基于細(xì)胞的傳感器的制造方法
【專利摘要】基于細(xì)胞的傳感器。本發(fā)明涉及可用于藥物發(fā)現(xiàn)的新型基于細(xì)胞的傳感器，其包括這樣的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系具有分泌顆粒的專職調(diào)節(jié)的胞吐作用轉(zhuǎn)染有作為報(bào)道分子多肽儲(chǔ)存在具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞系的調(diào)節(jié)的分泌顆粒中的非蛋白酶水解酶并且具有作為調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的內(nèi)源性或異源性分子。所述顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子至少具有：對(duì)所述顆粒內(nèi)已存在的條件如低pH和通過(guò)其他蛋白酶的蛋白質(zhì)分解的高耐受性；在胞吐作用后的酶活性；高度特異性底物；在細(xì)胞解凍時(shí)無(wú)毒性；在未被刺激或基礎(chǔ)條件下的極低水平的分泌；和對(duì)于高通量強(qiáng)大且靈敏的檢測(cè)在與細(xì)胞培養(yǎng)物生存力和顆粒胞吐作用相適合的介質(zhì)中的高信號(hào)/背景活性。
【專利說(shuō)明】基于細(xì)胞的傳感器 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明包含于生物技術(shù)和藥學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及可用于藥物發(fā)現(xiàn)、診斷和分析物 確定的基于細(xì)胞的傳感器（cell based sensor),所述基于細(xì)胞的傳感器包括這樣的細(xì)胞 系，所述細(xì)胞系具有分泌顆粒的專職（professional)調(diào)節(jié)的胞吐作用過(guò)表達(dá)非蛋白酶水 解酶，所述非蛋白酶水解酶優(yōu)選地選自包含以下各項(xiàng)的組：具有顆粒革巴向蛋白的Gaussia 螢光素酶融合蛋白，分泌型堿性磷酸酶和β-氨基己糖苷酶的β鏈，作為可能報(bào)道分子多 肽，儲(chǔ)存在具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞系的調(diào)節(jié)的分泌顆粒中，并且具有作為調(diào)節(jié)的 分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)（modulator)的內(nèi)源性或異源性分子，所述顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶 水解酶報(bào)道分子至少具有：對(duì)在所述顆粒內(nèi)部已存在的條件如低pH和通過(guò)蛋白酶的蛋白 質(zhì)分解的高耐受性；在胞吐作用后的酶活性；無(wú)毒性，特別是在細(xì)胞解凍后；高度特異性底 物；在未被刺激或基礎(chǔ)條件下極低水平的分泌；和對(duì)于高通量強(qiáng)大且靈敏的檢測(cè)的在與細(xì) 胞培養(yǎng)物生存力和顆粒胞吐作用相適合的介質(zhì)中的高信號(hào)/背景活性。
[0002] 當(dāng)所述基于細(xì)胞的傳感器與胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體溫育時(shí)，報(bào)道分子多肽從 顆粒釋放到胞外介質(zhì)中并且這樣的釋放的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子多肽的酶活性用特異 性底物檢測(cè)。
[0003] 這樣的靈敏的基于細(xì)胞的傳感器可用于檢測(cè)至少兩個(gè)分子之間的相互作用，該兩 個(gè)分子中的一個(gè)充當(dāng)胞吐作用調(diào)質(zhì)而另一個(gè)充當(dāng)胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體。這樣的傳感 器的用途的實(shí)例是：測(cè)試藥物發(fā)現(xiàn)中的分子之間的相互作用，以量化分子如蛋白質(zhì)或揮發(fā) 性有機(jī)化合物以用于診斷和檢測(cè)例如在食品工業(yè)、在環(huán)境樣品和在制藥工業(yè)中的若干樣品 中的藥物或分子。

【背景技術(shù)】
[0004] G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)超家族代表在真核細(xì)胞的膜上被表達(dá)的超過(guò)1000個(gè)表面 受體的單個(gè)最大部分。
[0005] GPCR是細(xì)胞與其胞外介質(zhì)通信的中心，而且還用于視覺(jué)、味覺(jué)和嗅覺(jué)。因此，用來(lái) 測(cè)量和/或量化通過(guò)化合物的GPCR活性的激活或抑制的方法對(duì)于藥物發(fā)現(xiàn)以及對(duì)于疾病 診斷很重要。
[0006] 通過(guò)具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的造血細(xì)胞的胞吐作用在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，同 樣還有通過(guò)結(jié)合至GPCR的激動(dòng)劑誘導(dǎo)的胞吐作用。但是這樣的胞吐作用總是被測(cè)量為百 分比，因?yàn)閮?chǔ)存在細(xì)胞的顆粒中的酶的量，例如β-氨基己糖苷酶的量的大的可變性。為了 確定胞吐作用的百分比，進(jìn)行第一測(cè)量以量化在配體和受體結(jié)合后顆粒儲(chǔ)存的酶的配體誘 導(dǎo)釋放的量，然后細(xì)胞用去垢劑溶菌，再次溫育并確定細(xì)胞內(nèi)部?jī)?chǔ)存的總酶。未被刺激的細(xì) 胞的背景從配體誘導(dǎo)的釋放和總釋放二者中減去，然后胞吐作用的百分比是在配體情況下 的特異性釋放和總特異性釋放之間的比率。但是這種釋放百分比的確定具有多個(gè)步驟，這 增加測(cè)定的成本、增加測(cè)定時(shí)間并因此減少通量。而且，胞吐作用的百分比在許多情況下是 極低的并因此這種測(cè)定具有低的靈敏度。
[0007] 之前已由本專利申請(qǐng)的發(fā)明人在PCT/EP2010/004619中證實(shí)，某些蛋白酶如人粒 酶B可以在具有專職胞吐作用的造血細(xì)胞的這樣的顆粒內(nèi)過(guò)表達(dá)，這樣的測(cè)定具有提高的 信號(hào)/背景比以及在所述顆粒內(nèi)存在穩(wěn)定的蛋白酶產(chǎn)生以至胞吐作用的百分比不需要比 較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之間的胞吐作用。如在PCT/EP2010/004619中所述，用于顆粒分泌的最廣泛使 用的報(bào)道分子是內(nèi)源性β-氨基己糖苷酶，但這種蛋白質(zhì)傳統(tǒng)上已被認(rèn)為是低靈敏度報(bào)道 分子，具有低信號(hào)/背景比和由于儲(chǔ)存在顆粒中的酶的量的隨時(shí)間的巨大變化所致的實(shí)驗(yàn) 之間的大的可變性。因此，盡管PCT/EP2010/004619公開(kāi)了 β-氨基己糖苷酶作為報(bào)道分 子的可能用途，但是它不能被認(rèn)為是本發(fā)明的充分公開(kāi)內(nèi)容，因?yàn)镻CT/EP2010/004619的 教導(dǎo)不能使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用β -氨基己糖苷酶作為報(bào)道分子，因?yàn)槭聦?shí)上在該現(xiàn) 有技術(shù)中進(jìn)行的公開(kāi)，其實(shí)際上教導(dǎo)背離所述用途，說(shuō)明為什么β_氨基己糖苷酶不是可 靠報(bào)道分子。此外，在本發(fā)明中，β-氨基己糖苷酶沒(méi)有被這樣地用作報(bào)道分子，而僅僅是 該酶的β鏈并過(guò)表達(dá)。
[0008] 另外，造血細(xì)胞的顆粒內(nèi)部的蛋白酶如粒酶Β的過(guò)表達(dá)對(duì)于細(xì)胞是有毒的，尤其 是在細(xì)胞解凍后，其中約30-40百分比的細(xì)胞在解凍后24小時(shí)死亡。
[0009] 本發(fā)明聚焦于開(kāi)發(fā)基于細(xì)胞的傳感器，所述基于細(xì)胞的傳感器包括與現(xiàn)有技術(shù)中 已知的基于細(xì)胞的傳感器中使用的報(bào)道分子不同的報(bào)道分子。
[0010] 發(fā)明描述
[0011] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0012] 本發(fā)明克服了上述問(wèn)題，證實(shí)不是蛋白酶的其他水解酶當(dāng)在解凍的細(xì)胞的顆粒內(nèi) 過(guò)表達(dá)時(shí)不是有毒的，并且它們?cè)试S開(kāi)發(fā)高靈敏度的傳感器。特別是，某些糖苷酶如β-氨 基己糖苷酶的Β鏈和磷酸酶如分泌型堿性磷酸酶以高水平儲(chǔ)存在具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作 用的造血細(xì)胞的顆粒內(nèi)，并且通過(guò)具有高信號(hào)/背景比且具有低的測(cè)定間可變性的配體誘 導(dǎo)的胞吐作用進(jìn)行檢測(cè)。另外，本發(fā)明還證實(shí)，以上發(fā)明的具體實(shí)施方案可以概括至可以借 助于顆粒靶向多肽被重新引向顆粒的通常不儲(chǔ)存在顆粒內(nèi)的其他非蛋白酶水解酶。例如， Gaussia螢光素酶是通常不儲(chǔ)存在顆粒內(nèi)的非蛋白酶水解酶，其可以借助于顆粒靶向多肽 如粒酶B被重新引向顆粒，過(guò)表達(dá)并儲(chǔ)存在顆粒中，并且通過(guò)配體誘導(dǎo)的胞吐作用如β-氨 基己糖苷酶一樣釋放。因此，過(guò)表達(dá)無(wú)毒性的非蛋白酶水解酶的造血細(xì)胞成為具有用于測(cè) 量胞吐作用的低可變性的靈敏的基于細(xì)胞的傳感器。
[0013] 定義以下術(shù)語(yǔ)用于本發(fā)明的目的：
[0014] ?傳感器：是一種換能器。換能器定義為將信號(hào)從一種形式轉(zhuǎn)換為另
[0015] 一種的任何裝置。轉(zhuǎn)換生物學(xué)信號(hào)的傳感器稱為生物傳感器。
[0016] ?調(diào)節(jié)的胞吐作用：其是指其中專門的細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)、激素、酶、肽或低分子量 物質(zhì)（例如，兒茶酚胺，谷氨酸等）的過(guò)程。通常，胞內(nèi)Ca2+濃度升高觸發(fā)胞吐作用，但存 在同樣調(diào)節(jié)或介導(dǎo)Ca2+觸發(fā)的胞吐作用的其他胞內(nèi)信號(hào)，包括cAMP、二酰甘油（DAG)、磷脂 和ATP。具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞是指通常在其顆粒內(nèi)儲(chǔ)存代謝物或多肽并且在胞 外信號(hào)后釋放這樣的顆粒儲(chǔ)存的代謝物或多肽的細(xì)胞。
[0017] ?分泌顆?；蚍置谛∨莼蚍置谌苊阁w：它們是用作用于所選分泌產(chǎn)物的儲(chǔ)存池的 專門的胞內(nèi)細(xì)胞器。分泌顆粒通過(guò)刺激物或調(diào)質(zhì)朝向細(xì)胞周圍移動(dòng)，它們的膜與細(xì)胞膜融 合，并且它們的內(nèi)含物載荷釋放。盡管在大多數(shù)細(xì)胞類型中，分泌顆?？雌饋?lái)代表全新的一 類細(xì)胞器，但是各種造血細(xì)胞和某些其他細(xì)胞類型中的顆粒與溶酶體共享若干性能。
[0018] ?造血細(xì)胞：它們是來(lái)源于骨髓干細(xì)胞的細(xì)胞并且包括所有血細(xì)胞類型，這包括 髓樣（單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì) 胞/血小板和一些樹(shù)突細(xì)胞）和淋巴系（T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、一些樹(shù)突細(xì)胞）。
[0019] ?具有調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞系：如本文使用的，術(shù)語(yǔ)〃具有調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì) 胞〃、〃專職分泌細(xì)胞系〃和〃具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞系〃可以互換使用。對(duì)于本 發(fā)明的方法，重要的細(xì)胞系是具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞系。
[0020] ?報(bào)道分子多肽或報(bào)道分子：其是研究者附著至細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物或植物中關(guān)注 的另一基因的基因。某些基因被選擇作為報(bào)道分子，是由于它們給表達(dá)它們的有機(jī)體賦予 的特性容易被鑒別和測(cè)量，或者由于它們是可選擇標(biāo)志。報(bào)道基因通常用來(lái)確定關(guān)注的基 因是否被細(xì)胞或有機(jī)體群吸收或在它們中被表達(dá)。本文中的報(bào)道基因是儲(chǔ)存在專職分泌細(xì) 胞系如某些造血細(xì)胞的分泌顆粒內(nèi)的多肽并且通過(guò)胞吐作用的刺激物或調(diào)質(zhì)而釋放到胞 外介質(zhì)中。
[0021] ?顆粒靶向多肽：其是天然儲(chǔ)存在具有調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞的顆粒內(nèi)的多肽。 這樣的多肽含有將蛋白質(zhì)靶向顆粒的已知或未知的序列。這樣的顆粒靶向多肽的實(shí)例包括 β -氨基己糖苷酶、P-選擇蛋白、粒酶如A、Β、Μ、Η、K、組織蛋白酶。通常不儲(chǔ)存在顆粒中的 蛋白質(zhì)可以通過(guò)與顆粒靶向多肽形成融合蛋白而儲(chǔ)存到顆粒中。在本發(fā)明中，我們使用術(shù) 語(yǔ)"重新引向"來(lái)描述這樣的事實(shí)，即通常不儲(chǔ)存在顆粒中的蛋白質(zhì)可以與另一個(gè)蛋白質(zhì)融 合并且所得蛋白質(zhì)也可以儲(chǔ)存到顆粒中。
[0022] ?水解酶：其是催化化學(xué)鍵水解的酶。水解酶被歸類在酶的EC數(shù)分類中的第3組 并且可以進(jìn)一步分成若干亞類（基于它們作用的鍵）：切割酯鍵的酯酶如核酸酶、磷酸二酯 酶、脂肪酶、磷酸酶；切割糖類的糖苷酶和蛋白酶，包括粒酶，或切割肽鍵的肽酶。
[0023] ?非蛋白酶水解酶：其是催化不同于肽鍵的化學(xué)鍵水解的酶。
[0024] ?調(diào)節(jié)的胞吐作用的調(diào)質(zhì)：其是指能夠改變調(diào)節(jié)的胞吐作用過(guò)程中涉及的一個(gè)或 多個(gè)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化合物、分子或組合物。這種活性的改變包括抑制（即，所述化合 物、分子或組合物是胞吐作用的"抑制劑"），以及刺激、誘導(dǎo)或增強(qiáng)（即，所述化合物、分子 或組合物是胞吐作用的〃刺激劑〃、"誘導(dǎo)劑"或〃增強(qiáng)劑"）。這些調(diào)質(zhì)利用體外和/或體 內(nèi)測(cè)定鑒別。在這些測(cè)定中，使用對(duì)照以允許樣品之間對(duì)比。
[0025] ?藥物發(fā)現(xiàn)：其是指發(fā)現(xiàn)和/或設(shè)計(jì)藥物的過(guò)程。如本文使用的，藥物發(fā)現(xiàn)包括對(duì) 于親和性、副作用、生物利用度的藥物鑒別和修飾以及測(cè)試之前投放到市場(chǎng)上的藥物在新 的治療病征中的作用，也稱為重新評(píng)價(jià)的過(guò)程。
[0026] ?基因：其是遺傳性的基本物理和功能單位。在生物化學(xué)術(shù)語(yǔ)中，基因是位于編碼 具體功能產(chǎn)物（即，蛋白質(zhì)或RNA分子）的特定染色體上的特定位置中的核苷酸的有序序 列。如本文使用的，基因不僅由編碼序列組成而且可以包含在編碼序列的轉(zhuǎn)錄控制中涉及 的相鄰DNA區(qū)域（例如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子）和內(nèi)含子。位于編碼區(qū)域的5'并且在mRNA上存 在的序列被稱為5'未翻譯的序列。位于編碼區(qū)域的3'或下游并且在mRNA上存在的序列 被稱為3'未翻譯的序列。術(shù)語(yǔ)〃基因〃涵蓋cDNA和基因的基因組形式?；虻幕蚪M形 式或克隆體含有用稱為"內(nèi)含子"或"插入?yún)^(qū)域"或"插入序列"的非編碼序列中斷的編碼區(qū) 域。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄入異源核RNA(hnRNA)中的基因的區(qū)段；內(nèi)含子可以含有調(diào)節(jié)元件如增強(qiáng) 子。內(nèi)含子從核或主要轉(zhuǎn)錄本去除或"剪接掉"；內(nèi)含子因此在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄本中缺 乏。mRNA在翻譯期間起作用以規(guī)定新生多肽中的氨基酸的序列或順序。
[0027] ?"穩(wěn)定地引入的"或"穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的"或"穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)的"或"穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的"或"穩(wěn) 定地電穿孔的":其是指具有整合到其基因組中的所需外來(lái)DNA的細(xì)胞的部分。取決于所使 用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以僅細(xì)胞的一部分將外源DNA整合到其基因組中。為了鑒別 和選擇這些整合體，通常將編碼選擇性標(biāo)記（例如對(duì)抗生素的耐受性）的基因連同關(guān)注的 基因一起引入到宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括提供對(duì)藥物（如G418、潮霉素和嘌呤 霉素）的耐受性的那些。編碼選擇性標(biāo)記的核酸可以在與編碼可檢測(cè)翻譯產(chǎn)物的相同載體 上被引入宿主細(xì)胞中，或者可以在單獨(dú)的載體上被引入。穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染有引入的核酸的細(xì)胞 可以通過(guò)藥物選擇鑒別（例如，已結(jié)合選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞死亡）。
[0028] ?表面受體：其是指這樣的分子，該分子出現(xiàn)在細(xì)胞的表面上，與胞外環(huán)境相互作 用并且以最終調(diào)節(jié)特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的方式細(xì)胞內(nèi)地轉(zhuǎn)送或轉(zhuǎn)換關(guān)于環(huán)境的信息，導(dǎo)致特 定基因的轉(zhuǎn)錄。表面受體的實(shí)例是酪氨酸激酶受體，離子通道受體，細(xì)胞因子受體，趨化 因子受體或G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)，如化學(xué)引誘物肽受體、神經(jīng)肽受體、光受體、神經(jīng)遞質(zhì) 受體或多肽激素受體。
[0029] *G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)，也稱為七次跨膜受體、7TM受體、七螺旋受體和G蛋白連 接受體（GPLR):它們是特征在于具有胞外N末端和細(xì)胞質(zhì)C末端的七次膜跨結(jié)構(gòu)域的跨膜 受體的大的蛋白家族。結(jié)合至GPCR的配體促進(jìn)構(gòu)象變化，導(dǎo)致小的G-蛋白偶聯(lián)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路的啟動(dòng)，并且最終導(dǎo)致細(xì)胞響應(yīng)。結(jié)合并激活這些受體的配體包括光敏化合物、臭味、 信息素、激素和神經(jīng)遞質(zhì)，并且大小從小分子變化至肽到大蛋白質(zhì)。G蛋白偶聯(lián)受體僅在高 等真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，包括酵母、植物，并且尤其是動(dòng)物。G蛋白偶聯(lián)受體涉及許多疾病，但也 是所有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物的約一半的靶標(biāo)。
[0030] · GPCR:它們通過(guò)類似放入分子機(jī)制操作。GPCR通過(guò)胞外刺激的激活在受體中引 起構(gòu)象變化，這導(dǎo)致GTP-結(jié)合蛋白（G蛋白）的中間偶聯(lián)和激活。G蛋白在性質(zhì)上是異源三 聚的并且由通過(guò)不同基因編碼的&]^1^((1)士6七3(0)和831111]^( 1^)亞基構(gòu)成。（1亞基負(fù) 責(zé)⑶P和GTP的結(jié)合。配體與GRCP的結(jié)合導(dǎo)致α ( α )亞基從⑶P結(jié)合形式轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié) 合形式，并且導(dǎo)致該異源三聚體通過(guò)α-GTP從β γ二聚體解離的激活。α-GTP和β γ二 聚體二者調(diào)控將信號(hào)通過(guò)產(chǎn)生第二信使分子（例如，鈣，cAMP等）發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)部的各種效 應(yīng)子的活性。存在至少17個(gè)Galpha(Ga)基因，并且G蛋白的成員可以分為稱為Ga i/〇、 Gaq/ll、Gas 和 Gal2/13 的四個(gè)主類（參見(jiàn)例如 Preininger AM 和 Hamm HE.Sci.STKE 2004，re3 和 Cabrera-Vera TM 等 Endocr Rev. 2003Dec ;24(6) :765-81。如本文使用的，GPCR 包括偶聯(lián)至任一 G a i/Q、G a q/11、G a s和G α 12/13的受體。
[0031] ?具有內(nèi)在酶酪氨酸激酶活性的受體（RTK):它們對(duì)于許多多肽生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因 子和激素是高親和力細(xì)胞表面受體。在人基因組中鑒別的九十個(gè)獨(dú)特酪氨酸激酶基因中， 58個(gè)編碼受體酪氨酸激酶蛋白。大多數(shù)RTK是單個(gè)亞基受體，但是一些例如胰島素受體作 為多聚復(fù)合物存在。每個(gè)單體具有單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外Ν端區(qū)域和胞內(nèi)C端區(qū)域。該胞 外Ν端區(qū)域由結(jié)合胞外配體（例如，特定的生長(zhǎng)因子）的極大蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。胞內(nèi)C端區(qū) 域由調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)這些受體的激酶活性的結(jié)構(gòu)域（其特異性地磷酸化酪氨酸氨基酸） 構(gòu)成。
[0032] ?嵌合受體：它們是基于將一個(gè)受體的部分與另一個(gè)受體的部分、蛋白質(zhì)片段、標(biāo) 記物及其任意組合結(jié)合的人工受體，包括整個(gè)結(jié)構(gòu)域及其部分。一般，嵌合蛋白質(zhì)或"融合 蛋白"是包含與至少另一個(gè)肽序列或另一個(gè)多肽融合的所需蛋白質(zhì)產(chǎn)物的至少一部分。
[0033] ?載體或質(zhì)粒載體或質(zhì)粒：術(shù)語(yǔ)〃載體〃用來(lái)指這樣的載體核酸分子，其中核 酸序列可以插入其內(nèi)以引入到其可以被復(fù)制的細(xì)胞中。核酸序列可以是"異源的"，這 意指它對(duì)于其中引入載體的細(xì)胞是外來(lái)的，或者該序列與細(xì)胞中的序列是同源的但在宿 主細(xì)胞核酸的其中通常沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該序列的位置中。載體包括質(zhì)粒、黏粒、病毒（噬菌體， 動(dòng)物病毒和植物病毒）、以及人工染色體（例如，YAC)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將良好裝備以通 過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)構(gòu)建載體（參見(jiàn)，例如，Maniatis等，Molecular Cloning(分子克隆），A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor, 1990)和 Ausubel 等，1994,Current Protocols In Molecular Biology(分子生物學(xué)中的當(dāng)前方案）（John Wiley&Sons, 1996)，這二者通過(guò) 引用結(jié)合于此）。
[0034] ?表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)〃表達(dá)載體〃是指包含編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸的任何類 型的遺傳構(gòu)建體。表達(dá)載體通常至少包含啟動(dòng)子和P〇ly-A信號(hào)。啟動(dòng)子是作為控制轉(zhuǎn)錄 的啟動(dòng)和速率的核酸序列的區(qū)域的控制序列。P〇ly-A信號(hào)或終止信號(hào)包含在RNA轉(zhuǎn)錄通過(guò) RNA聚合酶的特定終止中涉及的DNA序列。在體內(nèi)終止子可以是必需的以實(shí)現(xiàn)理想的信息 水平。
[0035] ?啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是含有涉及相鄰編碼序列的轉(zhuǎn)錄的控制的區(qū)域的DNA的序列。 遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄開(kāi)始位點(diǎn)定位的特定調(diào)控DNA序列被稱為增強(qiáng)子。啟動(dòng)子的其他序列包 含TATA盒序列，該TATA盒序列結(jié)合至有助于RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成的TATA結(jié)合蛋白。 但是相關(guān)序列在不同啟動(dòng)子之間具有大的可變性。通過(guò)比較不同啟動(dòng)子，已經(jīng)確定了共有 序列。給定啟動(dòng)子符合所述共有序列的程度決定了該啟動(dòng)子的強(qiáng)度。序列與共有序列越接 近，則啟動(dòng)子將越強(qiáng)大，并且在該啟動(dòng)子處更頻繁地發(fā)生轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子強(qiáng)度由于其決定給定 mRNA序列轉(zhuǎn)錄的頻率而是重要的，有效地相對(duì)于其他基因給一些基因提供轉(zhuǎn)錄的更高優(yōu)先 級(jí)?？梢灶A(yù)期編碼例如大量需要的蛋白的基因具有相對(duì)強(qiáng)的啟動(dòng)子。因此，啟動(dòng)子分類為 強(qiáng)或弱是相對(duì)的分類，其中強(qiáng)啟動(dòng)子比弱啟動(dòng)子更頻繁地被轉(zhuǎn)錄。因此，如本文中使用的， 強(qiáng)啟動(dòng)子是比其他啟動(dòng)子更頻繁地被轉(zhuǎn)錄且比弱啟動(dòng)子產(chǎn)生更高蛋白質(zhì)水平的啟動(dòng)子。強(qiáng) 啟動(dòng)子的實(shí)例是CMV啟動(dòng)子、延伸因子l-α啟動(dòng)子和CMV與M 〇MLV5' LTR啟動(dòng)子之間的嵌 合啟動(dòng)子。
[0036] ?過(guò)表達(dá)：通過(guò)利用表達(dá)載體，蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)以增加這樣的細(xì)胞 系中之前存在的蛋白質(zhì)水平或者在這樣的細(xì)胞系中產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)。通常用于蛋白質(zhì)過(guò) 表達(dá)的表達(dá)載體是強(qiáng)組成型或強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0037] ?信號(hào)肽或信號(hào)序列：信號(hào)肽是指導(dǎo)蛋白質(zhì)的翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)的短（3-60個(gè)氨基酸長(zhǎng)） 肽鏈。信號(hào)肽也可以被稱為靶向信號(hào)、信號(hào)序列、運(yùn)輸肽或定位信號(hào)。信號(hào)肽的氨基酸序列 將蛋白質(zhì)（其在細(xì)胞溶膠中被合成）引向某些細(xì)胞器如細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠 體、質(zhì)外體（apoplast)和過(guò)氧化物酶體（peroxisome)。一些信號(hào)肽在蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)后通過(guò) 信號(hào)肽酶從該蛋白質(zhì)切割。
[0038] ?肽標(biāo)記物：肽標(biāo)記物是短肽，其可以用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，例如在蛋白質(zhì)的特異性抗 體不可用時(shí)利用抗體或用于蛋白質(zhì)純化。可以用于細(xì)胞表面檢測(cè)和分離的已知肽標(biāo)記物的 實(shí)例是c-myc標(biāo)記物、HA標(biāo)記物和FLAG sup. TM標(biāo)記物。一般地，可獲得其特異性結(jié)合蛋 白的任何肽標(biāo)記物都可以用于表面檢測(cè)和或分離，假定這樣的特異性結(jié)合蛋白被用熒光團(tuán) 或例如用用于表面分離的小珠直接或間接標(biāo)記。
[0039] ?基礎(chǔ)分泌：基礎(chǔ)分泌是指在沒(méi)有細(xì)胞胞吐作用的調(diào)質(zhì)下通過(guò)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì) 的相對(duì)量。在幾乎所有的分泌細(xì)胞類型中，可以檢測(cè)基礎(chǔ)分泌的水平。還不知曉基礎(chǔ)分泌 是由于儲(chǔ)存在顆粒中的蛋白質(zhì)的釋放所致還是來(lái)自遠(yuǎn)離分泌顆粒儲(chǔ)存的新合成的蛋白質(zhì) 的一部分。（參見(jiàn)例如 Burgoyne RD 和 Morgan A. Physiol Rev (2003) 83:581 - 632)。
[0040] ?重組DNA(rDNA)分子：其是指通過(guò)可操作地將核酸序列如基因連接至DNA分子 序列產(chǎn)生的DNA分子。
[0041] ?轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染：如本文使用的，其是指將外來(lái)DNA引入到細(xì)胞（例如原核或真核細(xì) 胞）中。轉(zhuǎn)化可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方式完成，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚 糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、脂質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)融合、 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和生物射彈（biolistics)。特別地，當(dāng)合適的抗生素沒(méi)有被包含在細(xì)胞 培養(yǎng)基中以用于選擇帶有DNA穩(wěn)定整合到染色體中的細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)入到真核細(xì)胞中可以瞬間 的。用于穩(wěn)定選擇的質(zhì)粒載體必須具有在要利用抗生素進(jìn)行選擇的細(xì)胞中表達(dá)的選擇性標(biāo) 記。
[0042] ?包含：該術(shù)語(yǔ)，在全部本專利說(shuō)明書(shū)中，包括，具體地，術(shù)語(yǔ)"組成"，當(dāng)特別地指 生物學(xué)序列作為氨基酸或核苷酸序列時(shí)。其意指該序列可以包含視為生物活性或技術(shù)效果 的本發(fā)明主要依賴的片段，任選地結(jié)合至其他序列片段或序列部分；或簡(jiǎn)單地，被精確地限 制為片段本身。
[0043] 附圖簡(jiǎn)述
[0044] 圖1.其顯示本發(fā)明的總體構(gòu)思，使用非蛋白酶水解酶作為顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子， IgE受體作為介導(dǎo)顆粒胞吐作用的細(xì)胞表面受體和通過(guò)分泌的顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶 報(bào)道分子切割的底物用于檢測(cè)。細(xì)胞用結(jié)合至高親和性受體結(jié)合的IgE的多聚抗原（例如， 變應(yīng)原）處理誘導(dǎo)顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶的釋放，并且這樣的非蛋白酶水解酶切割底 物以產(chǎn)生熒光終產(chǎn)物。利用分泌的報(bào)道分子酶的這種特異性底物，可以確定配體受體相互 作用(ligand-to-receptor-interation) 〇
[0045] 圖2.本發(fā)明的總體構(gòu)思的圖示，使用非蛋白酶水解酶作為顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子， GPCR作為介導(dǎo)顆粒胞吐作用的細(xì)胞表面受體和通過(guò)分泌的顆粒儲(chǔ)存的水解酶報(bào)道分子切 割的熒光底物用于檢測(cè)。細(xì)胞用GPCR的激動(dòng)劑處理誘導(dǎo)顆粒儲(chǔ)存的水解酶的釋放并且這 樣的水解酶切割底物以產(chǎn)生熒光終產(chǎn)物。使用分泌的報(bào)道分子酶的特異性底物，可以確定 配體受體相互作用。
[0046] 圖3.本方面的代表性質(zhì)粒載體的總體結(jié)構(gòu)。具有潮霉素抗性、用來(lái)在嵌合 hCMV-MoMLV5< -LTR強(qiáng)組成型啟動(dòng)子（A)或四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（B)控制下穩(wěn)定地表達(dá) ΗΕΧΒβ鏈、分泌型堿性磷酸酶（SEAP)或作為粒酶B與Gaussia螢光素酶的融合體形成的嵌 合蛋白的質(zhì)粒載體的圖譜。具有新霉素抗性用來(lái)在M 〇MLV5' LTR啟動(dòng)子（C)控制下或在四 環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（D)控制下，使用小鼠免疫球蛋白κ鏈的信號(hào)肽、用于利用抗-cmyc單 克隆抗體的表面檢測(cè)的c-myc標(biāo)記物和用于過(guò)表達(dá)的病毒GPCR來(lái)源的序列，表達(dá)功能性表 面受體（如GPCR)的質(zhì)粒載體的圖譜。
[0047] 發(fā)明詳述
[0048] 如上所述，本發(fā)明涉及可用于藥物發(fā)現(xiàn)、診斷和分析物確定的基于細(xì)胞的傳感器， 所述基于細(xì)胞的傳感器包含細(xì)胞系，所述細(xì)胞系具有分泌顆粒的專職調(diào)節(jié)的胞吐作用，過(guò) 表達(dá)非蛋白酶水解酶，所述非蛋白酶水解酶優(yōu)選地選自包含以下各項(xiàng)的組：具有顆粒靶向 蛋白的Gaussia螢光素酶融合蛋白；分泌型堿性磷酸酶和β-氨基己糖苷酶的β鏈，作為 可能的報(bào)道分子多肽，儲(chǔ)存在具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞系的調(diào)節(jié)的分泌顆粒中，并 且具有作為調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的內(nèi)源性或異源性分子。所述顆粒儲(chǔ)存的非蛋 白酶水解酶報(bào)道分子至少具有：對(duì)顆粒內(nèi)已存在的條件，如低pH和通過(guò)蛋白酶的蛋白質(zhì)水 解的高耐受性；胞吐作用后的酶活性；高度特異性底物；無(wú)毒性，尤其是在細(xì)胞解凍后；在 未被刺激或基礎(chǔ)條件下的極低水平的分泌；和對(duì)于高通量強(qiáng)大且靈敏的檢測(cè)的在與細(xì)胞培 養(yǎng)物存活力和顆粒胞吐作用相適合的介質(zhì)中的高信號(hào)/背景活性。
[0049] 當(dāng)基于細(xì)胞的傳感器與胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體溫育時(shí)，報(bào)道分子多肽從顆粒 釋放到胞外介質(zhì)中并且這樣釋放的報(bào)道分子多肽的酶活性用特異性底物檢測(cè)。
[0050] 因此本發(fā)明的基于細(xì)胞的傳感器包含：具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的造血細(xì)胞系； 顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子，所述顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子被轉(zhuǎn)染到 所述造血細(xì)胞系中并且所述顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子在合適啟動(dòng)子的控制下在所述造血細(xì)胞 系中過(guò)表達(dá)；在合適啟動(dòng)子控制下的胞吐作用調(diào)質(zhì)例如表面受體，如GPCR，以及用于檢測(cè) 分泌的顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子的特異性底物。
[0051] 這樣靈敏的基于細(xì)胞的傳感器可用于檢測(cè)至少兩種分子（一個(gè)充當(dāng)胞吐作用調(diào) 質(zhì)而另一個(gè)充當(dāng)該胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體）之間的相互作用。這樣的傳感器的用途的 實(shí)例為：檢測(cè)藥物發(fā)現(xiàn)中分子之間的相互作用，量化分子如蛋白質(zhì)以用于診斷和用于檢測(cè) 若干樣品中的藥物或分子，例如在食品工業(yè)中、在環(huán)境樣品中和在制藥工業(yè)中。
[0052] 本發(fā)明的傳感器是高度靈敏的并因此使用比當(dāng)前可用的傳感器更低量的細(xì)胞，其 響應(yīng)比基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的傳感器更快，報(bào)道分子的釋放不需要細(xì)胞溶解，信號(hào)可以在端 點(diǎn)模式或動(dòng)態(tài)模式中測(cè)量，所有試劑可以混合，然后讀數(shù)，不需要洗滌或終止步驟，從而增 加通量，對(duì)于在測(cè)定間實(shí)驗(yàn)之間具有低可變性的強(qiáng)大測(cè)定來(lái)說(shuō)獲得穩(wěn)定且高的信號(hào)/背 景，并且其顯示無(wú)毒性，特別是在細(xì)胞解凍后。
[0053] 本發(fā)明證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞解凍時(shí)，與蛋白酶不同的其他水解酶在顆粒內(nèi)被過(guò)表達(dá)時(shí)是 無(wú)毒的，并且他們?cè)试S開(kāi)發(fā)高度靈敏的傳感器。特別地，某些糖苷酶如β-氨基己糖苷酶的 β鏈和磷酸酶如分泌型堿性磷酸酶以高水平儲(chǔ)存在具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的造血細(xì)胞 的顆粒內(nèi)并通過(guò)配體誘導(dǎo)的胞吐作用以高信號(hào)/背景比和以低測(cè)定間可變性進(jìn)行檢測(cè)。另 夕卜，本發(fā)明還證實(shí)，上述發(fā)明的特定實(shí)施方案可以概括至可以借助于顆粒靶向多肽再引向 顆粒的通常不儲(chǔ)存在顆粒內(nèi)的其他非蛋白酶水解酶。例如，Gaussia螢光素酶是通常不儲(chǔ) 存在顆粒內(nèi)的非蛋白酶水解酶，其可以借助于顆粒靶向多肽如非活性粒酶B再引向顆粒、 過(guò)表達(dá)并且儲(chǔ)存在顆粒中并且通過(guò)配體誘導(dǎo)的胞吐作用如β_氨基己糖苷酶一樣釋放。因 此，過(guò)表達(dá)無(wú)毒的非蛋白酶水解酶的造血細(xì)胞成為對(duì)于測(cè)量胞吐作用具有低可變性的靈敏 的基于細(xì)胞的傳感器。
[0054] 因此，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，S卩非蛋白酶水解酶可以在無(wú)毒性的情況下在具有 專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的顆粒中過(guò)表達(dá)，從而產(chǎn)生可用于以低可變性測(cè)量胞 吐作用的高度靈敏的基于細(xì)胞的傳感器。
[0055] 本發(fā)明獲益于之前的專利申請(qǐng)PCT/EP2010/004619并且涉及細(xì)胞、啟動(dòng)子、胞吐 作用調(diào)質(zhì)的所有教導(dǎo)通過(guò)引用結(jié)合于此。
[0056] 用于本發(fā)明中的細(xì)胞
[0057] 本發(fā)明涉及可用于藥物發(fā)現(xiàn)、診斷和分析物的確定的基于細(xì)胞的傳感器，所述基 于細(xì)胞的傳感器包括細(xì)胞系，所述細(xì)胞系具有分泌顆粒的專職調(diào)節(jié)的胞吐作用轉(zhuǎn)染有非蛋 白酶水解酶，所述非蛋白酶水解酶作為報(bào)道分子多肽儲(chǔ)存在具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì) 胞系的調(diào)節(jié)的分泌顆粒中，并且具有作為調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的內(nèi)源性或異源 性分子，所述顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子至少具有：對(duì)顆粒內(nèi)已存在的條件如低 pH和通過(guò)其他蛋白酶的蛋白質(zhì)水解的高耐受性；在胞吐作用后的酶活性；無(wú)毒性，特別是 在細(xì)胞解凍后；高度特異性底物；在未被刺激或基礎(chǔ)條件下的極低水平的分泌；和對(duì)于高 通量的強(qiáng)大且靈敏的檢測(cè)的在與細(xì)胞培養(yǎng)物存活力和顆粒胞吐作用相適合的介質(zhì)中的高 信號(hào)/背景活性。
[0058] 分泌顆粒及其調(diào)節(jié)的胞吐作用在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，并且在由于某些 實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)或由于其重要生理學(xué)或病理生理學(xué)重要性而被選作模型系統(tǒng)的幾種細(xì) 胞類型中被最廣泛地研究（參見(jiàn)例如，Burgoyne, RD和Morgan, A. Physiological Reviews, Vol. 83, No. 2, April 2003, pp. 581-632)。大概被最多研究的細(xì)胞類型是腎上腺 嗜鉻細(xì)胞（adrenal chromaffin cell)(及其腫瘤對(duì)應(yīng)物，PC12細(xì)胞系）、胰腺β -細(xì)胞和 造血細(xì)胞如肥大細(xì)胞、血小板和嗜中性粒細(xì)胞，但是然而，分泌顆粒胞吐作用也發(fā)生在用于 分泌肽和其他激素的許多不同神經(jīng)內(nèi)分泌和內(nèi)分泌細(xì)胞類型中以及在用于分泌消化酶的 外分泌細(xì)胞中。此外，已經(jīng)證實(shí)，即使在非專職分泌細(xì)胞系如成纖維樣細(xì)胞系（CH0細(xì)胞） 中，也存在用于胞吐作用的Ca2+調(diào)節(jié)的通路，并且這或許所有的細(xì)胞類型可能具有調(diào)節(jié)的 胞吐通路，即常規(guī)的溶酶體可以通過(guò)Ca2+觸發(fā)而進(jìn)行胞吐作用。但是分泌型溶酶體是不同 的一類調(diào)節(jié)的分泌細(xì)胞器，并且這種胞吐能力明顯地使它們從常規(guī)溶酶體中凸顯出來(lái)。盡 管常規(guī)溶酶體也可以與質(zhì)膜融合并在刺激后釋放它們的可溶內(nèi)容物（1)，溶酶體酶自細(xì)胞 如成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的Ca2+觸發(fā)的分泌的程度趨于僅為10-20% (2)。對(duì)比地，多至 80%的溶酶體標(biāo)志在生理觸發(fā)后從具有分泌型溶酶體的細(xì)胞（在本文中稱為具有專職調(diào) 節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞）釋放。因此，優(yōu)選的用于本發(fā)明方法的細(xì)胞選自包含具有專職調(diào)節(jié) 的胞吐作用的細(xì)胞的組。具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的細(xì)胞的最多樣的組中之一是包含以下 的組：造血細(xì)胞，如嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞如細(xì)胞毒性T淋巴 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）。所有上述細(xì)胞的正常功能的關(guān)鍵在于大量的儲(chǔ)存的組分 如水解酶諸如蛋白酶、糖苷酶和磷酸酶的調(diào)節(jié)的胞吐作用。因此，具有專職的調(diào)節(jié)的胞吐作 用的造血細(xì)胞是用于本發(fā)明方法的高度相關(guān)的細(xì)胞。
[0059] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞選自具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的造血細(xì)胞系的 組，其選自利用它們的分泌型溶酶體來(lái)儲(chǔ)存專門的組分如水解酶例如糖苷酶和磷酸酶的細(xì) 胞如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。
[0060] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的細(xì)胞選自RBL-2H3、大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞 系、小鼠32D細(xì)胞系、小鼠骨髓造血細(xì)胞、人NK92細(xì)胞系、自然殺傷細(xì)胞系和人YT細(xì)胞系、 自然殺傷細(xì)胞系和小鼠 MC/9細(xì)胞系、小鼠肥大細(xì)胞。特別優(yōu)選的用于本發(fā)明方法的細(xì)胞系 是RBL-2H3,因?yàn)檫@種細(xì)胞系具有本發(fā)明的優(yōu)選的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子如β-氨基己 糖苷酶的β鏈、分泌的堿性磷酸酶或gaussia螢光素酶和使傳感器具有高信號(hào)/背景的顆 粒靶向蛋白之間的融合蛋白的極低的組成型分泌水平和高度誘導(dǎo)的分泌。
[0061] 用于本發(fā)明中的胞吐作用調(diào)質(zhì)
[0062] 本發(fā)明還包括胞吐作用調(diào)質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，胞吐作用調(diào)質(zhì)選自誘 導(dǎo)胞內(nèi)鈣水平變化的化合物或多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，胞吐作用調(diào)質(zhì)選自誘 導(dǎo)cAMP、二酰甘油（DAG)、磷脂或ATP水平變化（這又調(diào)節(jié)或介導(dǎo)鈣觸發(fā)的胞吐作用）的化 合物或多肽。
[0063] 用于本發(fā)明中的顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子
[0064] 最廣泛使用的用于顆粒分泌的報(bào)道分子是內(nèi)源性β_氨基己糖苷酶，但這種蛋白 質(zhì)，如現(xiàn)有技術(shù)中使用、表達(dá)和公開(kāi)的，其在傳統(tǒng)上被認(rèn)為是低靈敏度報(bào)道分子，具有低的 信號(hào)/背景比和由于顆粒中儲(chǔ)存的酶的量隨時(shí)間的巨大變化所致的實(shí)驗(yàn)之間的強(qiáng)可變性 (參見(jiàn)PCT/EP2010/004619)。然而，本發(fā)明驚人地證實(shí)，β-氨基己糖苷酶的β鏈的過(guò)表 達(dá)產(chǎn)生具有低可變性和高信號(hào)/背景的傳感器。此外，如以上解釋的，在解凍時(shí)這種糖苷酶 的過(guò)表達(dá)對(duì)于細(xì)胞是無(wú)毒的。
[0065] 組成型和調(diào)節(jié)的通路之間的可溶蛋白質(zhì)的分選明顯復(fù)雜，并且在可溶性蛋白 質(zhì)至儲(chǔ)存顆粒的路線選擇中存在細(xì)胞類型特異性的實(shí)質(zhì)證據(jù)，與表達(dá)水平無(wú)關(guān)。例如， 淀粉酶是外分泌胰腺細(xì)胞中的正常顆粒組分，并且在轉(zhuǎn)染入外分泌胰腺細(xì)胞系中時(shí)被 運(yùn)輸至顆粒，但在轉(zhuǎn)染的內(nèi)分泌細(xì)胞系中被組成型地分泌（參見(jiàn)例如，El Meskini，R等 Endocrinology(2001)Vol. 142，Νο·2864-873)。細(xì)胞類型特異性可以解釋使用 P0MC 分 子的氨基末端的部分來(lái)研究各種內(nèi)分泌和神經(jīng)細(xì)胞系中的路線選擇的一些矛盾的結(jié) 果（參見(jiàn)例如，Tam WWH 等 Eur J Cell Biol (1993) ,62:294 - 306 ;Roy Ρ 等 Mol Cell Endocrinol (1991)，82:237 - 250 和 Cool DR 等 J Biol Chem(1995) 270:8723 - 8729。蛋白 質(zhì)分選的細(xì)胞特異性延伸超出細(xì)胞系至原代培養(yǎng)，因?yàn)橄嗤臉?gòu)建體在原代內(nèi)分泌和神經(jīng) 細(xì)胞中可能是相當(dāng)不同地進(jìn)行處理。因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，不同于具有調(diào)節(jié)的胞 吐作用的造血細(xì)胞的其他細(xì)胞可以用于本發(fā)明的方法中，但其他細(xì)胞類型的選擇需要與以 高濃度儲(chǔ)存在所選細(xì)胞系的分泌顆粒中并且具有低水平的基礎(chǔ)分泌的特定報(bào)道分子平行 地進(jìn)行。
[0066] 儲(chǔ)存在分泌顆粒中，尤其是在造血起源的細(xì)胞的分泌顆粒中的可用于本發(fā)明的方 法中的報(bào)道分子的一個(gè)重要性質(zhì)，是對(duì)該報(bào)道分子在顆粒內(nèi)最多承受的苛刻環(huán)境的耐受 性。造血細(xì)胞的分泌顆粒與溶酶體（在極酸性pH在內(nèi)部?jī)?chǔ)存大量水解酶如組織蛋白酶、類 胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶（chymase)的細(xì)胞器，并且這種環(huán)境對(duì)于不是天然儲(chǔ)存在這樣 的細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)不是理想的）相關(guān)，因此對(duì)蛋白酶不穩(wěn)定的報(bào)道分子或pH不穩(wěn)定的報(bào) 道分子將可能在分泌顆粒內(nèi)降解，由此降低這樣的不穩(wěn)定的報(bào)道分子蛋白質(zhì)的靈敏度。例 如，蛋白酶是從活化的肥大細(xì)胞胞外分泌的主要蛋白質(zhì)組分（參見(jiàn)例如Huang等，J Clin Immunol. 18:169-183, 1998)。類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶和羧肽酶是儲(chǔ)存在肥大細(xì)胞的 分泌顆粒中的蛋白酶的三個(gè)主要家族。因此，本發(fā)明的優(yōu)選報(bào)道分子是對(duì)本發(fā)明的造血細(xì) 胞的顆粒內(nèi)的蛋白質(zhì)水解和低pH具有高耐受性的多肽。盡管分泌型溶酶體中溶酶體酶和 造血絲氨酸蛋白酶與若干抗生素蛋白質(zhì)的共存表明，在沒(méi)有降解下共儲(chǔ)存是可能的，不是 人工引向分泌顆粒的每一種多肽都將耐受這種苛刻環(huán)境。例如，Kaur J和Cutler DF(參 見(jiàn) Kaur，J 和 Cutler DF.J. Biol. Chem. ,(2002) Vol. 277, Issue 12,10498-10505)已發(fā)現(xiàn)， 嵌合HRP-P選擇蛋白可以靶向分泌型和傳統(tǒng)溶酶體二者，但多至70%的被靶向的蛋白被蛋 白水解降解。
[0067] 本發(fā)明方法中使用的造血細(xì)胞的分泌顆粒與溶酶體（其是在極酸性pH環(huán)境下在 內(nèi)部?jī)?chǔ)存大量水解酶如組織蛋白酶、類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的細(xì)胞器）共享性質(zhì)， 并且因此本方面的方法的可用的報(bào)道分子必需是對(duì)合適的造血細(xì)胞的顆粒內(nèi)的環(huán)境耐受 的多肽。
[0068] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，有用的報(bào)道分子選自對(duì)造血細(xì)胞的顆粒內(nèi)的環(huán)境， 如蛋白質(zhì)水解和低pH耐受的多肽。
[0069] 用于報(bào)道分子表達(dá)的啟動(dòng)子
[0070] 本發(fā)明還包括用于報(bào)道分子的表達(dá)的合適啟動(dòng)子。用于本發(fā)明的顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道 分子的表達(dá)的有用啟動(dòng)子是適用于造血細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子，特別是適用于中至 高蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子。合適啟動(dòng)子的另一相關(guān)性質(zhì)在于，蛋白質(zhì)表達(dá)在培養(yǎng)期間必須是 穩(wěn)定的。某些異源性啟動(dòng)子在培養(yǎng)期間，尤其是在造血細(xì)胞中被下調(diào)，并且這個(gè)過(guò)程被稱為 "啟動(dòng)子沉默"。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選啟動(dòng)子因此是非可沉默啟動(dòng)子。
[0071] 檢測(cè)技術(shù)和底物
[0072] 除了對(duì)分泌顆粒內(nèi)的環(huán)境的耐受性、要用于本發(fā)明方法的報(bào)道分子的高水平表 達(dá)、低基礎(chǔ)分泌和高誘導(dǎo)的分泌之外，用于本發(fā)明的靈敏檢測(cè)方法的調(diào)節(jié)的胞吐作用的報(bào) 道分子的其他重要性質(zhì)是用來(lái)測(cè)量分泌的報(bào)道分子的檢測(cè)技術(shù)的類型和對(duì)于用于檢測(cè)的 特異性底物的這樣的報(bào)道分子的催化效率。高度靈敏的檢測(cè)技術(shù)和對(duì)特異性底物具有高催 化效率的報(bào)道分子二者對(duì)于本發(fā)明的方法都是有益的。
[0073] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)分泌的非蛋白酶水解酶的底物可以選自 比色、熒光底物或化學(xué)發(fā)光底物。用于HEXB的底物的一個(gè)實(shí)例是4-甲基傘形酮N-乙酰 基-β -D-氨基葡糖苷（4MU-NG1C)，但用于糖苷酶的其他底物可以被合成和測(cè)試。用于磷酸 酶的底物的實(shí)例是4-甲基傘形酮磷酸酯和熒光素二磷酸酯，但用于磷酸酶的其他底物也 可以是有用的。用于gaussia螢光素酶的底物可以選自腔腸素（coelenterazine)及其衍 生物。
[0074] 本發(fā)明的基于細(xì)胞的傳感器的應(yīng)用
[0075] 本發(fā)明的基于細(xì)胞的傳感器通常可用于檢測(cè)至少兩種分子（一個(gè)充當(dāng)胞吐作用 調(diào)質(zhì)而另一個(gè)充當(dāng)該胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體）之間的相互作用。例如，在藥物發(fā)現(xiàn)中， 針對(duì)靶標(biāo)測(cè)試成千或甚至成百萬(wàn)的小分子以尋找改變這樣的靶標(biāo)的活性的小分子。在特別 的實(shí)例中，篩選化合物用于G-蛋白偶聯(lián)受體（高度可藥用的一類受體）的激動(dòng)劑或拮抗 齊U。但是相同的傳感器可用于檢測(cè)和量化調(diào)節(jié)顆粒胞吐作用的化合物，例如，若干樣品中濫 用的藥物，例如在食品工業(yè)、環(huán)境樣品中并且用于診斷。所述傳感器的用途不限于細(xì)胞表面 受體或表面受體的小調(diào)質(zhì)。例如，通過(guò)利用本發(fā)明的傳感器，利用一對(duì)結(jié)合至待測(cè)蛋白質(zhì)的 兩個(gè)分子，可以進(jìn)行快速、特異性且靈敏的檢測(cè)，前提是結(jié)合至待測(cè)蛋白的分子中的一個(gè)是 特異性免疫球蛋白E而結(jié)合至待測(cè)蛋白的另一種分子誘導(dǎo)待測(cè)蛋白的寡聚化。上述傳感器 的其他用途是用于測(cè)試抗變應(yīng)性化合物和用于檢測(cè)變應(yīng)原。
[0076] 用于測(cè)試化合物是否介導(dǎo)胞吐作用的試劑盒
[0077] 本發(fā)明還包括用于測(cè)試化合物是否調(diào)節(jié)胞吐作用的試劑盒。這樣的試劑盒至少包 括：造血細(xì)胞系，所述造血細(xì)胞系具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用轉(zhuǎn)染有在合適啟動(dòng)子控制下的 至少一種異源性非蛋白酶水解酶報(bào)道分子；和用于檢測(cè)分泌的異源性蛋白酶報(bào)道分子的特 異性底物。另外，具有專職調(diào)節(jié)的胞吐作用的造血細(xì)胞系可以轉(zhuǎn)染有在合適啟動(dòng)子控制下 的異源性胞吐作用調(diào)質(zhì)，如GPCR、異源性Fc γ I受體或異源性Fc ε I受體轉(zhuǎn)染，或者可以使 用內(nèi)源性胞吐作用調(diào)質(zhì)如內(nèi)源性Fc ε受體I (IgE受體）。使用IgE受體作為胞吐作用調(diào)質(zhì) 的試劑盒可以含有對(duì)于要確定的分析物特異的IgE和用來(lái)誘導(dǎo)結(jié)合于IgE的分析物的寡聚 化的第二分子。
[0078] 因此，本發(fā)明的第一實(shí)施方案涉及基于細(xì)胞的傳感器，所述基于細(xì)胞的傳感器包 含：
[0079] a.具有分泌顆粒的調(diào)節(jié)的胞吐作用的造血細(xì)胞系；
[0080] b.在強(qiáng)組成型啟動(dòng)子或強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)染入（a)的細(xì)胞系中并且過(guò)表 達(dá)的顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子；
[0081] c. (a)的細(xì)胞系的分泌顆粒的調(diào)節(jié)的胞吐作用的內(nèi)源性調(diào)質(zhì)或轉(zhuǎn)染的異源性調(diào) 質(zhì)；
[0082] d.不能透過(guò)細(xì)胞的底物，其選自包含以下各項(xiàng)的組：對(duì)檢測(cè)分泌的非蛋白酶水解 酶活性特異的嵌合、熒光或發(fā)光底物；
[0083] 所述基于細(xì)胞的傳感器允許測(cè)量特異性配體對(duì)調(diào)節(jié)的胞吐作用的調(diào)質(zhì)的作用。
[0084] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非蛋白酶水解酶選自SEQ ID NO: 1的分泌型堿性磷酸酶 (SEAP)、β -氨基己糖苷酶（HEXB) (Gene Bank BC017378. 2,日期為 26. 01. 2012)的 β 鏈或 Gaussia螢光素酶（GLuc)和顆粒靶向蛋白（SEQ ID Ν0:2)之間的融合蛋白；細(xì)胞選自包含 以下各項(xiàng)的組：大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系RBL2H3,小鼠骨髓造血細(xì)胞系32D，自然殺傷細(xì)胞 系人ΝΚ92細(xì)胞系，自然殺傷細(xì)胞系人ΥΤ細(xì)胞系和小鼠肥大細(xì)胞小鼠 MC/9細(xì)胞系；并且調(diào) 節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)是選自包含以下各項(xiàng)的組的內(nèi)源性表面受體或轉(zhuǎn)染的異源 性表面受體：G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)，帶有ΙΤΑΜ基序的受體，帶有ΙΤΙΜ基序的受體和蛋白 酪氨酸激酶受體。
[0085] 本發(fā)明的第二實(shí)施方案涉及一種獲得上述生物傳感器的方法，所述方法包括用編 碼在合適啟動(dòng)子控制下的顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子的載體轉(zhuǎn)化帶有調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用 的內(nèi)源性調(diào)質(zhì)或帶有在合適啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)染的異源性表面受體的造血細(xì)胞系。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的載體還包含可用于在細(xì)胞表面處 的受體過(guò)表達(dá)的信號(hào)肽，和/或用于陽(yáng)性細(xì)胞的表面檢測(cè)和/或分離的標(biāo)記物。
[0086] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的組成型過(guò)表 達(dá)的啟動(dòng)子選自包含以下各項(xiàng)的組：哺乳動(dòng)物延伸因子l-α啟動(dòng)子（hEFla) (SEQ ID N0:3)，和來(lái)自莫洛尼鼠白血病毒的Y LTR啟動(dòng)子MoMLV-5^ LTR(SEQIDN0:4)。在另一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的過(guò)表達(dá)的啟動(dòng)子是選自包含 以下各項(xiàng)的組的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，蛻皮素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，cumate誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子和孕酮誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0087] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的過(guò)表達(dá)的載 體包含用于表面過(guò)表達(dá)的SEQIDN0:5或SEQIDN0:6的病毒GPCR來(lái)源的序列（VGS)。
[0088] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的組成型過(guò)表 達(dá)的載體是 P-MoMLV-5' LTR-SP-cmyc-tag-VGS-MCS-polyA(SEQ ID N0:7)。
[0089] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子的強(qiáng)組成型過(guò)表達(dá)的啟動(dòng)子 選自包含以下各項(xiàng)的組：hCMV和MoMLV-5' -LTR啟動(dòng)子（SEQ ID N0:4)的嵌合啟動(dòng)子； MoMLV-5' LTR 啟動(dòng)子（SEQ ID N0:4)和延伸因子 l-α 啟動(dòng)子（SEQ ID N0:3)。
[0090] 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子在選自包含以下各項(xiàng)的組的誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下過(guò)表達(dá)：四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，蛻皮素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，cumate誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子和孕酮誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0091] 本發(fā)明的第三實(shí)施方案涉及一種測(cè)試或量化至少兩種分子（一個(gè)充當(dāng)胞吐作用 調(diào)質(zhì)而另一個(gè)充當(dāng)該胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體）之間的相互作用的方法，所述方法包括 以下步驟：
[0092] a)在與細(xì)胞生存力、胞吐作用和分泌的顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子的酶活性相適合的介 質(zhì)中溫育上述基于細(xì)胞的傳感器，
[0093] b)加入胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體，
[0094] c)加入顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子的特異性底物，和
[0095] d)檢測(cè)從顆粒釋放到胞外介質(zhì)中的報(bào)道分子多肽非蛋白酶水解酶酶活性，利用所 述釋放的報(bào)道分子的特異性底物。
[0096] 本發(fā)明的第四實(shí)施方案涉及上述基于細(xì)胞的傳感器在檢測(cè)與一對(duì)的兩種分子結(jié) 合的蛋白質(zhì)中的用途，其中與待檢測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)合的分子中的一個(gè)是特異性免疫球蛋白G、 或特異性免疫球蛋白E、或特異性免疫球蛋白A，并且與待檢測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)合的第二分子在 結(jié)合后誘導(dǎo)所述待檢測(cè)的蛋白質(zhì)的寡聚化。
[0097] 本發(fā)明的第五實(shí)施方案涉及上述基于細(xì)胞的傳感器的用途，所述基于細(xì)胞的傳感 器用于測(cè)試藥物發(fā)現(xiàn)中分子之間的相互作用或量化分子如蛋白質(zhì)以用于診斷或用于檢測(cè) 食品工業(yè)的樣品中的、環(huán)境樣品中的以及制藥工業(yè)中的藥物或分子，用于測(cè)試IgE-變應(yīng)原 相互作用，用于測(cè)試抗變應(yīng)性化合物和/或用于檢測(cè)變應(yīng)原。
[0098] 本方面的第六實(shí)施方案涉及包含上述基于細(xì)胞的傳感器的試劑盒，其用于測(cè)試化 合物是否介導(dǎo)胞吐作用或量化這樣的胞吐作用的程度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑 盒包含至少一種用于檢測(cè)分泌的異源性報(bào)道分子的特異性底物。 實(shí)施例
[0099] 實(shí)施例1.在hCMV-MoLV5' LTR嵌合啟動(dòng)子控制下表達(dá)人HEXB的β鏈的穩(wěn)定細(xì) 胞系的開(kāi)發(fā)。
[0100] 開(kāi)發(fā)載體用于在hCMV-MoLVS' LTR嵌合啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定表達(dá)人ΗΕΧΒ的β鏈。 潮霉素抗性盒被包括在載體主鏈中用于選擇細(xì)胞的穩(wěn)定種群。載體還包括在人ΗΕΧΒ下游 克隆的IRES-NGFR盒，并且因此在相同啟動(dòng)子控制下，用于表達(dá)ΗΕΧΒ的穩(wěn)定細(xì)胞的流式細(xì) 胞術(shù)和/或選擇。
[0101] 各個(gè)載體使用微造孔器（Digital Bio Technology, South Korea)單個(gè)地電穿孔 到RBL-2H3中并在48小時(shí)后，以1500ug/mL向培養(yǎng)物加入潮霉素以用于選擇。在約2周的選 擇后，通過(guò)具有針對(duì)偶聯(lián)至FITC的NGFR的抗體的流式細(xì)胞術(shù)（Guava Technologies，USA) 分析細(xì)胞。其中通過(guò)使用抗NGFR-MACS sup.R(Miltenyi Biotec，Germany)的MACS磁分離 的陽(yáng)性種群。分析的種群通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)再次分析以檢查分選效率。陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)有限稀 釋克隆，〇, 3個(gè)細(xì)胞/96孔微板的孔。具有生長(zhǎng)的克隆的孔通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析NGFR表達(dá)。 具有對(duì)NGFR的陽(yáng)性表達(dá)的三種克隆體（命名為1B7-HEXB、1C4-HEXB和1F10-HEXB)連同非 轉(zhuǎn)化的RBL2H3和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的整個(gè)細(xì)胞種群（RBL2H3-HEXB)擴(kuò)增至6孔板。
[0102] 用移液管收獲細(xì)胞，離心，重懸在HBSS緩沖液中，使用Neubauer室計(jì)數(shù)并調(diào)整至 500. 000個(gè)細(xì)胞/mL。用于確定HEXB活性的底物是4-甲基傘形酮N-乙?；?β -D-氨基 葡糖苷（4MU-NGlc) (Sigma-Aldrich，M2133)并在測(cè)定孔中將其在HBSS中稀釋至ImM終濃 度。
[0103] 針對(duì)三硝基苯基半抗原的小鼠 IgE單克隆抗體從購(gòu)自ATCC(TIB-141)的IgELb4 雜交瘤純化并且通過(guò)結(jié)合于與BSA綴合的TNP的IgE的IgE受體的交聯(lián)而誘導(dǎo)胞吐作用。 TNP-N-輕基琥拍酰亞胺esther購(gòu)自Biosearch Technologies Inc并且使用標(biāo)準(zhǔn)方案綴合 至牛血清白蛋白（BSA)。使用15400單位/m〇l/10mm光傳送長(zhǎng)度作為TNP的消光系數(shù)，通過(guò) 測(cè)量在348nm的TNP吸光度確定在pH 7. 0的綴合。TNP-BSA綴合物中的TNP與BSA的摩爾 比為18:1并且是在假定BSA的分子量為60000的情況下下計(jì)算的。
[0104] 將384黑壁微板用于測(cè)定。在2微克/mL的IgELb4IgE抗體和2微克/mL的 TNP-BSA連同2mM的4MU-NG1C的在HBSS中的第一混合物用來(lái)測(cè)量胞吐作用。第二混合物用 作對(duì)照并且其僅為2mM的4MU-NGlc而沒(méi)有IgE并且沒(méi)有TNP-BSA。離子霉素（ionomycin) 以10uM用作對(duì)照。沒(méi)有細(xì)胞的孔用作空白。10微升的細(xì)胞（任一 1B7-HEXB、1C4-HEXB和 1F10-HEXB，未轉(zhuǎn)化的RBL2H3和RBL2H3-HEXB)各自加入到12個(gè)孔中。向六個(gè)孔中加入10 微升的含有IgE+TNP-BSA加4MU-NGlc的混合物，而對(duì)于另外的六個(gè)孔，僅加入4MU-NGlc。 將板在37°C溫育并且在BMG-Labtech Optima熒光讀數(shù)器中在360nm激發(fā)和470nm作為發(fā) 射波長(zhǎng)下讀出熒光。在〇、15、30、45和60分鐘進(jìn)行讀數(shù)。將30分鐘選擇作為最佳結(jié)果的 時(shí)間。在30min的結(jié)果顯示在下表1中：
[0105] 表 1
[0106]

【權(quán)利要求】
1. 基于細(xì)胞的傳感器，所述基于細(xì)胞的傳感器包括： a. 具有分泌顆粒的調(diào)節(jié)的胞吐作用的造血細(xì)胞系； b. 顆粒儲(chǔ)存的非蛋白酶水解酶報(bào)道分子，所述非蛋白酶水解酶報(bào)道分子被轉(zhuǎn)染入（a) 的細(xì)胞系中并且在強(qiáng)組成型啟動(dòng)子或強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下過(guò)表達(dá)； c. (a)的細(xì)胞系的分泌顆粒的調(diào)節(jié)的胞吐作用的內(nèi)源性調(diào)質(zhì)或轉(zhuǎn)染的異源性調(diào)質(zhì)； d. 選自包含以下各項(xiàng)的組的細(xì)胞不可滲透底物：對(duì)分泌的非蛋白酶水解酶活性的檢 測(cè)特異的比色、熒光或發(fā)光底物； 所述基于細(xì)胞的傳感器允許測(cè)量特異性配體對(duì)調(diào)節(jié)的胞吐作用的調(diào)質(zhì)的作用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述非蛋白酶水解酶報(bào)道分子 選自：SEQ ID N0:1的分泌型堿性磷酸酶（SEAP)，β-氨基己糖苷酶（HEXB)(Gene Bank BC017378. 2)的β鏈或Gaussia螢光素酶（GLuc)和顆粒靶向蛋白（SEQ ID N0:2)之間的 融合蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述細(xì)胞選自包含以下各項(xiàng)的組： 大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系RBL2H3,小鼠骨髓造血細(xì)胞系32D，自然殺傷細(xì)胞系人NK92細(xì)胞 系，自然殺傷細(xì)胞系人YT細(xì)胞系和小鼠肥大細(xì)胞小鼠 MC/9細(xì)胞系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于細(xì)胞的傳感器，其中調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的所述調(diào) 質(zhì)是選自包含以下各項(xiàng)的組的內(nèi)源性表面受體或轉(zhuǎn)染的異源性表面受體：G-蛋白偶聯(lián)受 體（GPCR)，帶有ITAM基序的受體，帶有ITIM基序的受體和蛋白酪氨酸激酶受體。
5. 用于獲得根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器的方法，所述方法包括將帶有權(quán)利要求 4的調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的內(nèi)源性調(diào)質(zhì)或帶有在合適啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)染的異源性表 面受體的造血細(xì)胞系用編碼同樣在合適啟動(dòng)子控制下的權(quán)利要求1的顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分 子的載體轉(zhuǎn)化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中編碼權(quán)利要求4的調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào) 質(zhì)的載體還包含可用于在細(xì)胞表面處的受體過(guò)表達(dá)的信號(hào)肽，和/或用于陽(yáng)性細(xì)胞的表面 檢測(cè)和/或分離的標(biāo)記物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的組成型過(guò) 表達(dá)的啟動(dòng)子選自包含以下各項(xiàng)的組：哺乳動(dòng)物延伸因子l-α啟動(dòng)子（hEFla)(SEQ ID N0:3)，和來(lái)自莫洛尼鼠白血病毒的Y LTR啟動(dòng)子MoMLV-5' LTR(SEQIDN0:4)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中可用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的過(guò)表達(dá) 的啟動(dòng)子是選自包含以下各項(xiàng)的組的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，蛻皮素誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子，cumate誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和孕酮誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5至8所述的方法，其中用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的過(guò) 表達(dá)的載體包含用于表面過(guò)表達(dá)的SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6的病毒GPCR來(lái)源的序列 (VGS)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5至9所述的方法，其中用于調(diào)節(jié)的分泌顆粒胞吐作用的調(diào)質(zhì)的組成 型過(guò)表達(dá)的載體是 P-MoMLV-5' LTR-SP-cmyc-tag-VGS-MCS-polyA(SEQ ID NO:7)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中用于顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子的強(qiáng)組成型過(guò)表達(dá)的 啟動(dòng)子選自包含以下各項(xiàng)的組：hCMV和MoMLV-5' -LTR啟動(dòng)子（SEQ ID N0:4)的嵌合啟動(dòng) 子；MoMLV-5' LTR 啟動(dòng)子（SEQ ID NO:4)和延伸因子 l-α 啟動(dòng)子（SEQ ID NO: 3)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子在選自包含以下各項(xiàng) 的組的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下過(guò)表達(dá)：四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，蛻皮素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，cumate 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和孕酮誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
13. 測(cè)試或量化至少兩種分子之間的相互作用的方法，所述至少兩種分子中的一個(gè)充 當(dāng)胞吐作用調(diào)質(zhì)而另一個(gè)充當(dāng)所述胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體，所述方法包括以下步驟： a. 在與細(xì)胞生存力、胞吐作用和分泌的顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子的酶活性相適合的介質(zhì)中 溫育根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的基于細(xì)胞的傳感器， b. 添加胞吐作用調(diào)質(zhì)的特異性配體， c. 添加所述顆粒儲(chǔ)存的報(bào)道分子的特異性底物，和 d. 利用從顆粒釋放到所述胞外介質(zhì)中的所述報(bào)道分子的特異性底物檢測(cè)所述報(bào)道分 子多肽的非蛋白酶水解酶酶活性。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的基于細(xì)胞的傳感器在檢測(cè)結(jié)合有一對(duì)的兩個(gè)分子的蛋 白質(zhì)中的用途，其中結(jié)合待檢測(cè)的蛋白質(zhì)的分子中的一個(gè)是特異性免疫球蛋白G，或特異性 免疫球蛋白E，或特異性免疫球蛋白A，并且結(jié)合待檢測(cè)的蛋白質(zhì)的第二分子在結(jié)合后誘導(dǎo) 所述待檢測(cè)的蛋白質(zhì)的寡聚化。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的基于細(xì)胞的傳感器的用途，所述基于細(xì)胞的傳感器用 于測(cè)試藥物發(fā)現(xiàn)中分子之間的相互作用，或量化分子如蛋白質(zhì)以用于診斷或用于檢測(cè)食品 工業(yè)的樣品中的、環(huán)境樣品中的和制藥工業(yè)中的藥物或分子，用于測(cè)試IgE-變應(yīng)原相互作 用，用于測(cè)試抗變應(yīng)性化合物和/或用于檢測(cè)變應(yīng)原。
16. 包含根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的基于細(xì)胞的傳感器的試劑盒，所述試劑盒用于測(cè)試 化合物是否介導(dǎo)胞吐作用或用于量化這樣的胞吐作用的程度。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種用于檢測(cè)分泌的異源性 報(bào)道分子的特異性底物。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK104094115SQ201280068546
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】埃利耶·帕斯羅哈斯, 費(fèi)·伊莎貝爾·加西亞馬塞拉, 韋羅妮卡·馬庫(kù)拉達(dá)·盧納格雷羅, 馬里亞·格拉西亞·蒙特羅佩尼亞爾沃, 塔尼亞·加西亞馬塞拉, 何塞·安德列斯·莫拉萊斯馬丁內(nèi)斯, 安娜·貝倫·阿拉貢戈麥斯, 安娜·克薩達(dá)莫利納, 奧羅拉·瑪麗亞·馬克斯莫拉萊斯 申請(qǐng)人:坎瓦克斯生物技術(shù)公司