一種檢測(cè)半胱氨酸的試劑和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)半胱氨酸（Cys）的試劑，它是馬來(lái)酰亞胺衍生物:N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺。此試劑由7-氨基-4-甲基香豆素和順丁烯二酸酐在冰乙酸回流5小時(shí)制得，原料便宜，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，易于生產(chǎn)。本發(fā)明提供了半胱氨酸的定量檢測(cè)方法，是基于N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺，在pH為7.4的HEPES溶液中定量地檢測(cè)半胱氨酸的含量。該檢測(cè)方法，對(duì)半胱氨酸顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、靈敏、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)半胱氨酸的試劑和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及半胱氨酸檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種試劑及其合成方法，以及這種試劑在檢測(cè)半胱氨酸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]L-半胱氨酸(L-Cys)是20種天然氨基酸中唯一具有還原性基團(tuán)巰基(_SH)的氨基酸，它在生物體內(nèi)參與細(xì)胞的還原過(guò)程及蛋白質(zhì)、谷胱甘肽的合成。半胱氨酸在醫(yī)藥、食品添加劑及化妝品領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用，它可以用于一些抗生素以及治療皮膚損傷，增強(qiáng)生物體的抗病能力，具有重要的生物化學(xué)研究?jī)r(jià)值。此外，它也可以作為抗輻射劑及抗氧化劑。目前，關(guān)于L-Cys的分析方法主要有高效液相色譜法(潘峰，孫瑋，張青，等.高效液相色譜法測(cè)定血漿中同型半胱氨酸[J].氨基酸和生物資源，2010，32 (4):55-57.)、光度法(陳亞紅，李占靈，張會(huì)霞.酶抑制動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定L-半胱氨酸[J].分析試驗(yàn)室，2008，27 (1):38-41.;劉養(yǎng)清，韓素琴.亞硝酰鐵氰化鈉法測(cè)定復(fù)雜樣品中半胱氨酸含量的方法研究[J].山西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，14 (2):42-45.)、電化學(xué)方法(MohammadK.Amini,Jafar H.Khorasani,Shokooh S.Khaloo,et al.Cobalt (II) salophen-modifiedcarbon-paste electrode for potentiometric and voltammetric determination ofcysteine[J].Anal.Biochem, 2003，320:32-38.；N.Maleki，A.Safavi, F.Sedaghati，etal.Efficient electrocatalysis of L—cysteine oxidation at carbon ionic liquidelectrode [J].Anal.Biochem, 2007, 369: 149-153.)等。
[0003]在本發(fā)明中，合成了一種基于馬來(lái)酰亞胺的化合物，通過(guò)Cys和化合物在Michael加成反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)Cys的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的是提供一種合成簡(jiǎn)單、操作方便、選擇性高、水溶性好的定量檢測(cè)Cys的試劑，以及該試劑在Cys檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的快速檢測(cè)Cys的試劑和方法，是基于一種馬來(lái)酰亞胺衍生物N-[4-甲基香?素-rJ-基]馬來(lái)酸亞胺(N-[4-Methylcoumarin-7-yl]maleimide),在 pH 為
7.4的HEPES溶液中定量地檢測(cè)Cys的含量。該檢測(cè)方法，對(duì)Cys顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、靈敏、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。
[0006]該試劑的結(jié)構(gòu)式:
[0007]
【權(quán)利要求】
1.一種試劑:特征在于它是N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺，其結(jié)構(gòu)式為:
2.如權(quán)利要求1所述的一種試劑的合成方法，其特征在于，步驟為:7_氨基-4-甲基香豆素和順丁烯二酸酐按摩爾比1:1完全溶解在冰乙酸中，回流5小時(shí)，停止反應(yīng)；濃縮、冷卻后抽濾，并用碳酸鈉溶液洗滌，最后用苯重結(jié)晶得到土黃色固體。
3.—種檢測(cè)半胱氨酸的方法:其特征在于，步驟為: (1)、配制pH=7.4、濃度為IOmM的HEPES緩沖溶液，配制2mM的N_[4_甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺的甲醇溶液； (2)、按體積比20000:1，將HEPES緩沖溶液和N-[4-甲基香豆素_7_基]馬來(lái)酰亞胺的甲醇溶液加到干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著待測(cè)樣的加入，398nm的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)； (3)、把2mL的HEPES緩沖溶液、0.1 μ L的Ν_[4_甲基香豆素_7_基]馬來(lái)酰亞胺甲醇溶液加到另一個(gè)熒光比色皿中，分別在加入Cys溶液的體積為0.25,0.50,0.75、1.00、.1.25、1.50、1.75,2.00 μ L時(shí)，在熒光分光光度儀上測(cè)定398nm對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度F為104、.168、236、304、372、436、503、569，以Cys濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)熒光強(qiáng)度F — F。為縱坐標(biāo)繪制圖，F(xiàn)tl = 39，得到Cys濃度的工作曲線(xiàn)；線(xiàn)性回歸方程為:F — F0=-L 61+264.9c, c的單位為μ M ； (4)、將HEPES緩沖溶液2000uL和N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺甲醇溶液.0.1uL加到干凈的熒光比色皿中，用微量進(jìn)樣器吸取V ul待測(cè)樣品溶液，加入到此干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，將測(cè)得的熒光強(qiáng)度代入(3)的線(xiàn)性回歸方程，得至丨J濃度c，待測(cè)樣品Citew=ZOOOuLXcX 10_6/VuL，即可求得Cys的濃度。
【文檔編號(hào)】C07D405/04GK103788076SQ201410033092
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】陰彩霞, 霍方俊, 楊瑜濤 申請(qǐng)人:山西大學(xué)