本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的氧化葡萄糖酸桿菌的基因工程菌，屬于代謝工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)是維生素C的重要前體。目前國內(nèi)應(yīng)用較多的2-KLG生產(chǎn)方法為二步發(fā)酵法：第一步，底物D-山梨醇經(jīng)氧化葡萄糖酸桿菌轉(zhuǎn)化為L-山梨糖；第二步，L-山梨糖經(jīng)由生酮基古龍酸菌(俗稱小菌)和巨大芽孢桿菌(俗稱大菌)構(gòu)成的混菌體系轉(zhuǎn)化為2-KLG。在第二步混菌發(fā)酵產(chǎn)酸的過程中，負(fù)責(zé)糖酸轉(zhuǎn)化的微生物只有小菌，其單獨培養(yǎng)時生長微弱，幾乎不產(chǎn)酸；大菌為伴生菌，雖不直接參與L-山梨糖向2-KLG轉(zhuǎn)化過程中的相關(guān)酶催化反應(yīng)過程，但能在混菌體系中顯著促進小菌的生長和2-KLG的積累?；炀l(fā)酵增加了生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性，在實際生產(chǎn)過程中，無法對混菌體系中的兩菌比例進行快速檢測，而這一比例又對2-KLG生產(chǎn)影響顯著；巨大芽孢桿菌廣泛存在于土壤中，對多種噬菌體較為敏感，由于噬菌體問題導(dǎo)致的倒罐是2-KLG生產(chǎn)過程中一個難以忽視的問題；小菌又存在產(chǎn)酸性狀不穩(wěn)定的缺點。傳統(tǒng)二步發(fā)酵法生產(chǎn)2-KLG的過程需三種細(xì)菌參與，發(fā)酵過程分為兩步需要二次滅菌，不僅延長了生產(chǎn)周期還造成了能源和人力財力的大量浪費。因此，將小菌中涉及2-KLG代謝的關(guān)鍵基因克隆到G.oxydans中，得到產(chǎn)2-KLG的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌。

通過在關(guān)鍵酶上構(gòu)建SH3lig支架結(jié)構(gòu)，使關(guān)鍵酶在空間位置上接近，并調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶在G.oxydans的比例從而提高2-KLG的產(chǎn)量，國內(nèi)未見有相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)2-KLG的氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌。

所述基因工程菌表達(dá)了來自Ketogulonicigenium vulgareWSH-001的編碼山梨糖脫氫酶的基因sdh、編碼山梨酮脫氫酶的基因sndh；其中，所述sdh基因3’端通過限制性酶切位點連入序列如SEQ ID NO.1所示的(GS₂-SH3lig)₂得到sdh-(GS₂-SH3lig)₂，所述sndh基因5’端通過融合PCR連入SH3-GS₂得到SH3-GS₂-sndh。所述sdh-(GS₂-SH3lig)₂前啟動子為中強度P_tuf啟動子，SH3-GS₂-sndh前啟動子為強啟動子P_dnak啟動子。所述P_tuf、P_dnak、sdh-(GS₂-SH3lig)₂及SH3-GS₂-sndh基因連入G.oxydans-E.coli穿梭質(zhì)粒載體pBBR1MCS-2，然后轉(zhuǎn)入宿主G.oxydans WSH-003。

所述基因sdh在NCBI中登陸號為AEM40042.1、基因sndh在NCBI中登陸號為AEM39934.1。

所述基因工程菌的構(gòu)建過程包括以下步驟：

1)根據(jù)sdh、sndh基因序列設(shè)計引物克隆sdh、sndh基因；

2)合成獲得序列如SEQ ID NO.1所示的(GS₂-SH3lig)₂，連入pUC57，得到pUC57-(GS₂-SH3lig)₂，再通過限制性酶切位點將pUC57-(GS₂-SH3lig)₂上的(GS₂-SH3lig)₂與sdh基因3'端連接得到sdh-(GS₂-SH3lig)₂；合成獲得核苷酸序列如SEQ ID NO.4的SH3基因，通過融合PCR與sndh基因5’端連接，得到SH3-GS₂-sndh；

3)將sdh-(GS₂-SH3lig)₂及SH3-GS₂-sndh基因連入G.oxydans-E.coli穿梭質(zhì)粒載體pBBR1MCS-2上。

4)將得到的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydans)后得到氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌。

所述GS₂是指氨基酸序列GGGGSGGGGS。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌的構(gòu)建過程包括以下步驟：

(1)P_dnak基因通過Sac I、Kpn I酶切位點，連入pUC18上相應(yīng)的酶切位點，得到pUC18-P_dnak；

(2)P_tuf基因通過Sma I、BamH I酶切位點，連入pUC18-P_dnak上相應(yīng)的酶切位點，得到pUC18-P_dnak-P_tuf；

(3)SH3和sndh融合PCR得到的SH3-GS₂-sndh，通過Kpn I、Sma I雙酶切，連入pUC18-P_dnak-P_tuf上相應(yīng)的酶切位點，得到pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf；

(4)擴增sdh序列，sdh基因3'端連接(GS₂-SH3lig)₂得到SH3-GS₂-sndh；sdh-(GS₂-SH3lig)₂連入pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf上的Nde I和Hind III酶切位點，得到pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂；

(5)將P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂從pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂上切下，連入G.oxydans-E.coli穿梭質(zhì)粒pBBR1MCS-2，得到表達(dá)質(zhì)粒pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂；

(6)將得到的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydans)后得到氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌。

本發(fā)明還提供應(yīng)用所述氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的方法，是按8～10％(v/v)接種量將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、220r/min，發(fā)酵120h。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇150，酵母浸膏20，CaCl₂0.5，121℃ 15min滅菌?？敲顾孛顾亟K濃度100μg/mL。

所述種子培養(yǎng)液是從固體平板上挑取單菌落接種于裝有種子培養(yǎng)基中(含有終濃度為100μg/mL卡那霉素霉素)的搖瓶中，30℃、220r/min條件下震蕩培養(yǎng)30h至對數(shù)生長期。

所述種子培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇150，酵母粉10，瓊脂粉20(固體培養(yǎng)基)，121℃ 15min滅菌?？敲顾孛顾亟K濃度100μg/mL。

本發(fā)明采用分子生物學(xué)手段引入sdh、sndh，并通過SH3lig和SH3支架結(jié)構(gòu)使SDH和SNDH空間位置上接近并調(diào)節(jié)兩酶比例，從而實現(xiàn)山梨醇通過氧化葡萄糖酸桿菌生產(chǎn)2-KLG，簡化了2-KLG生產(chǎn)工藝，搖瓶水平2-KLG產(chǎn)量最高可達(dá)45.39g·L^-1，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1在SDH C端構(gòu)建不同數(shù)量的SH3lig支架結(jié)構(gòu)，SNDH N端構(gòu)建SH3配體蛋白。

圖2 T-sdh-(GS₂-SH3lig)2/3/4構(gòu)建過程

圖3實施例1質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖4采用不同數(shù)量的蛋白支架結(jié)構(gòu)將山梨糖脫氫酶和山梨酮脫氫酶進行連接后2-KLG產(chǎn)量。橫坐標(biāo)0、1、2、3、4分別代表G.oxydans/pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₀、G.oxydans/pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₁、G.oxydans/pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂、

G.oxydans/pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₃、

G.oxydans/pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₄。

圖5采用同一種啟動子P_tuf作為sdh、sndh的啟動子，與采用兩個不同啟動子的2-KLG產(chǎn)量的對比。A代表G.oxydans/pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂、B代表G.oxydans/pBBR-P_tuf-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂。

具體實施方式

實施例1表達(dá)載體的構(gòu)建

1、設(shè)計引物P_dnak-F/P_dnak-R，以G.oxydans WSH-003基因組為模板，擴增大小為377bp的啟動子P_dnak基因，序列如SEQ ID NO.4所示；P_dnak基因先連入克隆載體pMD19(Simple)，測序正確后，通過Sac I、Kpn I雙酶切，連入pUC18上相應(yīng)的酶切位點，得到pUC18-P_dnak。

2、設(shè)計引物P_tuf-F/P_tuf-R，以G.oxydans WSH-003基因組為模板，擴增大小為599bp的啟動子P_tuf基因，序列如SEQ ID NO.3所示；P_tuf基因先連入克隆載體pMD19(Simple)，測序正確后，通過Sma I、BamH I雙酶切，連入pUC18-P_dnak上相應(yīng)的酶切位點，得到pUC18-P_dnak-P_tuf。

3、設(shè)計引物sndh-F/sndh-R，引物上引入編碼一個GS的序列，以K.vulgareWSH-001基因組為模板，擴增大小為1305bp的sndh基因；設(shè)計引物SH3-F/SH3-R，引物上引入編碼一個GS的序列，以pUC57-SH3為模板，擴增大小為189bp的SH3基因，SH3和sndh融合PCR得到的SH3-GS₂-sndh，先連入克隆載體pMD19(Simple)，測序正確后，通過Kpn I、Sma I雙酶切，連入pUC18-P_dnak-P_tuf上相應(yīng)的酶切位點，得到pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf。

4、設(shè)計引物sdh-F/sdh-R0；sdh-F/sdh-R1，以K.vulgareWSH-001基因組為模板，分別擴增sdh序列，得到sdh-(GS₂-SH3lig)₀、sdh-(GS₂-SH3lig)₁，sdh、sdh-(GS₂-SH3lig)₁分別基因連入克隆載體pMD19(Simple)并測序，得到T-sdh-(GS₂-SH3lig)₀、T-sdh-(GS₂-SH3lig)₁。

設(shè)計引物sdh-F/sdh-Rn(n＝2、3、4，sdh-Rn上帶有Xho I和Hind III兩個酶切位點)，以K.vulgareWSH-001基因組為模板，擴增sdh序列，得到不帶終止密碼子的sdh片段，連入克隆載體pMD19(Simple)并測序正確后得到重組載體T-sdh；將兩端添加Xho I、Hind III酶切位點的(GS₂-SH3lig)₂、(GS₂-SH3lig)₃、(GS₂-SH3lig)₄分別連入T-sdh，得到T-sdh-(GS₂-SH3lig)₂、T-sdh-(GS₂-SH3lig)₃、T-sdh-(GS₂-SH3lig)₄(圖2)。

將sdh-(GS₂-SH3lig)₀、sdh-(GS₂-SH3lig)₁、sdh-(GS₂-SH3lig)₂、sdh-(GS₂-SH3lig)₃、sdh-(GS₂-SH3lig)₄用Nde I和Hind III從相應(yīng)T載體上切下，連入pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf上相應(yīng)的酶切位點得到pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)_0/1/2/3/4。

5、用Sac I和Hind III將P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)_0/1/2/3/4從pUC18-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)_0/1/2/3/4上切下，連入G.oxydans-E.coli穿梭質(zhì)粒pBBR1MCS-2，得到5個表達(dá)質(zhì)粒pBBR-P_dnak-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)_0/1/2/3/4(圖3)。

6、參照步驟1～5，構(gòu)建pBBR-P_tuf-SH3-GS₂-sndh-P_tuf-sdh-(GS₂-SH3lig)₂，用同一種啟動子P_tuf控制兩個基因的表達(dá)。

表1本實施例中所用引物

實施例2 G.oxydans WSH-003基因工程菌的構(gòu)建

通過電轉(zhuǎn)將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入G.oxydans WSH-003中。具體為：

G.oxydans WSH-003感受態(tài)細(xì)胞制備方法：從固體培養(yǎng)基平板上挑取G.oxydans WSH-003單菌落接種至25mL種子液體培養(yǎng)基中，30℃、200rpm預(yù)培養(yǎng)36h；按10％的接種量轉(zhuǎn)接25mL新鮮的種子液體培養(yǎng)基，30℃、200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.6-1.8；將上述細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入無菌的50mL離心管中，4℃、5,000rpm離心5min，棄上清收集細(xì)胞；加20mL冰浴的10％甘油溶液重懸細(xì)胞，充分混勻，4℃、5,000rpm離心5min，收集細(xì)胞棄上清；相同條件下，重復(fù)上述步驟兩次；加500μL冰浴的10％甘油溶液重懸細(xì)胞，充分混勻，按每管100μL分裝到無菌的EP管中，冰浴中放置待用。

電擊轉(zhuǎn)化方法：在冰浴中冷卻重組質(zhì)粒和0.1cm電轉(zhuǎn)杯10min；吸取5-10μL重組質(zhì)粒，加入到預(yù)冷的感受態(tài)細(xì)胞中混勻并冰浴2min；小心吸取混合物(避免引入氣泡)，加入到同樣預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，參照Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀說明書進行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)條件為：1800V電場強度、200Ω電阻、25μF電容，5ms電轉(zhuǎn)時間；電擊結(jié)束后，應(yīng)立即往電轉(zhuǎn)杯中加入400μL冰上預(yù)冷的種子液體培養(yǎng)基，輕柔混勻；吸取上述混合物至試管中，30℃、200rpm搖床震蕩培養(yǎng)2h，復(fù)蘇電轉(zhuǎn)化細(xì)胞；吸取200μL上述培養(yǎng)液涂布卡那霉素霉素抗性平板，30℃倒置培養(yǎng)至長出單菌落。

實施例3重組菌的種子培養(yǎng)及發(fā)酵

種子培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇150，酵母粉10，瓊脂粉20(固體培養(yǎng)基)，121℃ 15min滅菌?？敲顾孛顾亟K濃度100μg/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇150，酵母浸膏20，CaCl₂0.5，121℃ 15min滅菌?？敲顾孛顾亟K濃度100μg/mL。

培養(yǎng)條件：從固體平板上挑取單菌落接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基中(含有終濃度為100μg/mL卡那霉素霉素)的500mL平底搖瓶中，30℃ 220r/min條件下震蕩培養(yǎng)30h至對數(shù)生長期，

然后按10％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含有終濃度100μg/mL卡那霉素霉素)的500mL三刺搖瓶中，30℃ 220r/min，發(fā)酵120h。5株重組菌中2-KLG產(chǎn)量最高可達(dá)50.39g·L^-1(表2、圖4、圖5)。

表2采用不同數(shù)量的蛋白支架結(jié)構(gòu)將山梨糖脫氫酶和山里酮脫氫酶進行連接后2-KLG產(chǎn)量

注：0、1、2、3、4分別代表SH3lig的數(shù)量

D-山梨醇、2-KLG含量檢測：高效液相色譜(HPLC)：所用柱子為：Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)，檢測器：示差折光檢測器，液相條件為：柱溫40℃，流速0.5mL/min，流動相5mmol/L H₂SO₄，進樣量10μL。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。