(biāo)載體為Novagene公司產(chǎn)品；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽性克?。?/p>

E、將D中所述的LB平板上挑取陽性克隆，培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16h；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌5次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300 mMNacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300 mMNacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent熒光儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；

L、蛋白濃度為100 nM,熒光底物濃度為100μM，數(shù)據(jù)處理使用GraphPad Prism 軟件處理；

M、利用本發(fā)明的緩沖液將蛋白濃度稀釋到終濃度100 nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的發(fā)光底物，搖動(dòng)25s，讀取數(shù)據(jù)。

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定方法二，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比10:1的比率混合在16℃下連接18h；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽性克?。?/p>

E、將D中所述的LB平板上挑取陽性克隆，培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌6次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent熒光儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；

L、蛋白濃度為100 nM,熒光底物濃度為100μM，數(shù)據(jù)處理使用GraphPad Prism 軟件處理；

M、利用緩沖液將蛋白濃度稀釋到終濃度100 nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的發(fā)光底物，搖動(dòng)25s，讀取數(shù)據(jù)。

本發(fā)明的高通量寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定方法三，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比8:1的比率混合在16℃下連接16h；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽性克??；

E、將D中所述的LB平板上挑取陽性克隆，培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.7時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)17h；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌6次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300 mMNacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶NS2B-NS3的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent熒光儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；

L、蛋白濃度為100 nM,熒光底物濃度為100μM，數(shù)據(jù)處理使用GraphPad Prism 軟件處理；

M、利用緩沖液將蛋白濃度稀釋到終濃度100 nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的發(fā)光底物，搖動(dòng)25s，讀取數(shù)據(jù)。

其中質(zhì)粒小提試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司的TIANprep產(chǎn)品。

熒光底物AC-LKRR-AMC為上海吉爾生化有限公司的產(chǎn)品。

Fluoraskan Ascent熒光儀為美國(guó)Thermo Scientific的產(chǎn)品。

目標(biāo)載體pET-duet-1為Novagene公司產(chǎn)品。

應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，如果在文中沒有特別說明，則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊(cè)等加以實(shí)施。

本文中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)用品（包括但不限于：化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等）之中，對(duì)于那些特殊的或者不宜獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法；未經(jīng)特別說明的，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，在本發(fā)明申請(qǐng)日之前，可以通過各種方式（例如購買、自行制備等）很方便地獲得。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種改變和改進(jìn)，而這些均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。