本發(fā)明涉及一種基于手性自組裝納米傳感器實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)端粒酶活性檢測(cè)的方法，屬于材料化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：端粒酶是由蛋白質(zhì)和一段RNA鏈組成的核糖蛋白酶，它是一種能夠在真核生物染色體末端的DNA重復(fù)序列并使DNA得以延長(zhǎng)的逆轉(zhuǎn)錄酶。據(jù)研究表明，在正常組織細(xì)胞中端粒酶的活性很低甚至無(wú)活性，然而腫瘤細(xì)胞中端粒酶則大量表達(dá)且活性明顯增強(qiáng)，這就使得端粒酶的檢測(cè)對(duì)腫瘤診斷、預(yù)后判斷及治療具有重要意義。目前端粒酶的檢測(cè)方法皆基于其自身帶有一段模板RNA，利用這段RNA，端粒酶能夠在端粒末端逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA的重復(fù)序列，以此來(lái)維持端粒長(zhǎng)度，目前熒光素標(biāo)記的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法和雜交保護(hù)法檢測(cè)端粒酶得到廣泛應(yīng)用，但此方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，所需樣品量大，易污染環(huán)境，結(jié)果不可靠，并且靈敏度低。所以發(fā)明一種方便快捷、環(huán)境污染小、靈敏度高的檢測(cè)端粒酶的方法勢(shì)在必行。圓二色光譜（CD）是一種已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物傳感的分析方法，利用自組裝納米材料構(gòu)建圓二色傳感器進(jìn)行生物傳感得到了廣泛的關(guān)注。相比于熒光技術(shù)檢測(cè)，CD能夠通過(guò)納米粒子之間的等離子體?等離子體耦合、激子?等離子體耦合、混合偶極?偶極之間的耦合等，收集到樣品足夠多的信息，并達(dá)到靈敏度低的檢測(cè)水平，具有更大的潛在生物標(biāo)志物分析應(yīng)用能力。因此，將端粒酶作為診斷標(biāo)識(shí)物，通過(guò)自組裝的手性大小金二聚體的納米傳感器實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的檢測(cè)是首次報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種基于手性自組裝納米傳感器實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)端粒酶活性檢測(cè)的方法。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種基于手性自組裝納米傳感器實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)端粒酶活性檢測(cè)的方法，步驟為：（1）端粒酶引物序列組裝構(gòu)建的手性大小金二聚體傳感器：檸檬酸還原法合成的25nm金納米粒子GNP離心重懸后修飾巰基TEprimer序列；15nm金納米粒子GNP修飾與linkerDNA部分互補(bǔ)的巰基TECS1序列，將得到的GNP-primer及GNP-CS1復(fù)合體混勻，通過(guò)linkerDNA1組裝得到適配體序列組裝的手性大小金二聚體primer-dimer；（2）端粒酶引物錯(cuò)配序列組裝構(gòu)建的手性大小金二聚體傳感器：檸檬酸還原法合成的25nm金納米粒子GNP離心重懸后修飾巰基TEmismatch序列；15nm金納米粒子GNP修飾與linkerDNA部分互補(bǔ)的巰基序列TECS2，將得到的GNP-mismatch及GNP-CS2復(fù)合體混勻，通過(guò)linkerDNA2組裝得到錯(cuò)配序列組裝的手性大小金二聚體mismatch-dimer；（3）兩種大小金二聚體修飾穿膜肽：將步驟（1）及（2）得到大小金二聚體分別與SH-PEG-5000和穿膜肽TAT混勻，偶聯(lián)12h分別得到表面修飾有穿膜肽的手性大小金二聚體TAT-primer-dimer及TAT-mismatch-dimer；（4）兩種大小金二聚體傳感器在細(xì)胞內(nèi)手性信號(hào)隨時(shí)間的變化：分別將步驟（3）得到的兩種穿膜肽修飾的手性大小金二聚體與一定數(shù)量的細(xì)胞共同培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有不同量的手性primer-dimer及mismatch-dimer的細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液進(jìn)行圓二色性表征，記錄不同時(shí)間點(diǎn)的手性信號(hào)，繪制散點(diǎn)圖，得到胞內(nèi)最佳檢測(cè)時(shí)間；（5）基于大小金二聚體的手性信號(hào)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)端粒酶實(shí)時(shí)檢測(cè)：將步驟（3）得到穿膜肽修飾的手性TAT-primer-dimer與添加不同抑制劑和促進(jìn)劑的細(xì)胞及未處理的細(xì)胞共同孵育，當(dāng)存在待測(cè)物端粒酶時(shí)，傳感器組裝體逐漸解散，導(dǎo)致手性信號(hào)的變化，進(jìn)而進(jìn)行檢測(cè)，建立胞內(nèi)端粒酶活性與手性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體步驟如下：（1）端粒酶引物序列組裝構(gòu)建的手性大小金二聚體傳感器：檸檬酸還原法合成的25nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM25nm金納米粒子將其與巰基TEprimer序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻；15nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM15nm金納米粒子與適配體部分互補(bǔ)的巰基TECS1序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻，分別加入終濃度為50mM的NaCl溶液，充分混合后，室溫孵育過(guò)夜后，離心3次除去溶液中未反應(yīng)的DNA，分別重懸于100μL的5mMPB緩沖液中；取100μLGNP-primer及50μLGNP-CS1復(fù)合體混勻，加入5μL10μMlinkerDNA1組裝得到端粒酶引物序列組裝的手性大小金二聚體primer-dimer，再加入終濃度為50mMNaCl溶液進(jìn)行老化，室溫下孵育12h，再將組裝體通過(guò)梯度離心純化；（2）端粒酶引物錯(cuò)配序列組裝構(gòu)建的手性大小金二聚體傳感器：檸檬酸還原法合成的25nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM25nm金納米粒子將其與巰基TEmismatch序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻；檸檬酸還原法合成的15nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM15nm金納米粒子與適配體部分互補(bǔ)的巰基TECS2序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻，分別加入終濃度為50mM的NaCl溶液，充分混合后，室溫孵育過(guò)夜后，離心3次除去溶液中未反應(yīng)的DNA，分別重懸于100μL的5mMPB緩沖液中；取100μLGNP-mismatch及50μLGNP-CS2復(fù)合體混勻，加入5μL10μMlinkerDNA2組裝得到端粒酶引物錯(cuò)配序列組裝的手性大小金二聚體mismatch-dimer，再加入NaCl溶液至終濃度為50mM進(jìn)行老化，室溫下孵育12h，再將組裝體通過(guò)梯度離心純化；（3）兩種大小金二聚體修飾穿膜肽：將步驟（1）及（2）得到大小金二聚體分別與SH-PEG5000和穿膜肽TAT以1︰1000︰100的摩爾濃度混勻，室溫孵育12h后，7500rpm離心20min，去除上清液，沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，得到穩(wěn)定的表面修飾有穿膜肽的手性TAT-primer-dimer及TAT-mismatch-dimer；（4）兩種大小金二聚體傳感器在細(xì)胞內(nèi)手性信號(hào)隨時(shí)間的變化：將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，使每孔中的細(xì)胞數(shù)量為104個(gè)，培養(yǎng)24h后去掉培養(yǎng)液，取8個(gè)孔加入終濃度為5nM的穿膜肽修飾的手性TAT-primer-dimer分別與104個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；取8個(gè)孔加入終濃度為5nM的穿膜肽修飾的手性TAT-mismatch-dimer分別與104個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；之后分別用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有不同量的手性primer-dimer及mismatch-dimer的細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液進(jìn)行圓二色性表征，記錄不同時(shí)間點(diǎn)的手性信號(hào)，繪制散點(diǎn)圖，得到胞內(nèi)最佳檢測(cè)時(shí)間；（5）基于大小金二聚體的手性信號(hào)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)ATP實(shí)時(shí)檢測(cè)：將步驟（3）得到穿膜肽修飾的手性TAT-primer-dimer與不同量EGCG抑制端粒酶活性后的細(xì)胞及未經(jīng)抑制的細(xì)胞分別共孵育6h后，當(dāng)存在待測(cè)物端粒酶時(shí)，組裝體逐漸解散，導(dǎo)致手性信號(hào)的變化，進(jìn)而進(jìn)行檢測(cè)；然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有不同解離程度的手性primer-dimer的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液進(jìn)行圓二色性表征，并建立胞內(nèi)端粒酶與手性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述TEprimer序列如SEQIDNO.1所示，TECS1序列如SEQIDNO.2所示，linkerDNA1序列如SEQIDNO.3所示，TEmismatch序列如SEQIDNO.4所示，TECS2序列如SEQIDNO.5所示，linkerDNA2序列如SEQIDNO.6所示，TAT多肽序列如SEQIDNO.7所示；具體如表1。表1編號(hào)序列（5’-3’）長(zhǎng)度TEprimerTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT24TECS1ATAGGTATATTTTTT15LinkerDNA1CCCTAACTAACCAACTCTGCTCGACGGATT30TEmismatchTTTTTTTATCCGTAGAGCAGCGTC24TECS2ATAGGTATATTTTTT15LinkerDNA2CCCTAACCCTAAGACGCTGCTCTACGGATA30TATYGRKKRRQRRRC12本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明制備出了組裝產(chǎn)率高，性質(zhì)穩(wěn)定，生物相容性好的的金納米粒子二聚體，提供了能夠通過(guò)手性自組裝納米傳感器的圓二色光譜檢測(cè)胞內(nèi)端粒酶活性的方法，建立了細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性與手性信號(hào)強(qiáng)度兩者之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有靈敏度高、選擇性好，省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)，具有非常好的實(shí)際應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明的金納米粒子二聚體在細(xì)胞中的生物透射電鏡圖。圖2是本發(fā)明中兩種大小金二聚體傳感器在細(xì)胞內(nèi)手性信號(hào)隨時(shí)間的變化，繪制散點(diǎn)圖。圖3是本發(fā)明中穿膜肽修飾的手性TAT-primer-dimer與添加不同抑制劑及未處理的細(xì)胞分別共同孵育后，手性信號(hào)的變化譜圖。圖4是本發(fā)明胞內(nèi)端粒酶活性與手性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例所用序列材料均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。實(shí)施例1所有的玻璃儀器都用王水浸泡24h，并用雙蒸水清洗，晾干備用。實(shí)驗(yàn)中使用的水均為18.2MΩ的Milli-Q超純水。（1）端粒酶引物序列組裝構(gòu)建的手性大小金二聚體傳感器：檸檬酸還原法合成的25nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM25nm金納米粒子將其與巰基TEprimer序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻；15nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM15nm金納米粒子與適配體部分互補(bǔ)的巰基TECS1序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻，分別加入終濃度為50mM的NaCl溶液，充分混合后，室溫孵育過(guò)夜后，離心3次除去溶液中未反應(yīng)的DNA，分別重懸于100μL的5mMPB緩沖液中；取100μLGNP-primer及50μLGNP-CS1復(fù)合體混勻，加入5μL10μMlinkerDNA1組裝得到端粒酶引物序列組裝的手性大小金二聚體primer-dimer，再加入NaCl溶液至終濃度為50mM進(jìn)行老化，室溫下孵育12h，再將組裝體通過(guò)梯度離心純化；（2）端粒酶引物錯(cuò)配序列組裝構(gòu)建的手性大小金二聚體傳感器：檸檬酸還原法合成的25nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM25nm金納米粒子將其與巰基TEmismatch序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻；15nm金納米粒子GNP離心重懸于5mMpH7.4的PB緩沖液中，取100μL2nM15nm金納米粒子與適配體部分互補(bǔ)的巰基TECS2序列以摩爾濃度1︰5的比例混勻，分別加入終濃度為50mM的NaCl溶液，充分混合后，室溫孵育過(guò)夜后，離心3次除去溶液中未反應(yīng)的DNA，分別重懸于100μL的5mMPB緩沖液中；取100μLGNP-mismatch及50μLGNP-CS2復(fù)合體混勻，加入5μL10μMlinkerDNA2組裝得到端粒酶引物錯(cuò)配序列組裝的手性大小金二聚體mismatch-dimer，再加入NaCl溶液至終濃度為50mM進(jìn)行老化，室溫下孵育12h，再將組裝體通過(guò)梯度離心純化；（3）兩種大小金二聚體修飾穿膜肽：將步驟（1）及（2）得到大小金二聚體分別與SH-PEG5000和穿膜肽TAT以1︰1000︰100的摩爾濃度混勻，室溫孵育12h后，7500rpm離心20min，去除上清液，沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，得到穩(wěn)定的表面修飾有穿膜肽的手性TAT-primer-dimer及TAT-mismatch-dimer，金納米粒子二聚體在細(xì)胞中的生物透射電鏡圖如圖1所示。（4）兩種大小金二聚體傳感器在細(xì)胞內(nèi)手性信號(hào)隨時(shí)間的變化：將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，使每孔中的細(xì)胞數(shù)量為104個(gè)，培養(yǎng)24h后去掉培養(yǎng)液，取8個(gè)孔加入終濃度為5nM的穿膜肽修飾的手性TAT-primer-dimer分別與104個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；取8個(gè)孔加入終濃度為5nM的穿膜肽修飾的手性TAT-mismatch-dimer分別與104個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；之后分別用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有不同量的手性primer-dimer及mismatch-dimer的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液進(jìn)行圓二色性表征，記錄不同時(shí)間點(diǎn)的手性信號(hào)，繪制散點(diǎn)圖如圖2所示，得到胞內(nèi)最佳檢測(cè)時(shí)間。（5）基于大小金二聚體的手性信號(hào)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)端粒酶實(shí)時(shí)檢測(cè)：在將步驟（3）得到穿膜肽修飾的手性TAT-primer-dimer與不同量EGCG抑制端粒酶活性后及未經(jīng)抑制的細(xì)胞分別共孵育6h后，當(dāng)存在待測(cè)物端粒酶時(shí)，組裝體逐漸解散，導(dǎo)致手性信號(hào)的變化，進(jìn)而進(jìn)行檢測(cè)，然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別得到細(xì)胞內(nèi)含有不同解離程度的手性primer-dimer的細(xì)胞懸液；所述穿膜肽修飾的手性TAT-primer-dimer與添加不同抑制劑及未處理的細(xì)胞分別共同孵育后手性信號(hào)的變化譜圖如圖3所示；對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行圓二色性表征，并建立胞內(nèi)端粒酶與手性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。SEQIDNO.1：TEprimer：5’-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT’-3’；SEQIDNO.2：TECS1：5’-ATAGGTATATTTTTT’-3’；SEQIDNO.3：LinkerDNA1：5’-CCCTAACTAACCAACTCTGCTCGACGGATT’-3’；SEQIDNO.4：TEmismatch：5’-TTTTTTTATCCGTAGAGCAGCGTC’-3’；SEQIDNO.5：TECS2：5’-ATAGGTATATTTTTT’-3’；SEQIDNO.6：LinkerDNA2：5’-CCCTAACCCTAAGACGCTGCTCTACGGATA’-3’；SEQIDNO.7：TAT：5’-YGRKKRRQRRRC’-3’。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3