本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一套高效分泌表達異源蛋白的工程菌及其應用。
背景技術：
：枯草芽胞桿菌，是芽胞桿菌屬的一種。單個細胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌能把表達的重組蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中，簡化了下游處理的時間與成本，是一種理想的表達宿主。雖然芽孢桿菌能高效的分泌表達同源蛋白，但是異源蛋白，特別是在未修飾的宿主中，表達的質量和產率不理想。質量控制系統(tǒng)中的蛋白酶是影響重組蛋白表達的瓶頸之一。技術實現要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌為如下(1)或(2)：(1)所示的重組菌為降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白活性得到的菌；(2)所示的重組菌為降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白活性得到的菌。上述重組菌中，所述降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白活性為抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因的表達；所述降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白活性為抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因的表達。上述重組菌中，所述抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因的表達為敲除枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因或其部分片段；所述抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因的表達為敲除枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因或其部分片段。上述重組菌中，所述敲除枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因或其部分片段為將枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因替換為抗性基因；所述敲除枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因或其部分片段為將枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因替換為抗性基因。上述重組菌中，所述將枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因替換為抗性基因和所述將枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因替換為抗性基因可以采用基因組定點編輯或同源重組的方式進行；所述基因組定點編輯具體為ZFN編輯、TALEN編輯或CRISPR/Cas9編輯；所述同源重組具體為λ-red同源重組或sacB基因介導篩選的同源重組或自殺質粒介導的同源重組。上述重組菌中，所述將枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因替換為抗性基因和所述將枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因替換為抗性基因均采用同源重組的方式進行；所述將枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因替換為抗性基因為將包括所述YrrN蛋白編碼基因上游同源臂、抗性基因表達盒和所述YrrN蛋白編碼基因下游同源臂的同源重組片段A導入枯草芽孢桿菌中；所述將枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因替換為抗性基因為將包括所述YwpE蛋白編碼基因上游同源臂、抗性基因表達盒和所述YwpE蛋白編碼基因下游同源臂的同源重組片段B導入枯草芽孢桿菌中。上述重組菌中，所述抗性基因為zeocin；所述同源重組片段A的核苷酸序列為序列2；所述同源重組片段B的核苷酸序列為序列4；所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌BS168。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌為使上述重組菌表達幾丁質結合蛋白CBP21或淬滅酶AIO6BS。上述重組菌中，所述表達的方法為將幾丁質結合蛋白CBP21的編碼基因或淬滅酶AIO6BS的編碼基因導入上述重組菌。本發(fā)明還有一個目的是提供上述重組菌的新用途。本發(fā)明提供了上述重組菌在生產幾丁質結合蛋白CBP21和/或提高幾丁質結合蛋白CBP21的分泌表達水平中的應用。本發(fā)明還提供了上述重組菌在生產淬滅酶AIO6BS和/或提高淬滅酶AIO6BS的分泌表達水平中的應用。本發(fā)明還有一個目的是提供一種生產外源蛋白的方法。本發(fā)明提供的生產外源蛋白的方法為利用上述重組菌，進行外源蛋白表達。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種生產幾丁質結合蛋白CBP21或淬滅酶AIO6BS的方法。本發(fā)明提供的生產幾丁質結合蛋白CBP21或淬滅酶AIO6BS的方法包括如下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)上述重組菌，得到所述幾丁質結合蛋白CBP21或淬滅酶AIO6BS。本發(fā)明基于基因工程技術和同源重組的原理，對胞內的質量控制體系的相關基因YmfH、YrrN、YrrO和YwpE進行了改造，分別構建了YmfH、YrrN、YrrO和YwpE基因的敲除載體，并分別把這些敲除載體導入枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞，分別獲得了對應基因的缺失菌株，實現了在不同工程菌株中表達CBP21和AIO6BS蛋白。通過實驗證明：胞內的質量控制體系的相關基因的失活，不同程度的影響了CBP21和AIO6BS的蛋白表達。說明對胞內質量控制體系相關因子的改造，有利于提高外源蛋白的合成、穩(wěn)定折疊、分泌。同時本發(fā)明的一套胞內蛋白酶敲除的工程菌株，為研究胞內蛋白酶對外源蛋白的分泌表達的影響提供有效的工具，同時也為提高外源蛋白的產量和質量提供了一套工具。附圖說明圖1為蛋白酶基因擴增的電泳圖。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder；1為YmfH；2為YrrN；3為YrrO；4為YwpE。圖2為蛋白酶基因連接T載體后擴增片段電泳圖。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder；1為YmfH；2為YrrN；3為YrrO；4為YwpE。圖3為zeocin基因擴增的電泳圖。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder；第二泳道為zeocin基因。圖4為蛋白酶敲除菌株的PCR鑒定。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder。圖5為SDS-PAGE檢測不同蛋白酶敲除菌株的CBP21蛋白表達情況。其中，1為重組菌BS168ΔYmfHpWB980-CBP21，2為BS168ΔYrrNpWB980-CBP21，3為BS168ΔYrrOpWB980-CBP21，4為BS168ΔYwpEpWB980-CBP21，5為對照菌株(WT-CBP21)，6為對照菌株(空載體)。圖6為SDS-PAGE和Westernblotting檢測不同蛋白酶敲除菌株的AIO6BS蛋白表達情況。其中，1為重組菌BS168ΔYmfHpWB980-AIO6BS，2為BS168ΔYrrNpWB980-AIO6BS，3為BS168ΔYrrOpWB980-AIO6BS，4為BS168ΔYwpEpWB980-AIO6BS，5為對照菌株(WT-AIO6BS)，6為對照菌株(空載體)。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的10×最低鹽溶液：K2HPO428g、KH2PO412g、(NH4)2SO44g、檸檬酸鈉(2H2O)2g、MgSO47H2O0.4g，在蒸餾水中依次溶解，加水至200ml。下述實施例中的色氨酸溶液：2mg/ml，貯于棕色內，115℃滅菌30min，用黑紙或鋁箔紙包裹。下述實施例中的GMI溶液：1×最低鹽溶液94ml，滅菌后，補加25％葡萄糖2ml，5％水解酪蛋白0.4ml、10％酵母汁1ml、2mg/ml色氨基酸溶液2.5ml。下述實施例中的GMII溶液：1×最低鹽溶液96.5ml，滅菌后，補加25％葡萄糖1ml，5％水解酪蛋白0.08ml、10％酵母汁0.04ml、0.5MMgCl20.5ml，0.1MCaCl20.5ml，2mg/ml色氨基酸溶液0.5ml。下述實施例中的SR培養(yǎng)基的配方：Trptose25g/l、Yeastextraction20g/l、K2HPO43g/l。下述實施例中的lysisbuffer溶液的配方：30％蔗糖，50mMTris/HCl，2.5mg/mLlysozyme(pH＝7.2)，按比例配制1L。滅菌。下述實施例中的STbuffer(2×)的配方：1％SDS，50mMDDT。按比例配置100ml。無需滅菌。下述實施例中的10％APS的配方：過硫酸銨1g，加入10ml的去離子水后攪拌溶解，-20度保存。下述實施例中的電泳緩沖液的配方：Tris15.1g/L、Glycine94g/L、SDS5g/L。室溫保存。下述實施例中的轉膜緩沖液的配方：Glycine2.9g/L、Tris5.8g/L、SDS0.37g/L、甲醇200ml/L，室溫保存。下述實施例中的一步法快速WB(HRP)試劑盒是康為世紀的產品。下述實施例中的增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒是天根公司的產品。下述實施例中的CBP21-28a質粒在文獻“維氏氣單胞菌幾丁質酶ChiC的性質和與幾丁質結合蛋白協(xié)同作用的研究，中國農業(yè)科技導報,2014,16(4):167-175”中公開過，公眾可從中國農業(yè)科學院飼料研究所獲得。下述實施例中的質粒pWB980在文獻“1999，DevelopmentofimprovedpUB110-basedvectorsforexpressionandsecretionstudiesinBacillussubtilis”中公開過，公眾可從中國農業(yè)科學院飼料研究所獲得。下述實施例中的枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)168在文獻“Muller,J.P.andC.R.Harwood(1998)."Proteinsecretioninphosphate-limitedculturesofBacillussubtilis168."ApplMicrobiolBiotechnol，49(3):321-327.”中公開過，公眾可從中國農業(yè)科學院飼料研究所獲得。實施例1、一套高效分泌表達異源蛋白的工程菌的構建一、敲除載體的構建1、敲除靶基因的擴增(1)設計并合成如下基因YmfH、YrrN、YrrO和YwpE的引物，引物序列如下表1所示。表1、敲除靶基因及其側翼序列PCR的引物序列引物名稱引物序列YmfH-FGACGTGGACAGTAACCAGGTACAATCYmfH-RTTTCAGCCGGGGTAAATTGATTCATCYrrN-FAAGCGGGCATGGAGGTGCTGCTTCYrrN-RGATTGCTCAGCACGCAGCGGCCGGYrrO-FGATGGCTGCCCGTGAATCTGCGCCTGYrrO-RCTATGGTATTACAAAATCGCGTTTTGYwpE-FCCGGGCCTTTTCAATATCCAAATGAGYwpE-RGCCCCAACATTGCAGGATTTTTTCCT(2)以枯草芽孢桿菌168的基因組DNA為模版，分別采用步驟(1)設計的引物進行PCR擴增，得到PCR產物，PCR產物鑒定見圖1。(3)回收PCR產物，連接pCloneEZ-TOPOVector(中美泰和公司)按照說明書操作，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞，涂布至LB(kana50μg/ml)，37℃，培養(yǎng)過夜。(4)挑取轉化子并提取質粒，送測序公司測序。正確的克隆分別命名為pT-YmfH、pT-YrrN、pT-YrrO和pT-YwpE。2、無縫克隆構建敲除載體(1)設計并合成敲除靶基因同源臂和T載體的擴增引物；引物序列如表2所示。表2、敲除靶基因的敲除載體構建的引物序列(2)分別以pT-YmfH、pT-YrrN、pT-YrrO和pT-YwpE為模板，分別采用表2中的引物進行PCR擴增，分別得到PCR擴增產物，分別純化回收得到大小為3171bp、3041bp、3069bp、3170bp的DNA片段；PCR擴增產物電泳鑒定結果如圖2。(3)設計并合成引物zeocin-F(GGTCTGATCGATCTCTGCAGTCGCG)和zeocin-R(ATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC)，以質粒p7Z6為模版，進行PCR擴增，得到zeocin基因的表達盒，并純化回收大小為727bp的DNA片段；PCR電泳鑒定結果如圖3所示。(4)利用無縫克隆技術，分別將步驟(2)中的回收的大小為3171bp、3041bp、3069bp、3170bp的DNA片段分別與步驟(3)中回收的大小為727bp的DNA片段連接，分別得到敲除載體pΔYmfH、pΔYrrN、pΔYrrO和pΔYwpE。并對其進行測序。測序結果表明：敲除載體p△YmfH為將序列1所示的DNA分子插入pCloneEZ-TOPOVector載體(中美泰和生物技術(北京)有限公司，貨號C5852)的TopoI酶切位點之間，且保持pCloneEZ-TOPOVector載體的其他序列不變得到的載體；其中，序列1的第1-678位為上游同源臂，第679-1405位為zeocin基因的表達盒，第1406-2078位為下游同源臂。敲除載體p△YrrN為將序列2所示的DNA分子插入pCloneEZ-TOPOVector載體的TopoI酶切位點之間，且保持pCloneEZ-TOPOVector載體的其他序列不變得到的載體；其中，序列2的第1-575位為上游同源臂，第576-1302位為zeocin基因的表達盒，第1303-1948位為下游同源臂。敲除載體p△YrrO為將序列3所示的DNA分子插入pCloneEZ-TOPOVector載體的TopoI酶切位點之間，且保持pCloneEZ-TOPOVector載體的其他序列不變得到的載體；其中，序列3的第1-580位為上游同源臂，第581-1307位為zeocin基因的表達盒，第1308-1976位為下游同源臂。敲除載體p△YwpE為將序列4所示的DNA分子插入pCloneEZ-TOPOVector載體的TopoI酶切位點之間，且保持pCloneEZ-TOPOVector載體的其他序列不變得到的載體；其中，序列4的第1-653位為上游同源臂，第654-1380位為zeocin基因的表達盒，第1381-2077位為下游同源臂。二、敲除菌株的構建1、枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備(1)取-80℃保存的甘油菌，LB固體平板上劃線活化菌，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。(2)用接種環(huán)接一環(huán)菌于5mlGMI溶液，在30℃(100r/min)，培養(yǎng)過夜約16h。(3)次日取2ml轉接到18mlGMI中，在37℃，200r/min)培養(yǎng)，至生長對數末期。(4)再取10ml培養(yǎng)液轉接到90mlGMII中，37℃(100r/min)，培養(yǎng)90min，5000g，離心10min，收集菌體。(5)用10ml原培養(yǎng)液上清，輕輕懸浮菌體，懸浮后的菌體即為枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞，可以直接用來轉化。2、枯草芽孢桿菌的轉化分別把步驟一制備的敲除載體pΔYmfH、pΔYwpE、pΔYrrN和pΔYrrO導入到枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞中，涂布在LB(zeocin25μg/ml)抗性板上，37℃，培養(yǎng)過夜。3、敲除菌株的鑒定(1)挑取轉化子于LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)過夜；(2)提取各個轉化子的DNA；(3)設計每個敲除基因的上游鑒定引物與Zeocin-JDR組成引物對，分別以對應的敲除菌株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。以野生型的枯草芽孢桿菌菌株的基因組DNA為對照。PCR鑒定引物的序列如表3所示。表3、敲除靶基因菌株的PCR驗證的引物序列ymfH-JDFACGGCACGTCAGTATCGGCTGATYrrN-JDFCAAGGTTTTATGATAAAATATATCGGYrrO-JDFCTTAGCAGAAGCCGGTGTCGATGCAGywpE-JDFAAGTCAAAACTCATTCTTAAATAGTTGGZeocin-JDRTTCGTGGACACGACCTCCGACCACTCGGCGPCR鑒定結果如圖4所示。從圖中可以看出，野生型菌株沒有擴增到條帶，而敲除菌株BS168ΔYmfH、BS168ΔYrrN、BS168ΔYrrO和BS168ΔYwpE分別可以擴增得到大小為1546bp、1260bp、1305bp和1158bp的目的條帶，并分別對其進行回收測序，結果表明敲除菌株成功構建。枯草芽孢桿菌BS168ΔYmfH為將篩選標記基因zeocin的表達盒(序列1的第679-1405位所示的DNA分子)替換枯草芽孢桿菌的基因組第178353-179580位所示的DNA分子，且保持枯草芽孢桿菌基因組其他序列不變，得到的菌；枯草芽孢桿菌BS168ΔYrrN為將篩選標記基因zeocin的表達盒(序列1的第679-1405位所示的DNA分子)替換枯草芽孢桿菌的基因組第2794191-2795055位所示的DNA分子，且保持枯草芽孢桿菌基因組其他序列不變，得到的菌；枯草芽孢桿菌BS168ΔYrrO為將篩選標記基因zeocin的表達盒(序列1的第679-1405位所示的DNA分子)替換枯草芽孢桿菌的基因組第2793204-2793812位所示的DNA分子，且保持枯草芽孢桿菌基因組其他序列不變，得到的菌；枯草芽孢桿菌BS168ΔYwpE為將篩選標記基因zeocin的表達盒(序列1的第679-1405位所示的DNA分子)替換枯草芽孢桿菌的基因組第3741802-3742043位所示的DNA分子，且保持枯草芽孢桿菌基因組其他序列不變，得到的菌。實施例2、CBP21和AIO6BS在不同的敲除菌株中的表達分析一、重組菌的獲得1、敲除菌株感受態(tài)細胞的制備按照實施例1的步驟二中的1的方法分別制備枯草芽孢桿菌BS168ΔYmfH、BS168ΔYrrO、BS168ΔYrrN和BS168ΔYwpE的感受態(tài)細胞。2、CBP21分泌表達載體pWB980-H08-CBP21和AIO6BS分泌表達載體pWB－AIO6BS的構建(1)CBP21分泌表達載體pWB980-H08-CBP21的構建以CBP21-28a質粒為模板，采用引物CBP21F1、CBP21F2和CBP21R進行PCR擴增，得到CBP21基因片段；以質粒pWB980為模板，采用引物pWB980-VR和pWB980-VF進行PCR擴增，得到骨架載體A。采用HiFiDNAAssemblyCloningKit(Catalog#E5520S)將CBP21基因片段與骨架載體進行無縫克隆，得到CBP21分泌表達載體pWB980-H08-CBP21。引物序列如下：CBP21F1：GCGCAACTCAAGCTTTTGCCAAAGAACATCACCATCACCATCACCATCACGG；CBP21F2：GAACATCACCATCACCATCACCATCACGGTTATGTCGAATCGCCGGCCAGC；CBP21R：GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTACTCAGGTTGACGTCGATCGCCTG；pWB980-VR：TTCTTTGGCAAAAGCTTGAGTTGCGCCTCCTG；pWB980-VF：GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGC。(2)AIO6BS分泌表達載體pWB-AIO6BS的構建以pT-AIO6BS(中美泰和合成)為模板，采用引物AIO6BSF和AIO6BSR進行PCR擴增，得到AIO6BS基因片段；以質粒pWB980為模板，采用引物pWB980-VR-AIO6BS和pWB980-VF-AIO6BS進行PCR擴增，得到骨架載體B；采用HiFiDNAAssemblyCloningKit(Catalog#E5520S)將AIO6BS基因片段與骨架載體B進行無縫克隆，得到AIO6BS分泌表達載體pWB-AIO6BS。引物序列如下：AIO6BSF：ATGCATCACCATCACCATCACCATCATATGAAGTCCCACGAGATCGAGACCTC；AIO6BSR：GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTAGGCTGTGCAATCCCGCATAAAGC；pWB980-VR-AIO6BS：CATATGATGGTGATGGTGATGGTGATGCatcGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTAC；pWB980-VF-AIO6BS：GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGC。3、重組菌的獲得分別將步驟2獲得的pWB980-H08-CBP21和PWB-AIO6BS導入步驟1制備的枯草芽孢桿菌BS168ΔYmfH、BS168ΔYrrO、BS168ΔYrrN和BS168ΔYwpE感受態(tài)細胞中，分別得到重組菌，并將其涂布在LB(kanamycin25μg/ml)抗性板上，37℃，培養(yǎng)過夜。分別將步驟2獲得的pWB980-H08-CBP21和PWB-AIO6BS導入枯草芽孢桿菌168感受態(tài)細胞中，得到對照菌株(WT-CBP21)和對照菌株(WT-AIO6BS)。將步驟2獲得的pWB980載體導入枯草芽孢桿菌168感受態(tài)細胞中，得到對照菌株(空載體)。4、重組菌的鑒定挑取轉化子，分別采用CBP21F1/CBP21R引物和AIO6BSF/AIO6BSR引物對重組菌進行PCR鑒定，并將PCR產物送睿博興科公司測序。引物序列如下：CBP21F1：GCGCAACTCAAGCTTTTGCCAAAGAACATCACCATCACCATCACCATCACGG；CBP21R：GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTACTCAGGTTGACGTCGATCGCCTG；AIO6BSF：ATGCATCACCATCACCATCACCATCATATGAAGTCCCACGAGATCGAGACCTC；AIO6BSR：GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTAGGCTGTGCAATCCCGCATAAAGC。將經CBP21F1/CBP21R引物進行PCR鑒定正確的菌株分別命名為重組菌BS168ΔYmfH-CBP21、BS168ΔYrrN-CBP21、BS168ΔYrrO-CBP21和BS168ΔYwpE-CBP21；將經AIO6BSF/AIO6BSR引物進行PCR鑒定正確的菌株分別命名為重組菌BS168ΔYmfH-AIO6BS、BS168ΔYrrN-AIO6BS、BS168ΔYrrO-AIO6BS和BS168ΔYwpE-AIO6BS。對照菌株(空載體)均未擴增出目的條帶。二、CBP21在不同的敲除菌株中的表達1、發(fā)酵培養(yǎng)分別對步驟一獲得的重組菌BS168ΔYmfH-CBP21、BS168ΔYrrN-CBP21、BS168ΔYrrO-CBP21、BS168ΔYwpE-CBP21、BS168ΔYmfH-AIO6BS、BS168ΔYrrN-AIO6BS、BS168ΔYrrO-AIO6BS和BS168ΔYwpE-AIO6BS進行發(fā)酵培養(yǎng)，以對照菌株(WT-CBP21)、對照菌株(WT-AIO6BS)和對照菌株(空載體)作為對照。具體步驟如下：(1)菌株活化取-80℃保存的甘油菌，于LB固體平板(kana25μg/ml)上劃線活化菌，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。(2)搖瓶發(fā)酵接單菌落于20mLSR培養(yǎng)基(kana25μg/ml)30℃搖床培養(yǎng)24h。(3)胞外蛋白樣品的制備取10OD菌液，12000rpm離心10min；取800ul上清，等體積丙酮沉淀，-80℃沉淀20min后，離心，棄上清，80μlPBS溶解沉淀，加入20μlSDSloadingbuffer，煮沸5min。2、western-blotting檢測(1)按照TGXStainFreeFastCast凝膠試劑盒的說明書灌制免染膠；(2)免染膠凝固后，即可上樣進行電泳，電壓250V，30～60min；(3)電泳結束后將免染膠放置于凝膠成像儀，選擇ImageLab軟件的ProteinStainFree程序，曝光時間選擇1min，點擊運行即可成像。(4)成像結束后，將免染膠、厚濾紙和在甲醇中浸透過的PVDF膜置于轉膜緩沖液中平衡10min，注意防止產生氣泡，按照從下到上的順序將濾紙、PVDF膜、免染膠和濾紙鋪在濕潤的轉膜儀上，電壓15V，時間60min。(5)將轉膜后的PVDF膜浸沒于一步法快速WB(HRP)試劑盒(康為世紀)中的封閉液中，室溫振蕩10min后倒掉封閉液，加入10ml1X漂洗液，于搖床上漂洗1min。(6)洗膜的同時可準備抗體孵育液：取抗體反應液HRP(康為世紀#CW5355A)100ul到EP管中，加入適量一抗(天根#AB102-01)，槍頭吸打混勻，室溫孵育5min；(7)將混勻的抗體與反應液HRP混合液加入到10ml抗體稀釋液中，混勻；(8)步驟(5)中洗膜完成后，倒掉漂洗液，將一抗、反應液及稀釋液混合而成的抗體孵育液加到膜上，搖床上室溫孵育40min；棄去抗體稀釋液，用1X漂洗液漂洗3～5次，每次3min；(9)最后用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根)顯色在試管中先加入1ml1×HRP反應緩沖液，然后依次加入加入50μl試劑A，50μl試劑B和50μl試劑C混勻即可。配制好的溶液應避光存放，30min內有效使用，染色結果為藍紫色。室溫下染色時間約5-30min。SDS-PAGE檢測結果如圖5所示，不同敲除菌株對CBP21蛋白表達的影響不同。從圖中可以看出，和對照菌株相比，枯草芽孢桿菌基因YrrN、YrrO和YwpE的敲除能明顯的提高CBP21的分泌表達水平，其中YrrN效果相對最好；但YmfH基因的敲除不但沒有提高CBP21蛋白的分泌表達水平，而且導致CBP21蛋白的不分泌表達。Westernblotting檢測結果如圖6所示，不同敲除菌株對AIO6BS表達的影響不同。從圖中可以看出，和對照菌株相比，枯草芽孢桿菌基因YmfH、YrrN、YrrO和YwpE的敲除能明顯的提高AIO6BS的分泌表達水平；其中YrrN和YwpE敲除菌株效果相對較好。當前第1頁1 2 3