專利名稱：毛細(xì)管微包被法控制細(xì)胞空間分布、形狀和大小及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為交叉領(lǐng)域技術(shù)發(fā)明，涉及半導(dǎo)體工業(yè)微加工技術(shù)、生物材料學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。具體地說，是在支持細(xì)胞粘附的材料表面上，選擇性地引入抑制細(xì)胞粘附材料如poly-HEMA包被層，細(xì)胞因而只能在未被包被的區(qū)域粘附生長。該技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域如組織工程、細(xì)胞生物傳感器、生物芯片和生物微機(jī)電系統(tǒng)(BioMEMs)中有廣泛的應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
細(xì)胞的粘附依賴于蛋白質(zhì)的介導(dǎo)，即支持細(xì)胞粘附的材料表面上，必須先吸附一層蛋白分子(通常是胞外基質(zhì)蛋白分子)，隨后通過配體-受體結(jié)合，細(xì)胞才能在材料表面上粘附、鋪展并生長。聚羥乙基異丁烯酸(Poly-HEMA)是一種特殊的高分子材料，其乙醇溶液在常用的細(xì)胞培養(yǎng)器皿表面干燥后，形成牢固的包被層，該包被層可以抑制胞外基質(zhì)蛋白分子的吸附，因而抑制細(xì)胞的粘附。在支持細(xì)胞粘附的材料表面選擇性地包被Poly-HEMA，就可以將細(xì)胞的粘附局限在無包被區(qū)域。Poly-HEMA曾被用來粗略控制細(xì)胞的鋪展面積，其原理是，不同厚度的Poly-HEMA包被層，其抑制細(xì)胞粘附的能力不同，越厚的包被層，細(xì)胞越不易粘附，所以，一系列不同厚度的Poly-HEMA包被可以用來控制細(xì)胞群體的大致鋪展面積。然而，這種用途不能控制細(xì)胞的空間分布，也不能在單細(xì)胞水平上精確控制細(xì)胞的形狀和鋪展面積。其主要原因就是，單純的Poly-HEMA包被層不具備空間分辨能力。
本發(fā)明利用高彈體印章技術(shù)、結(jié)合毛細(xì)管作用和Poly-HEMA抑制細(xì)胞粘附的特性，在支持細(xì)胞粘附的材料表面上引入模式化的poly-HEMA包被層，模式的尺度為幾十個微米。這種模式化表面具備空間分辨能力，用來接種細(xì)胞時，細(xì)胞的空間分布、形狀和大小可以得到完美的控制。
高彈體印章技術(shù)系由哈佛大學(xué)化學(xué)系Whitesides教授研究小組研發(fā)而來，主要用于微接觸印刷技術(shù)(micro-contact printing)，即作為印章蘸取烷硫醇分子，扣在金表面，借助烷硫醇分子的巰基和金原子間的配位作用，在金表面形成烷硫醇分子的模式化自組裝單層。本發(fā)明的高彈體印章是作為Poly-HEMA聚合的模具，因此，與Whitesides教授的方法截然不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用高彈體印章技術(shù)、結(jié)合毛細(xì)管作用和Poly-HEMA抑制細(xì)胞粘附的特性，在支持細(xì)胞粘附的材料表面上制作模式化的poly-HEMA包被層的方法，模式的尺度為幾十個微米，同時，提供一種在模式化表面接種細(xì)胞，可以完美的控制細(xì)胞的空間分布、形狀和大小的方法。本發(fā)明的另外一個目的是提供該方法在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域如組織工程、細(xì)胞生物傳感器、生物芯片和生物微機(jī)電系統(tǒng)(BioMEMs)中得以廣泛的應(yīng)用。
本發(fā)明利用半導(dǎo)體工業(yè)微加工技術(shù)的空間分辨能力，結(jié)合poly-HEMA抑制細(xì)胞粘附的特性，在支持細(xì)胞粘附的材料表面上經(jīng)過工藝處理后，成功地控制細(xì)胞空間分布、形狀及大小。其技術(shù)要點是，在細(xì)胞可粘附材料表面上引入抑制細(xì)胞粘附的聚羥乙基異丁烯酸Poly-HEMA，或者與其功能相同的材料的模式化包被。其技術(shù)流程是，首先借助微電子工業(yè)的微制作技術(shù)，制作出表面含有微米尺度凹凸圖案的模具，然后在該模具表面聚合一種具有彈性的材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)，或者與聚二甲基硅氧烷(PDMS)具有相同功能的材料，聚合完成后，揭下PDMS，其表面上即含有于模具表面相反的凹凸圖案，類似于印章。由于PDMS是一種高彈體，當(dāng)扣在平滑的細(xì)胞可粘附材料表面上，并施加適宜壓力時，印章凸起處即與平滑表面致密接觸，而印章凹下的地方則與平滑表面間形成空隙。圖案的設(shè)計過程中，使印章凹下區(qū)域相互連接，即可以在平滑表面上形成連續(xù)的毛細(xì)管通道。在印章一端滴加Poly-HEMA的乙醇溶液，溶液可借助毛細(xì)作用自發(fā)充填毛細(xì)管通道。乙醇揮發(fā)完畢后，揭下印章，即留下Poly-HEMA模式化包被層。接種細(xì)胞時，細(xì)胞不能在Poly-HEMA模式化包被層上，而只在無包被區(qū)域即原來印章突起遮蓋區(qū)域黏附生長。


圖1、Poly-HEMA毛細(xì)管微包被法控制細(xì)胞空間分布、形狀及大小技術(shù)流程示意圖。圖中PDMS為聚二甲基硅氧烷。
圖2、PDMS高彈體印章顯微圖譜。圖中較亮的圖案為印章的凸起部分，而暗背景區(qū)域為凹入部分。放置在平滑表面時，凸起部分與表面緊密接觸。而凹入部分與表面間的縫隙形成連續(xù)的毛細(xì)管通道。
圖3、模式化poly-HEMA包被顯微圖譜。左圖長方形為15×40μm，右圖正方形邊長25μm。細(xì)胞培養(yǎng)皿上模式化poly-HEMA包被圖4、細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。AB為牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，CD為人成纖維細(xì)胞。細(xì)胞分布于無poly-HEMA包被區(qū)，細(xì)胞的形狀和大小與無poly-HEMA包被區(qū)域一致。A圖長方形邊長20×30μm，B圖正方形邊長25μm，C圖直徑30μm，D圖直徑40μm。
具體實施例方式
為了更好的理解本發(fā)明，下列實施例將予以進(jìn)一步說明，但并非對本發(fā)明的限制。
實施例(一)1、 高彈體印章的制作干凈單晶硅片上離心涂布厚約1微米的光刻膠(S-9912，Shipley公司出產(chǎn))，80℃烘烤25分鐘，然后通過掩模以相應(yīng)光源(200W高壓汞燈照射90秒)曝光，并以2％四甲基氫氧化銨水溶液顯影除去曝光光刻膠，即可在硅片表面上形成未曝光光刻膠的模式化包被層。然后120℃再次烘烤20分鐘，以使光刻膠牢固粘貼在硅片上。按照1∶10的比例混合聚二甲基硅氧烷(Dow Coming公司產(chǎn)品，Sylgard 184)，倒在硅片上聚合，聚合完畢后揭下，即得高彈體印章。印章表面上含有凹凸圖案，圖案尺度和高度與硅片上光刻膠相同，圖形相反。印章整體厚度4-5毫米。
2、poly-HEMA毛細(xì)管微包被層制作將PDMS高彈體印章圖案一面向下扣在細(xì)胞培養(yǎng)皿表面，施加適宜壓力，使得印章凸起部分與培養(yǎng)皿表面緊密接觸(此時可見接觸面上出現(xiàn)虹彩)，在印章一端滴加1滴10％poly-HEMA溶液(溶解于95％乙醇)，溶液借助毛細(xì)作用自發(fā)充填印章與培養(yǎng)皿間形成的毛細(xì)管通道。室溫放置30分鐘后乙醇即可揮發(fā)完畢，揭下印章，培養(yǎng)皿表面上即留下poly-HEMA的模式化包被層。poly-HEMA模式化包被層的凹凸與印章相反。poly-HEMA的模式包層具備空間的分辨能力，可以限制細(xì)胞的空間分布和大小。
實施例(二)在poly-HEMA的模式包層上細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞接種及培養(yǎng)按照常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)操作。我們培養(yǎng)了2種細(xì)胞，分別是牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。兩種細(xì)胞的粘附和生長均局限在無包被區(qū)，細(xì)胞的形狀和大小與包被圖案相同。表明該技術(shù)可成功地用于細(xì)胞的空間分布、形狀及大小控制。
權(quán)利要求
1.一種利用高彈體印章技術(shù)，在支持細(xì)胞粘附的材料表面上引入模式化的抑制細(xì)胞粘附的包被層，以控制細(xì)胞的空間分布、形狀和大小的方法，該方法包括如下步驟(1)高彈性印章的制作采用微電子制作技術(shù)，制作表面含有微米尺度凹凸圖案的模具，然后在該模具表面聚合一種具有彈性的材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚合完成后，揭下PDMS，即成為含有于模具表面相反的凹凸圖案的高彈性印章；(2)Poly-HEMA模式化毛細(xì)管微包被層的制作將揭下的PDMS印章扣在平滑的細(xì)胞可粘附材料表面上，使印章凸起處與平滑表面致密接觸，印章凹下的地方則與平滑表面間形成相互連續(xù)的毛細(xì)管空隙；在印章一端滴加Poly-HEMA的乙醇溶液，溶液借助毛細(xì)作用自發(fā)充填毛細(xì)管通道，乙醇揮發(fā)完畢后，揭下印章，即留下Poly-HEMA模式化包被層(3)在Poly-HEMA模式化包被層接種細(xì)胞，能有效的控制細(xì)胞的空間分布、形狀和大小，使細(xì)胞不能在Poly-HEMA模式化包被層上，而只能在無包被區(qū)域即原來印章突起遮蓋區(qū)域黏附生長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，高彈體印章的制作，是在干凈單晶硅片上離心涂布厚約1微米的光刻膠，80℃烘烤25分鐘，然后通過掩模曝光，用2％四甲基氫氧化銨水溶液顯影除去曝光光刻膠，即可在硅片表面上形成未曝光光刻膠的模式化包被層。然后120℃再次烘烤20分鐘，以使光刻膠牢固粘貼在硅片上。按照1∶10的比例混合固化劑和聚二甲基硅氧烷(PDMS)，倒在硅片上聚合，聚合完畢后揭下，即得高彈體印章。印章表面上含有凹凸圖案，圖案尺度和高度與硅片上光刻膠相同，圖形相反。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，Poly-HEMA模式化毛細(xì)管微包被層的制作，是將PDMS高彈體印章圖案一面向下扣在細(xì)胞培養(yǎng)皿表面，施加適宜壓力，使得印章凸起部分與平滑的培養(yǎng)皿表面緊密接觸，在印章一端滴加10％的溶解于95％乙醇的poly-HEMA溶液，溶液借助毛細(xì)作用自發(fā)充填印章與培養(yǎng)皿間形成的毛細(xì)管通道，室溫放置，乙醇揮發(fā)完畢，揭下印章，培養(yǎng)皿表面上即留下poly-HEMA的模式化包被層，poly-HEMA模式化包被層的凹凸與印章相反。poly-HEMA的模式包層具備空間的分辨能力，可以限制細(xì)胞的空間分布和大小。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在Poly-HEMA模式化包被層接種細(xì)胞，能有效的控制細(xì)胞的空間分布、形狀和大小的尺度為微米水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)能用與其功能相同的材料取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，Poly-HEMA能用與其功能相同的材料取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的組織工程、細(xì)胞生物傳感器、生物芯片和生物微機(jī)電系統(tǒng)(BioMEMs)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為交叉領(lǐng)域技術(shù)發(fā)明，涉及半導(dǎo)體工業(yè)微加工技術(shù)、生物材料學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。具體地說，是在支持細(xì)胞粘附的材料表面上，選擇性地引入抑制細(xì)胞粘附材料如poly－HEMA包被層，細(xì)胞因而只能在未被包被的區(qū)域粘附生長。該技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域如組織工程、細(xì)胞生物傳感器、生物芯片和生物微機(jī)電系統(tǒng)(BioMEMs)中有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G03F7/00GK1490400SQ02147588
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月17日
發(fā)明者陶祖萊, 張毅奕, 高宇欣, 胡淵 申請人:中國科學(xué)院力學(xué)研究所