本發(fā)明屬于生物分析檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針及制備方法及應(yīng)用。

技術(shù)背景

半乳糖血癥是血和尿中半乳糖增多的一種疾病，新生兒或嬰幼兒多出現(xiàn)的該疾病是由于半乳糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(GALT)遺傳性缺失，從而導(dǎo)致半乳糖的第一步代謝產(chǎn)物半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)在患者體內(nèi)組織和細(xì)胞內(nèi)的大量積蓄而造成的。半乳糖血癥的主要癥狀是營養(yǎng)障礙、白內(nèi)障、黃疸，腹瀉，膿毒癥，智力低下和肝脾腫大，新生兒死亡等。半乳糖血癥的臨床治療方法主要是靜脈葡萄糖補(bǔ)充療法，新鮮血漿輸注，電解質(zhì)補(bǔ)充以及針對合并敗血癥患者進(jìn)行抗生素治療。

半乳糖在分子結(jié)構(gòu)上和糖分類中與葡萄糖是截然不同的單糖。食物中的半乳糖主要來自奶類所含的乳糖。哺乳嬰兒所需能量的20％由乳類中的乳糖提供。正常情況下，乳糖進(jìn)入腸道后即被水解成半乳糖和葡萄糖經(jīng)腸粘膜吸收。半乳糖被吸收后在細(xì)胞內(nèi)先后經(jīng)半乳糖激酶(GALK)、半乳糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(GALT)和尿苷二磷酸半乳糖表異構(gòu)酶(GALE)的作用，最終生成l-磷酸葡萄糖進(jìn)入葡萄糖代謝途徑。由于半乳糖的代謝產(chǎn)物半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)在細(xì)胞和體內(nèi)的代謝物積蓄是導(dǎo)致各種臟器官器質(zhì)性病變的主要原因，因此從根本上預(yù)防和治療半乳糖血癥的方法之一是通過有效抑制半乳糖代謝通路中的半乳糖激酶(GALK)避免半乳糖的代謝產(chǎn)物半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)在細(xì)胞內(nèi)的積蓄，從而達(dá)到保持患者健康狀態(tài)的目的(Liu L,Tang M,Walsh MJ,Brimacombe KR,Pragani R,Tanega C,Rohde JM,Baker HL,Fernandez E,Blackman B1,Bougie JM,Leister WH,Auld DS,Shen M,Lai K,Boxer MB,Bioorg Med Chem Lett.2015Feb 1；25(3):721-727)。因此，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能夠有效抑制半乳糖激酶活性的GALK激酶抑制劑，對預(yù)防和治療半乳糖血癥非常重要。

研究表明，半乳糖激酶(GALK)對半乳糖的代謝過程首先是激酶分子中的天冬氨酸殘基對半乳糖結(jié)構(gòu)中的1-位羥基進(jìn)行去離子化，然后從細(xì)胞中的ATP獲取一分子磷酸從而完成半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)的生成(參考文獻(xiàn)：Megarity CF,Huang M,Warnock C,Timson DJ.Bioorg Chem.2011Jun；39(3):120-6.)。上述代謝過程具有很高的特異性，原因是半乳糖激酶不僅特異性地識別半乳糖(而不是其他的單糖。比如葡萄糖，果糖，甘露糖等)，而且半乳糖分子內(nèi)的1-位羥基的存在對半乳糖成為半乳糖激酶的代謝底物亦非常重要。(見圖9)

迄今應(yīng)用于篩選和發(fā)現(xiàn)GALK抑制劑的方法，主要是利用半乳糖激酶將半乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖-l-磷酸過程中需要定量消耗ATP的特點，需要利用在實驗室制備及純化后獲得的半乳糖激酶蛋白，通過向純化后的激酶蛋白中加入定量的半乳糖底物和定量的ATP，然后測試由于抑制劑的抑制作用而導(dǎo)致ATP消耗減少最終判斷抑制劑的效果和強(qiáng)弱(文獻(xiàn)：Liu L,Tang M,Walsh MJ,Brimacombe KR,Pragani R,Tanega C,Rohde JM,Baker HL,Fernandez E,Blackman B1,Bougie JM,Leister WH,Auld DS,Shen M,Lai K,Boxer MB,Bioorg Med Chem Lett.2015Feb 1；25(3):721-727)。這種篩選方法涉及到繁瑣的半乳糖激酶的制備與純化，而且抑制劑本身與ATP的相互作用會對測試結(jié)果產(chǎn)生不可避免的干擾。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑中的用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

其中，

X為O或NH；

R₂較好地選自：(A-1)、(A-2)、(A-3)、(A-4)或(A-5)；

n＝0‐4。

最好是選自：

式中，n＝1‐4。

R₂還可以選自表1列舉的具有不同激發(fā)波長的熒光團(tuán)：

表1

用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)在室溫條件下，將式(A-6)或式(A-7)所示的化合物與6-氨基-6-脫氧半乳糖化合物(A-8)進(jìn)行縮合,得到式(A-9)或式(A-10)所示的半乳糖偶聯(lián)酰胺產(chǎn)物；其中，X＝O或NH；Y＝Cl或OH；n＝1-4；R3和R4相同或者不同，為羥基保護(hù)基；或者R3和R4分別代表鄰位羥基的縮醛或縮酮保護(hù)基；

反應(yīng)式如下：

(2)將步驟(1)獲得的(A-9)或(A-10)中的羥基保護(hù)基脫保護(hù)，或者R3和R4代表的鄰位羥基的縮醛或縮酮保護(hù)基脫保護(hù)，得到式(I)所示用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針，其中，X為O或NH；R₂選自(A-4)或(A-5)；n＝1-4。

在縮合反應(yīng)時使用多肽縮合試劑，所述多肽縮合試劑為N，N’-二環(huán)己基碳二亞(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt),六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)或O-苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)。

在縮合反應(yīng)時使用有機(jī)堿，所述有機(jī)堿為4-二甲氨基吡啶，三乙基胺或二異丙基乙胺。

羥基保護(hù)基為乙?；蚱S基。

鄰位羥基的縮醛或縮酮保護(hù)基為1,2,3,4-二-氧-異丙叉基。

上述用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑中的用途。

本發(fā)明具有以下的有益效果：

提供了一種能夠直接用在細(xì)胞體系中分析、檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針，該探針能夠簡化以往的半乳糖激酶抑制劑篩選過程，避免使用提純精制后的半乳糖激酶蛋白，而直接用于任何表達(dá)半乳糖激酶的細(xì)胞體系中；應(yīng)用本發(fā)明的熒光探針能夠方便快速地實現(xiàn)分析、測試和篩選半乳糖激酶抑制劑的目的，為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能夠用于預(yù)防和治療半乳糖血癥疾病的先導(dǎo)化合物和有效藥物提供了有效的手段和有用的工具。

附圖說明

圖1為本發(fā)明熒光探針化合物I-1的激發(fā)及發(fā)射熒光光譜；

圖2為本發(fā)明熒光探針化合物I-3的激發(fā)及發(fā)射熒光光譜；

圖3為本發(fā)明熒光探針化合物I-5的激發(fā)及發(fā)射熒光光譜；

圖4為本發(fā)明熒光探針化合物I-7的激發(fā)及發(fā)射熒光光譜；

圖5為本發(fā)明熒光探針化合物I-1在血紅細(xì)胞中篩選半乳糖激酶抑制劑的實驗結(jié)果；

圖6為本發(fā)明熒光探針化合物I-3在血紅細(xì)胞中篩選半乳糖激酶抑制劑的實驗結(jié)果；

圖7為本發(fā)明熒光探針化合物I-5在血紅細(xì)胞中篩選半乳糖激酶抑制劑的實驗結(jié)果；

圖8為本發(fā)明熒光探針化合物I-7在血紅細(xì)胞中篩選半乳糖激酶抑制劑的實驗結(jié)果。

圖9為半乳糖激酶特異性識別體內(nèi)半乳糖并對其1-位羥基進(jìn)行磷酸化代謝的示意圖。

具體實施方式

設(shè)計理念是創(chuàng)造一種帶有熒光的半乳糖激酶代謝底物(熒光探針)，當(dāng)熒光探針與細(xì)胞內(nèi)半乳糖激酶的相互作用受到半乳糖激酶抑制劑的影響時產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的變化，從而通過測試熒光探針因抑制劑的競爭性結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光信號變化，達(dá)到發(fā)現(xiàn)和篩選半乳糖激酶抑制劑的目的。

熒光探針含有半乳糖結(jié)構(gòu)，并且在半乳糖6‐位連接熒光團(tuán)，同時能夠被半乳糖激酶識別，通過與半乳糖激酶抑制劑產(chǎn)生競爭從而用于分析、檢測和篩選潛在的半乳糖激酶抑制劑。

本發(fā)明的用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑的熒光探針可經(jīng)過下述合成路線制備獲得：

方法A：

方法B：

方法A中，帶熒光團(tuán)的酰氯可以遵循文獻(xiàn)的類似方法制備獲得(Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2008,vol.18,#3p.1106-1109)。在等當(dāng)量的有機(jī)堿，例如4-二甲氨基吡啶，二乙胺，二異丙基乙胺或者吡啶的存在下帶熒光團(tuán)的酰氯與羥基保護(hù)的6-羥基或者6-氨基半乳糖，例如，商業(yè)購買的1,2:3,4-氧-異丙叉基-α-D-呋喃半乳糖(CAS號：4064-06-6)，或者6-氨基-6-脫氧-1,2,3,4-二-氧-異丙叉基-α-D-半乳糖(CAS號：4711-01-7)，在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)等有機(jī)溶劑中室溫反應(yīng)便可制備獲得熒光團(tuán)與半乳糖偶聯(lián)的中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物經(jīng)過脫去半乳糖羥基保護(hù)基，便可最后制得目標(biāo)熒光探針。脫保護(hù)的條件據(jù)羥基保護(hù)基的種類而定，例如當(dāng)使用?；Ｗo(hù)半乳糖羥基時，可以使用碳酸鉀在甲醇和水的混合溶劑中脫保護(hù)，亦可以在室溫使用氫氧化鈉，氫氧化鉀或者氫氧化鋰在甲醇和水的混合溶劑中脫保護(hù)。

方法B中，帶熒光團(tuán)的羧酸原料可以遵循文獻(xiàn)的方制備獲得(法Bioorg Med Chem.2015Apr 15；23(8):1758-62.)，該原料與羥基保護(hù)的6-羥基或者6-氨基半乳糖，例如，商業(yè)購買的1,2:3,4-氧-異丙叉基-α-D-呋喃半乳糖(CAS號：4064-06-6)，或者6-氨基-6-脫氧-1,2,3,4-二-氧-異丙叉基-α-D-半乳糖(CAS號：4711-01-7)直接在肽合成反應(yīng)常用的多肽縮合試劑，例如N，N’-二環(huán)己基碳二亞(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt),六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)或O-苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)等的存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)制備熒光團(tuán)與半乳糖偶聯(lián)的中間產(chǎn)物，所使用的溶劑可以是DMF，DCM，THF(四氫呋喃)，NMP(N-甲基吡咯烷酮)以及它們的任意混合溶劑，反應(yīng)溫度一般為零度至60℃，縮合反應(yīng)一般添加等當(dāng)量的有機(jī)堿，例如4-二甲氨基吡啶，二乙胺，二異丙基乙胺等。第二步的脫保護(hù)反應(yīng)，如果使用縮丙酮保護(hù)1,2-位和3,4-位的羥基，脫保護(hù)時可以使用三氟乙酸和少量的水在室溫下完成。

下面以實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。

實施例1：

化合物(I-1)按照以下方式合成

(1)化合物1a的合成：

1)在室溫條件下將cy3(246.5mg)加入到干燥的DMF(二甲基甲酰胺)(10ml)當(dāng)中，冷卻到0℃，用氮氣置換燒瓶內(nèi)空氣，在氮氣保護(hù)下加入TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯)(176.5mg)。

2)將反應(yīng)液在氮氣保護(hù)下室溫攪拌15分鐘，然后順序加入6-氨基-6-脫氧-1,2,3,4-二-氧-異丙基-α-D-半乳糖(142.62mg)和三乙胺(TEA)(151.8mg)，反應(yīng)液在室溫下反應(yīng)12小時。反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，二氯甲烷溶液萃取有機(jī)相，得粗產(chǎn)品使用硅膠柱色譜(二氯甲烷∶甲醇＝45∶1)對反應(yīng)生成物實施簡單純化,得到藍(lán)色固體產(chǎn)品304.7mg。

收率：83.0％

¹H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.40(t,J＝11.7Hz,1H),7.38(dd,J＝21.4,6.2Hz,4H),7.25(d,J＝7.3Hz,2H),7.13(d,J＝7.7Hz,2H),6.75(dd,J＝29.9,12.7Hz,2H),5.49(d,J＝4.3Hz,1H),4.58(d,J＝7.7Hz,1H),4.29–4.26(m,1H),4.22(d,J＝7.7Hz,1H),4.10(s,2H),3.94(s,1H),3.72(s,3H),3.61–3.54(m,1H),3.30(s,1H),2.28(s,2H),1.85(s,2H),1.72(s,14H),1.60(s,2H),1.50(s,3H),1.43(s,3H),1.33(s,3H),1.30(s,3H).

(2)化合物I-1的合成：

將化合物1a(183.59mg)在10℃下溶解于三氟乙酸(TFA)-水(9ml:1ml)溶液當(dāng)中，反應(yīng)液在10℃下攪拌0.5小時，反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，將殘余物溶解于二氯甲烷溶液(70ml)和氯化銨溶液(70ml)中，水相用二氯甲烷(2x100)反萃2次，得有機(jī)相溶劑用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，硅膠色譜法(二氯甲烷：甲醇＝10:1)純化，得紅色固體化合物(117.3mg)。

收率：71.7％(其激發(fā)和發(fā)射光譜見圖-1)

¹H NMR(600MHz,MeOD)δ8.45(t,J＝13.4Hz,1H),7.44(d,J＝7.4Hz,2H),7.35(t,J＝7.6Hz,2H),7.24(dd,J＝24.8,7.0Hz,4H),6.36(t,J＝13.2Hz,2H),5.00(s)and 4.27(d,J＝6.1Hz,1H),4.05(t,J＝7.1Hz,2H),3.90(t,J＝6.4Hz,1H),3.69–3.57(m,5H),3.39(ddd,J＝33.7,23.1,6.3Hz,2H),3.12(dd,J＝13.6,7.5Hz,1H),2.14(t,J＝7.1Hz,2H),1.80–1.72(m,2H),1.72–1.52(m,14H),1.41(d,J＝6.9Hz,2H).HRMS(ESI+):calculated for C₃₆H₄₈N₃O₆[M]⁺:618.3538；found:618.3538.

實施例2：

化合物(I-2)按照以下方式合成

(1)化合物2a的合成：

1)在室溫條件下將cy3(200.5mg)和1,2:3,4-氧-異丙叉基-α-D-呋喃半乳糖(106.0mg)加入到干燥的DCM溶液(二氯甲烷)(10ml)當(dāng)中，用氮氣置換燒瓶內(nèi)空氣。

2)反應(yīng)液中加入等當(dāng)量4-二甲氨基吡啶(DMAP)然后在氮氣保護(hù)下室溫攪拌1小時。加入N，N’-二環(huán)己基碳二亞(N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺)(100.8mg)，反應(yīng)液在室溫下反應(yīng)12小時。反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，二氯甲烷溶液萃取有機(jī)相，得粗產(chǎn)品使用硅膠柱色譜(二氯甲烷∶甲醇＝45∶1)對反應(yīng)生成物實施簡單純化,得到紅色固體產(chǎn)品133.1mg。

收率：44.5％

HRMS(ESI+):calculated for C₄₂H₅₅N₂O₇[M]⁺:699.4004；found:699.4001.

(2)化合物I-2的合成：

將化合物2a(133.1mg)在10℃下溶解于三氟乙酸-水(9ml:1ml)溶液當(dāng)中，反應(yīng)液在10℃下攪拌0.5小時，反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，將殘余物溶解于二氯甲烷溶液(70ml)和氯化銨溶液(70ml)中，水相用二氯甲烷(2x100)反萃2次，得有機(jī)相溶劑用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，硅膠色譜法(二氯甲烷：甲醇＝10:1)純化，得紅色固體化合物(88.8mg)。收率：74.9％

HRMS(ESI+):calculated for C₃₆H₄₇N₂O₇[M]⁺:619.3378；found:619.3373.

實施例3：

化合物(I-3)按照以下方式合成

(1)化合物3a的合成：

參照化合物1a的合成方法，將起始原料改成cy5最后獲得化合物3a。

收率：80.3％

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.04(d,J＝10.8Hz,2H),7.36(d,J＝5.5Hz,4H),7.22(t,J＝7.1Hz,2H),7.10(dd,J＝15.2,7.8Hz,2H),6.70(s,1H),6.20(t,J＝12.9Hz,2H),5.50(d,J＝4.4Hz,1H),4.59(d,J＝7.7Hz,1H),4.30(s,1H),4.22(d,J＝7.7Hz,1H),4.00(s,2H),3.93(d,J＝5.8Hz,1H),3.64(d,J＝14.6Hz,4H),3.28(d,J＝9.3Hz,1H),2.25(s,2H),1.81(s,2H),1.72(d,J＝12.3Hz,14H),1.51(d,J＝15.1Hz,2H),1.49(s,3H),1.45(s,3H),1.34(s,3H),1.31(s,3H).

(2)化合物I-3的合成：：

參照I-1的合成方法，最后獲得化合物I-3。

收率：68.1％(其激發(fā)和發(fā)射光譜見圖-2)

¹H NMR(600MHz,MeOD)δ8.26(t,J＝12.9Hz,2H),7.51(d,J＝7.3Hz,2H),7.43(t,J＝7.6Hz,2H),7.30(dd,J＝16.9,7.4Hz,4H),6.67(t,J＝12.3Hz,1H),6.31(d,J＝13.6Hz,2H),5.14(s)and 4.40(d,J＝5.5Hz,1H),4.12(t,J＝6.7Hz,2H),4.03(d,J＝5.6Hz,1H),3.77(dd,J＝24.8,12.3Hz,2H),3.65(s,3H),3.58–3.50(m,1H),3.46(s,1H),3.25(dd,J＝13.6,7.5Hz,1H),2.26(t,J＝7.0Hz,2H),1.89–1.82(m,2H),1.74(d,J＝10.3Hz,16H).HRMS(ESI+):calculated for C38H50N3O6[M]+:644.3694；found:644.3708.

實施例4：

化合物(I-4)按照以下方式合成

(1)化合物4a的合成：

參照化合物2a的合成方法，將起始原料改成cy5最后獲得化合物4a。

收率：42.9％

HRMS(ESI+):calculated for C₄₄H₅₇N₂O₇[M]+:725.4160；found:725.4153.

(2)化合物I-4的合成：：

參照化合物I-2的合成方法，最后獲得化合物I-4。

收率：69.1％

HRMS(ESI+):calculated for C₃₈H₄₉N₂O₇[M]+:645.3534；found:645.3531.

實施例5：

化合物(I-5)按照以下方式合成

(1)化合物5a的合成：

1)在室溫條件下將熒光素羧酸原料(A-6-5)(165.2mg)加入到干燥的DMF溶液(10ml)當(dāng)中，冷卻到0℃，用氮氣置換燒瓶內(nèi)空氣，在氮氣保護(hù)下加入N，N’-二環(huán)己基碳二亞(85.3mg)和HOBT(57.6mg)。

2)將反應(yīng)液在氮氣保護(hù)下室溫攪拌15分鐘，然后順序加入6-氨基-6-脫氧-1,2,3,4-二-氧-異丙基-α-D-半乳糖(87.5mg)，反應(yīng)液在室溫下反應(yīng)12小時。反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，二氯甲烷溶液萃取有機(jī)相，得粗產(chǎn)品使用硅膠柱色譜(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)對反應(yīng)生成物實施簡單純化,得到藍(lán)色固體產(chǎn)品164.2mg。收率：78.0％

(2)化合物I-5的合成：：

將化合物5a(164.2mg)在10℃下溶解于三氟乙酸-水(9ml:1ml)溶液當(dāng)中，反應(yīng)液在10℃下攪拌0.5小時，反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，將殘余物溶解于二氯甲烷溶液(70ml)和氯化銨溶液(70ml)中，水相用二氯甲烷(2x100)反萃2次，得有機(jī)相溶劑用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，硅膠色譜法(二氯甲烷：甲醇＝10:1)純化，得紅色固體化合物(109.8mg)。收率：75.6％(其激發(fā)和發(fā)射光譜見圖-3)

¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.45(td,J＝13.5,1.5Hz,1H),7.48–7.17(m,8H),6.37(dd,J＝

13.6,4.9Hz,2H),4.98(d,J＝2.9Hz)and 4.13(d,J＝7.6Hz,1H),4.33(m,2H),3.85(t,J＝6.8Hz)and 3.50(d,J＝3.0Hz,1H),3.62(d,J＝1.8Hz,3H),3.56(d,J＝4.1Hz,1H),3.40–3.23(m,2H),3.20–3.08(m,2H),2.63(t,J＝6.5Hz,2H),1.68(d,J＝1.1Hz,12H).HRMS(ESI+):calculated

for C₃₃H₄₂N₃O₆[M]⁺:576.3068；found:576.3068.

實施例6：

化合物(I-6)按照以下方式合成

(3)化合物6a的合成：

1)在室溫條件下將熒光素羧酸原料(A-6-5)(269.5mg)和1,2:3,4-氧-異丙叉基-α-D-呋喃半乳糖(155.62mg)加入到干燥的DCM溶液(10ml)當(dāng)中，用氮氣置換燒瓶內(nèi)空氣。

2)在氮氣保護(hù)下向反應(yīng)液中加入等當(dāng)量的4-二甲氨基吡啶于室溫攪拌1小時，然后加入N，N’-二環(huán)己基碳二亞(148.0mg)，反應(yīng)液在室溫下反應(yīng)12小時。反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，二氯甲烷溶液萃取有機(jī)相，得粗產(chǎn)品使用硅膠柱色譜(二氯甲烷∶甲醇＝45∶1)對反應(yīng)生成物實施簡單純化,得到紅色固體產(chǎn)品190.7mg。

收率：45.9％

HRMS(ESI+):calculated for C₃₉H₄₉N₂O₇[M]⁺:657.3534；found:657.3530.

(4)化合物I-6的合成：：

將化合物6a(190.7mg)在10℃下溶解于三氟乙酸-水(9ml:1ml)溶液當(dāng)中，反應(yīng)液在10℃下攪拌0.5小時，反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，將殘余物溶解于二氯甲烷溶液(70ml)和氯化銨溶液(70ml)中，水相用二氯甲烷(2x100)反萃2次，得有機(jī)相溶劑用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，硅膠色譜法(二氯甲烷：甲醇＝10:1)純化，得紅色固體化合物(122.4mg)。收率：72.6％

HRMS(ESI+):calculated for C₃₃H₄₁N₂O₇[M]⁺:577.2908；found:577.2905.

實施例7：

化合物(I-7)按照以下方式合成

(1)化合物7a的合成：

參照化合物5a的合成方法，將起始原料改成相應(yīng)的熒光素羧酸原料(A-7-7)羧酸化合物最后獲得化合物7a。

收率：73.4％

(2)化合物I-7的合成：：

參照化合物I-5的合成方法，最后獲得化合物I-7。

收率：71.6％(其激發(fā)和發(fā)射光譜見圖-4)

¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.16(m,2H),7.27(m,8H),6.54(t,J＝10.9Hz,1H),6.22(dd,J＝26.6,13.6Hz,2H),5.00(s)and 4.16(d,J＝7.6Hz,1H),4.28(d,J＝3.6Hz,2H),3.87(m,1H),3.74–3.44(m,5H),3.43–3.24(m,2H),3.15(m,1H),2.72–2.53(m,2H),1.64(s,12H).HRMS(ESI+):calculated for C35H44N3O6[M]⁺:602.3225；found:602.3225.

實施例8：

化合物(I-8)按照以下方式合成

(3)化合物8a的合成：

參照化合物6a的合成方法，將起始原料改成熒光素羧酸原料(A-7-7)最后獲得化合物8a。收率：49.8％

HRMS(ESI+):calculated for C₄₁H₅₁N₂O₇[M]⁺:683.3691；found:683.3683.

(4)化合物I-8的合成：：

參照化合物I-6的合成方法，最后獲得化合物8。

收率：70.6％

HRMS(ESI+):calculated for C₃₅H₄₃N₂O₇[M]⁺:603.3065；found:603.3060.

實驗證明：用本發(fā)明上述實施例的方法可以制備式(I)所示的X為O或NH；R₂為：(A-1)、(A-2)、(A-3)、(A-4)或(A-5)；n＝0‐4的化合物。

本發(fā)明還提供了所述熒光探針用于分析檢測和篩選半乳糖激酶抑制劑中的用途。所發(fā)明的探針可用于任何表達(dá)半乳糖激酶蛋白的細(xì)胞體系，通過使用1-100μM的本發(fā)明探針，在細(xì)胞培養(yǎng)基存在的條件下，與細(xì)胞培養(yǎng)10-120min，便能使含有半乳糖激酶的細(xì)胞產(chǎn)生熒光染色。遵循上述方法使用所發(fā)明的探針可以分析和鑒定特定的化合物是否為半乳糖激酶抑制劑，當(dāng)所鑒定的化合物為半乳糖激酶抑制劑時，所發(fā)明的探針便會在細(xì)胞內(nèi)形成游離聚集，使細(xì)胞內(nèi)的探針熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。同樣的道理，應(yīng)用本發(fā)明的熒光探針可以在細(xì)胞體系中實施半乳糖激酶抑制劑的低通量或者高通量篩選。檢測探針熒光強(qiáng)度的方法可以是熒光分光光度計，熒光酶標(biāo)儀，熒光顯微鏡以及共聚焦顯微鏡等，所使用的激發(fā)波長根據(jù)具體的探針而定最好為500-650nm，本發(fā)明探針的發(fā)射波長范圍為550-700nm。具體探針的激發(fā)和發(fā)射波長如附圖所示。

試驗例1：本發(fā)明熒光探針熒光光譜的測定實驗

將探針化合物用DMSO溶解，PBS緩沖液稀釋成50μM，用Thermo Scientific Varioskan LUX熒光酶標(biāo)儀測定探針化合物的熒光光譜，以確定本發(fā)明探針化合物的熒光激發(fā)和發(fā)射波長。

本發(fā)明所提供的探針化合物分為Cy3系列和Cy5系列，其中，Cy3系列的探針化合物I-1，I-2,I-5,I-6的激發(fā)波長為：540nm至545nm，發(fā)射波長分別為：560nm和566nm；Cy5系列的探針化合物I-3,I-4,I-7,I-8的激發(fā)波長為：635至639nm，發(fā)射波長為660和666nm。

試驗例2：本發(fā)明的熒光探針在篩選半乳糖激酶抑制劑中的應(yīng)用

細(xì)胞培養(yǎng)(紅細(xì)胞)：

1.從血庫購得過期的肝素化的人血液，2000g離心5分鐘，吸去上層血漿和白細(xì)胞層。

2.用預(yù)冷的PBS(pH 7.4)重懸，吹吸10次，2000g離心5分鐘；重復(fù)上述過程洗三遍，每次加入的體積為原來的3倍，直至上清清澈。

3.2000g離心5分鐘，預(yù)冷的PBS重懸，配制成體積分?jǐn)?shù)為5％的細(xì)胞懸液。四度保存，兩周內(nèi)使用。

抑制劑篩選：

實驗測試用已知的半乳糖激酶抑制劑β-lapachone由Sigma-Aldrich購得。抑制劑用DMSO溶解，而后用PBS稀釋到最終濃度。

紅細(xì)胞先用DMEM培養(yǎng)30min，再無糖無血清1640饑餓30min，而后將抑制劑加入紅細(xì)胞，培養(yǎng)2h，而后直接將本發(fā)明熒光探針加入其中，培養(yǎng)2h。冰冷PBS洗3遍，轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中測量熒光強(qiáng)度變化。探針化合物I-1，I-2,I-5,I-6的最終濃度為40μM，測試激發(fā)波長設(shè)為543nm，發(fā)射波長設(shè)為565nm；探針化合物I-3,I-4,I-7,I-8的最終濃度為20μM，測試激發(fā)波長設(shè)為638nm，發(fā)射波長設(shè)為665nm。

探針在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨抑制劑的濃度變化測試結(jié)果如下：

表-2：

表2中結(jié)果顯示，本發(fā)明熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著半乳糖激酶抑制劑濃度的變化而發(fā)生線性變化。根據(jù)此原理，本發(fā)明探針可以在不純化半乳糖激酶蛋白的情況下，直接在細(xì)胞體系中應(yīng)用于篩選未知的半乳糖激酶抑制劑。

探針化合物I-1，I-3，I-5，I-7在血紅細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度隨半乳糖激酶抑制劑濃度變化見圖5，圖6，圖7和圖8.

實驗證明：式(I)所示的X為O或NH；R₂為：(A-1)、(A-2)、(A-3)、(A-4)或(A-5)；n＝0‐4的化合物具有上述效果。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明,不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明,對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干簡單推演或替換,都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。