1.一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細(xì)小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铮鲆锖塑账嵝蛄腥缦滤荆?/p>
引物CDV1:AACAGATGGGTGAAACAGCA(SEQ ID NO:1),
引物CDV2:GCATAACTCCAGAGCAATGGGTAG(SEQ ID NO:2);
引物CPV1:CAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTC(SEQ ID NO:3),
引物CPV2:TTGTGTAGACGCCTCAAAAGAATAA(SEQ ID NO:4);
引物RV1:CAGGACTGGTATCATTTACTGGGTT (SEQ ID NO:5),
引物RV2:GAAGTGGATGAAATAAGAGTGAGG (SEQ ID NO:6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物,其特征在于:
所述引物CDV1和CDV2其中一條引物的5’端被生物素化;
所述引物CPV1和CPV2其中一條引物的5’端被生物素化;
所述引物RV1和RV2其中一條引物的5’端被生物素化。
3.根據(jù)利要求1所述的引物,其特征在于,所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列,所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的引物,其特征在于,所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2這3組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQ ID NO:7~9所示的tag序列,且該3組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同。
5.一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細(xì)小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?,其特征在于,該試劑盒中含有?quán)利要求1~4任一所述引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、3種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于,所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列,編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。
8.一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細(xì)小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?,其特征在于,包括如下步驟:
1)從樣品中提取病毒核酸;
2)以提取的病毒核酸為模板,用權(quán)利要求1~4任一所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;
3)將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、3種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交;
4)雜交結(jié)束后,通過(guò)Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析,確定其病原的類(lèi)型;
上述方法用于非疾病的診斷和治療。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于:步驟2)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:
5×One-step RT-PCR buffer 5μL
dNTP 1μL
引物混合液 4μL
酶 1μL
模板 2μL
ddH2O 12μL
Total 25μL;
步驟2)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄30min;95℃預(yù)變性15min;95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸20s;循環(huán)35次;72℃終延伸10min。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于:步驟3)中所述雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋?/p>
3種熒光編碼微球 20μL
鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL
擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL
總體積 100μL;45℃孵育30min。