本發(fā)明屬于生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治棉花立枯病的枯草芽孢桿菌，以及利用該枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑，還涉及它們?cè)诜乐蚊藁⒖莶∩系挠猛尽?br>背景技術(shù)：
：棉花立枯病是由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的一種棉花苗期病害，主要癥狀為：在棉種萌發(fā)前侵染而造成爛種，萌發(fā)后未出土前被侵染而引起爛芽；棉苗出土后受害，初期在近土面基部產(chǎn)生黃褐色病斑，病斑逐漸擴(kuò)展包圍整個(gè)基部呈明顯縊縮，病苗萎蔫倒伏枯死；拔起病苗，莖基部以下的皮層均遺留土壤中，僅存尖紉的鼠尾狀木質(zhì)部；子葉受害后，多在子葉中部產(chǎn)生黃褐色不規(guī)則形病斑，常脫落穿孔。棉花立枯病嚴(yán)重影響棉花的正常生長(zhǎng)，發(fā)病后常導(dǎo)致棉苗成片死亡，是亟待解決的問題。棉花立枯病以化學(xué)防治為主，包括在播種前利用化學(xué)藥劑拌種、包衣或浸種，播種后用化學(xué)藥劑進(jìn)行噴霧、灌根等，但化學(xué)防治效果較差，并且還存在環(huán)境污染、長(zhǎng)期用藥產(chǎn)生抗藥性和成本高等問題。生物防治因其具有專化性強(qiáng)、防效高、藥效持久性好、并且不存在環(huán)境污染問題等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到越來越多的重視。目前用于防治棉花立枯病的微生物主要有：哈茨木霉(CN104430549A)、萎縮芽孢桿菌(CN104531545A)、巨大芽孢桿菌(CN103320360A)、解淀粉芽孢桿菌(CN105176893A；CN104498386A)、枯草芽孢桿菌(CN105199997A；CN104770398A；CN104642390A；CN105340972A；)、雙核絲核菌(CN1952106A)、沙雷氏菌(CN103122330A)、綠針假單胞菌(CN1932006A)和熒光假單胞菌(CN1058230A)等。從上述可知，用于防治棉花立枯病的微生物主要是芽孢桿菌(Bacillus)，主要是由于芽孢桿菌具有分布廣、易分離培養(yǎng)、能產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的芽胞、貯藏期長(zhǎng)和使用方便等特點(diǎn)；此外，芽孢桿菌能產(chǎn)生內(nèi)生芽胞，有極強(qiáng)的抗逆能力，相比其他類型的生防因子，更有利于菌劑的生產(chǎn)，如在劑型加工環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，芽孢桿菌是一種理想的生防微生物。由于生物多樣性和生物的共同進(jìn)化特性，針對(duì)病原微生物的不同種類和進(jìn)化，需要篩選更多不同種類的微生物進(jìn)行應(yīng)對(duì)，而篩選對(duì)病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是對(duì)病原微生物防治的最有效方法之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種用于防治棉花立枯病的枯草芽孢桿菌。本發(fā)明另一目的在于提供利用上述枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑。本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明第四目的在于提供上述枯草芽孢桿菌在防治棉花立枯病上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治棉花立枯病上的用途。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株HMB29359，已于2016年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13213。利用上述枯草芽孢桿菌HMB29359生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌HMB29359菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。上述微生物菌劑可以為液體制劑或粉劑。上述微生物菌劑，其液體制劑中枯草芽孢桿菌HMB29359的活菌數(shù)大于18.0×108cfu/mL。上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：(1)菌種活化：將低溫保存的HMB29359菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，然后挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上，在25～35℃下培養(yǎng)10～16小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液制備：用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(1)活化的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基100mL中，在25～35℃、搖床轉(zhuǎn)速為150～220rpm條件下培養(yǎng)10～16小時(shí)，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比為1～3％的比例將步驟(2)所得的種子液接入到玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基(pH值為7.0)中，在溫度為25～35℃、搖床轉(zhuǎn)速為150～220rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)36～40小時(shí)，得發(fā)酵液；然后每隔30分鐘從發(fā)酵液中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野中的芽胞和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，待發(fā)酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數(shù)的90％時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為HMB29359的液體制劑。上述制備方法步驟(1)中所述的LB平板培養(yǎng)基或LB斜面培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，瓊脂粉12～18g，水1000mL。上述制備方法步驟(2)中所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，水1000mL。所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制備。上述制備方法步驟(3)中所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的組成成分及其重量百分比為：玉米粉1.0～3.0％，黃豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～0.8％，MnSO4·H2O0.5～1.0％，其余為水。所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備方法，包括按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，調(diào)節(jié)pH，攪拌均勻即可。上述枯草芽孢桿菌HMB29359在防治棉花立枯病上的應(yīng)用。上述微生物菌劑在防治棉花立枯病上的應(yīng)用。上述微生物菌劑的使用方法：將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌體數(shù)為107cfu/mL，于棉花播種前將種子浸種半小時(shí)；或?qū)⑸鲜鏊梦⑸锞鷦┯锰妓徕}吸附，制作成枯草芽孢桿菌HMB29359粉劑，于棉花播種前按照藥種比1：10的重量比進(jìn)行拌種。本發(fā)明HMB29359菌株的篩選和分離過程：HMB29359菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所小安舍試驗(yàn)站棉田土壤中分離得到。2014年4月河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所小安舍試驗(yàn)站棉田中采集土樣，帶回實(shí)驗(yàn)室后稱取1g土樣放到250mL的滅菌三角瓶中，加入100mL無菌水，放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液10mL加入50mL滅菌離心管中，在80℃恒溫水浴30分鐘，然后取1mL加無菌水9mL，即成10mL10-3倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10-4、10-5、10-6倍稀釋液，取各濃度微生物懸液200μL涂于LB培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3次，在30℃恒溫培養(yǎng)1d-3d，進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化。并以棉花立枯病為靶標(biāo)，通過平板對(duì)峙法、盆栽試驗(yàn)法進(jìn)行生防菌的篩選。結(jié)果從中篩選出一個(gè)對(duì)棉花立枯病具有明顯防治效果的菌株，定名為HMB29359。HMB29359菌株的分類鑒定：(1)形態(tài)特征鑒定在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)10h后產(chǎn)生芽胞，芽胞中生，橢圓形，胞囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴胞晶體，能運(yùn)動(dòng)，鞭毛周生。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤(rùn)；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，表面形成白色菌膜。這些形態(tài)特征與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等編著.科學(xué)出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株HMB29359屬于芽孢桿菌(Bacillus)。(2)利用16SrDNA序列鑒定分類以HMB29359的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對(duì)16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中所述的引物序列為：27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQIDNo:1)；1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQIDNo:2)。16SrDNA的PCR反應(yīng)體系為50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL；HMB29359基因組DNA50ng；ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR的反應(yīng)條件為95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序，得到HMB29359的16SrDNA序列(見SEQIDNo:3)。將所得HMB29359的16SrDNA序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果HMB29359與芽孢桿菌屬的16SrDNA同源性達(dá)到96％；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(見圖1)HMB29359與芽孢桿菌屬聚合到一起，說明HMB29359屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。(3)利用gyrB基因序列鑒定分類以HMB29359基因組DNA為模板，以芽孢桿菌gyrB基因簡(jiǎn)并引物gyrB-F和gyrB-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列為：gyrB-F：5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’(SEQIDNo:4)；gyrB-R：5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’(SEQIDNo:5)。gyrB的PCR反應(yīng)體系為50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB29359基因組DNA50ng；ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR的反應(yīng)條件為95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序，得HMB29359菌株的gyrB基因序列(見SEQIDNo:6)。將所得的HMB29359菌株的gyrB基因序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果HMB29359與枯草芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高，達(dá)到95.1％；同時(shí)利用MEGA軟件(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，分子進(jìn)化遺傳分析)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(見圖2)HMB29359菌株與枯草芽孢桿菌聚合到一起，說明HMB29359為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，并且與現(xiàn)有菌株不同，是一個(gè)新菌株。綜合以上形態(tài)特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性對(duì)比分析的結(jié)果，可知HMB29359屬于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，并且和現(xiàn)有的芽孢桿菌菌株不同，是一個(gè)新的枯草芽孢桿菌菌株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)本發(fā)明為防治棉花立枯病提供了一個(gè)新的高效的微生物，開辟了一個(gè)新的防治途徑；(2)本發(fā)明枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯病的防治效果好，平均防效在70.0％以上，且?；詮?qiáng)；(3)本發(fā)明微生物菌劑屬于天然生物制劑，不存在環(huán)境污染問題，屬于環(huán)境友好型；(4)利用本發(fā)明防治棉花立枯病不易產(chǎn)生抗藥性，藥效持久性好，也不需要經(jīng)常重復(fù)施藥；(5)本發(fā)明微生物菌劑制備方法簡(jiǎn)單、成本低、使用簡(jiǎn)單。附圖說明圖1為HMB29359菌株根據(jù)16SrDNA序列獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。圖2為HMB29359菌株根據(jù)gyrB基因序列獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。具體實(shí)施方式下面以具體實(shí)施例來進(jìn)一步清楚地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量百分含量。實(shí)施例1HMB29359微生物菌劑的制備按照如下步驟進(jìn)行：(1)菌種活化：將保存于-80℃的枯草芽孢桿菌菌株HMB29359(已于2016年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13213)在LB平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL)上進(jìn)行活化(30℃)，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比與LB平板培養(yǎng)基相同)上在30℃下培養(yǎng)12小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液的制備：按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中裝入LB液體培養(yǎng)基100mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入一接種環(huán)步驟(1)中活化的菌株，在30℃、搖床轉(zhuǎn)速180rpm條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得種子液；(3)玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備：按照重量百分比將玉米粉1.5％，黃豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO4·H2O0.6％加入水中，攪拌混合均勻，即得玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基；將玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基分裝于規(guī)格為500mL的三角瓶中，每瓶裝200mL；在121℃滅菌30分鐘，再降溫到30℃?zhèn)溆茫?4)發(fā)酵培養(yǎng)：向步驟(3)所得的每瓶200mL玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基中接種步驟(2)所得的種子液2mL；在30℃、搖床轉(zhuǎn)速180rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野中的芽胞和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞數(shù)/(成熟芽胞數(shù)+菌體數(shù))×100)；芽胞率達(dá)到90％時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；共發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，得枯草芽孢桿菌HMB29359的液體制劑。實(shí)施例2枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯病菌抑制作用試驗(yàn)按照如下方法進(jìn)行：(1)供試棉花立枯菌來源：棉花立枯菌RH-2菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從采自河北省邯鄲市邱縣棉花立枯病病株上分離純化的菌株，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理系鑒定為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，致病力測(cè)定表現(xiàn)為強(qiáng)致病力。本菌株由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。(2)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)于2015年9月在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。首先將棉花立枯菌RH-2在PDA平板上活化培養(yǎng)3天，然后用打孔器在菌落邊緣區(qū)域打孔，制成菌片，將棉花立枯菌菌片分別轉(zhuǎn)接在另2個(gè)PDA平板中央，其中一個(gè)PDA平板設(shè)計(jì)為將實(shí)施例1步驟(1)活化后的枯草芽孢桿菌HMB29359點(diǎn)接在距指示菌菌片2.0厘米處，另一個(gè)為空白對(duì)照，即不接種枯草芽孢桿菌HMB29359。在25℃恒溫培養(yǎng)，待空白對(duì)照即將長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)量棉花立枯菌的對(duì)照生長(zhǎng)量(菌落半徑)和處理生長(zhǎng)量(接種HMB29359后的抑制生長(zhǎng)半徑)，拮抗作用用抑菌率表示；抑菌率的計(jì)算公式：抑菌率(％)＝(對(duì)照生長(zhǎng)量-處理生長(zhǎng)量)/對(duì)照生長(zhǎng)量×100。結(jié)果(見表1)本發(fā)明枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯菌RH-2的抑制率達(dá)79.5％；說明枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯菌具有明顯的抑制作用，具有防治棉花立枯病的生防潛力。表1HMB29359菌株對(duì)棉花立枯菌的拮抗作用試驗(yàn)結(jié)果菌株名稱對(duì)照生長(zhǎng)量(mm)處理生長(zhǎng)量(mm)抑菌率(％)HMB2935939.08.079.5實(shí)施例3枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯病的防治效果試驗(yàn)(一)試驗(yàn)處理：(1)HMB29359液體制劑：將實(shí)施例1制備的HMB29359液體制劑用水稀釋50倍。(2)空白對(duì)照：清水。(二)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植病生防實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。首先將蛭石與棉田土壤按照1：1比例混勻，121℃高壓濕熱滅菌1小時(shí)，隔天相同條件下再滅菌1次。在500克土壤中接種棉花立枯菌RH-2菌絲段懸浮液(約107個(gè)/毫升)10毫升，攪拌均勻后裝填在直徑20厘米的塑料花盆中，壓實(shí)。棉花品種選用冀豐106，播種前應(yīng)用實(shí)施例1制備的HMB29359液體制劑50倍水稀釋液浸種半小時(shí)；以清水浸種半小時(shí)作為空白對(duì)照。浸種處理后每盆播種10粒冀豐106種子，覆蓋滅菌土壤，在溫室內(nèi)正常培養(yǎng)。出苗后逐日調(diào)查并記錄處理和空白對(duì)照立枯病發(fā)病株數(shù)，當(dāng)空白對(duì)照立枯病發(fā)病充分時(shí)計(jì)算發(fā)病率和防治效果。結(jié)果(見表2)當(dāng)空白對(duì)照棉花立枯病發(fā)病率為36.7％時(shí)，用枯草芽孢桿菌HMB29359浸種處理的發(fā)病率為5.8％，其對(duì)棉花立枯病的防治效果為84.20％。說明本發(fā)明枯草芽孢桿菌HMB29359及其微生物菌劑對(duì)棉花立枯病具有很好的防治效果。表2枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯病防效試驗(yàn)結(jié)果處理調(diào)查株數(shù)病株數(shù)發(fā)病率(％)防效(％)HMB29359液體制劑5235.8b84.20空白對(duì)照491836.7a--實(shí)施例4枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯病的防治效果試驗(yàn)(一)試驗(yàn)處理：(1)HMB29359液體制劑：將實(shí)施例1制備的HMB29359液體制劑用水稀釋50倍。(2)空白對(duì)照：清水。(二)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植病生防實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。(1)配制育苗土：將蛭石與棉田土壤按照重量比為1：1的比例混勻，121℃高壓濕熱滅菌1小時(shí)，隔天相同條件下再滅菌1次，自然降溫備用。(2)棉花立枯絲核菌RH-2菌種培養(yǎng)：將市購?fù)暾枬M的小米粒在清水中浸泡4小時(shí)，瀝去水分，分裝在50毫升離心管中，每管20克，121℃高壓濕熱滅菌半小時(shí)；冷卻后每管接種棉花立枯絲核菌RH-2菌絲塊4-5塊，混勻，在25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天，備用。(3)在高10厘米的50毫升離心管中裝填制備好的育苗土至距離管底2厘米處，在土面放置一粒培養(yǎng)好的攜帶棉花立枯絲核菌RH-2的小米粒，繼續(xù)裝填育苗土至距管底7厘米處，壓實(shí)，播種。棉花品種選用冀豐106，播種前應(yīng)用實(shí)施例1制備的HMB29359液體制劑50倍水稀釋液浸種半小時(shí)；以清水浸種半小時(shí)作為空白對(duì)照。播種后覆蓋育苗土，輕輕用手壓，蓋上離心管蓋子，置于25℃、12小時(shí)光照12小時(shí)黑暗的控溫控光恒溫室中培養(yǎng)，定量加水調(diào)節(jié)土壤濕度。當(dāng)種子出土?xí)r去掉離心管蓋子。出苗后逐日調(diào)查并記錄處理和空白對(duì)照立枯病發(fā)病株數(shù)，當(dāng)空白對(duì)照立枯病發(fā)病充分時(shí)計(jì)算發(fā)病率和防治效果。結(jié)果(見表3)當(dāng)空白對(duì)照棉花立枯病發(fā)病率為17.7％時(shí)，用枯草芽孢桿菌HMB29359液體制劑浸種處理的發(fā)病率為5.5％，其對(duì)棉花立枯病的防治效果為68.92％。說明本發(fā)明枯草芽孢桿菌HMB29359及其微生物菌劑對(duì)棉花立枯病具有很好的防治效果。表3枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯病防效試驗(yàn)結(jié)果處理調(diào)查株數(shù)病株數(shù)發(fā)病率(％)防效(％)HMB29359液體制劑11065.5b68.92空白對(duì)照961717.7a--實(shí)施例5枯草芽孢桿菌HMB29359對(duì)棉花立枯病的防治效果試驗(yàn)(一)試驗(yàn)處理：(1)HMB29359粉劑：按照重量比為1：1的比例向?qū)嵤├?制備的HMB29359液體制劑中添加碳酸鈣，混合均勻。(2)空白對(duì)照：清水(二)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)在河北省保定市高陽縣北于八村棉花立枯病發(fā)病嚴(yán)重的棉花試驗(yàn)田進(jìn)行。本試驗(yàn)棉花品種選用冀豐106，播種前用HMB29359粉劑按照藥種重量比為1：10的比例拌種；以不處理的種子作為空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)4次，隨機(jī)排列，小區(qū)面積40平方米。出苗后調(diào)查單位面積出苗數(shù)和立枯病死苗數(shù)，每3天調(diào)查一次，累計(jì)統(tǒng)計(jì)棉花立枯病發(fā)病率，計(jì)算防治效果。結(jié)果(見表4)當(dāng)空白對(duì)照棉花立枯病發(fā)病率為7.5％時(shí)，枯草芽孢桿菌HMB29359拌種處理的發(fā)病率為2.8％，其對(duì)棉花立枯病的防治效果為62.67％。說明本發(fā)明枯草芽孢桿菌HMB29359及其微生物菌劑對(duì)棉花立枯病具有較好的防治效果。表4枯草芽孢桿菌HMB29359粉劑對(duì)棉花立枯病防效試驗(yàn)結(jié)果處理調(diào)查株數(shù)病株數(shù)發(fā)病率(％)防效(％)HMB29359粉劑21462.8b62.67空白對(duì)照186147.5a--SEQUENCELISTING<110>河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所<120>一種用于防治棉花立枯病的枯草芽孢桿菌及其微生物菌劑<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>27F<400>1agagtttgatcatggctcag20<210>2<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>1492R<400>2ggctaccttgttacgactt19<210>3<211>972<212>DNA<213>Bacillussubtilis<400>3tgcgggcgggtgctatacatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtta60gcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccggga120aaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggctt180cggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctcac240caaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacg300gcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg360gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaaga420acaagtgccgttcgaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaa480ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcg540taaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggag600ggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcg660gtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaac720tgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgc780cgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgca840ttaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggg900cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggt960cttgacatcctc972<210>4<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>gyrB-F<400>4ttgrcgghrgygghtataaagt22<210>5<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>gyrB-R<400>5tccdccstcagartcwccctc21<210>6<211>967<212>DNA<213>Bacillussubtilis<400>6ccctcctaaaatccggggtgtaggtgcgtcggtcgtaacgcactatcaacagagcttgat60gtgacggttcaccgtgacggtaaaattcaccgccaaacctataaacgcggagttccggtt120acagaccttgaaatcattggcgaaacggatcatacaggaacgacgacacattttgtcccg180gaccctgaaattttctcagaaacaaccgagtatgattacgatctgcttgccaaccgcgtg240cgtgaattggcctttttaacaaagggcgtaaacatcacgattgaagataaacgtgaagga300caagagcgcaaaaatgaataccattacgaaggcggaattaaaagttatgtagagtattta360aaccgctctaaagaggttgtccatgaagagccgatttacattgaaggcgaaaaggacggc420attacggttgaagtggctttgcaatacaatgacagctacacaagcaacatttactcgttt480acaaacaacattaacacgtacgaaggcggtacccatgaagctggcttcaaaacgggcctg540actcgtgttatcaacgattacgccagaaaaaaagggcttattaaagaaaatgatccaaac600ctaagcggagatgacgtaagggaagggctgacagcgattatttcaatcaaacaccctgat660ccgcagtttgagggccaaacgaaaacaaagctgggcaactcagaagcacggacaatcacc720gatacgttattttctacggcgatggaaacatttatgctggaaaatccagatgcggccaaa780aaaattgtcgataaaggcttaatggcggcaaagagcaagaaatggctgcaaaaaaaccgc840gtgaactaacacgccgtaagagtgctttgaaaattcaaacttgcccggtaatttagcgaa900tgctcttccaaagatccgagcatttccaattaataatcgtagaggtgaaattctgacggc960ggaatcg967當(dāng)前第1頁1 2 3