本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：脊髓性肌萎縮(SMA)是一種常染色體隱性遺傳疾病，其是由基因突變導(dǎo)致脊髓前角細(xì)胞變性引起的神經(jīng)肌肉遺傳病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性、對稱性肢體近端和軀干肌肉無力、萎縮，患者最終死于呼吸衰竭和嚴(yán)重的肺部感染。SMA是發(fā)病率第二高的致死性常染色體隱性遺傳病，目前尚無有效的治療方法。SMA在活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率約為1/6000～1/10000，人群中的攜帶率為1/35～1/80。鑒于SMA在中國人群中具有較高的攜帶率和發(fā)病率，通過SMA攜帶者篩查進(jìn)行婚姻與生育指導(dǎo)，是阻斷該病遺傳最為有效的方式。SMA致病基因?yàn)檫\(yùn)動神經(jīng)元存存活基因(SMN)。SMN基因在全身組織中普遍表達(dá)，大部分細(xì)胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角細(xì)胞(脊髓運(yùn)動神經(jīng)元)無法耐受低水平的SMN蛋白，結(jié)果神經(jīng)元逐步死亡而患者肌肉日漸萎縮。SMN基因定位于5q13區(qū)，具有兩個高度同源的拷貝：SMN1和SMN2。SMN1基因表達(dá)完整而穩(wěn)定的SMN功能蛋白，是SMA的決定性基因，SMN1基因缺陷造成SMA表型；SMN2基是SMA的補(bǔ)償基因，只能表達(dá)少量有生物活性的SMN蛋白，SMN2基因缺失不造成SMA表型，但是SMN2拷貝數(shù)與SMA表型的輕重直接相關(guān)。已有統(tǒng)計(jì)表明，約95％的SMA患者為SMN1基因缺失型(第7和/或第8外顯子純合缺失)。因此，基于人群的SMA致病基因攜帶者篩查，主要是針對SMN1基因缺失的檢測。根據(jù)SMA致病基因的特點(diǎn)，目前的診斷策略是分析SMN1基因第7外顯子是否存在缺失及缺失數(shù)目?，F(xiàn)有的SMN基因診斷技術(shù)包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術(shù)、等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)、多重連接探針擴(kuò)增(MLPA)、高分辨溶解曲線(HRM)、變性高效液相色譜(DHPLC)和熒光實(shí)時定量PCR。PCR-RFLP、等位基因特異性擴(kuò)增和HRM技術(shù)僅適合于檢測SMN1基因的純合缺失，然而不能區(qū)分雜合缺失的SMA致病基因攜帶者與不存在缺失的正常人。MLPA技術(shù)是目前SMA實(shí)驗(yàn)室診斷的主流技術(shù)，該方法采用荷蘭MRC公司的SMAMLPA檢測試劑盒，其成本昂貴(>150元/樣本)，并且需要毛細(xì)管電泳等貴重分析儀器，耗時長，不適合用于大規(guī)模人群的篩查工作。鑒于我國提出預(yù)防出生缺陷和減少先天殘疾患兒出生等提高出生人口素質(zhì)的目標(biāo)，因此研發(fā)準(zhǔn)確可靠、簡單實(shí)用、標(biāo)準(zhǔn)化的SMN1基因檢測方法，對于開展SMA疾病診斷、SMA致病基因攜帶者篩查、分子群體流行病學(xué)調(diào)查等相關(guān)工作具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒能夠直觀、準(zhǔn)確、快速、簡便地對SMN1基因的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，從而能夠?qū)崿F(xiàn)SMA致病基因攜帶者與正常人的區(qū)分。本發(fā)明提供一種脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒，包括：引物SMN-Ex7-F，其序列如SEQIDNO.1；引物SMN-Ex7-R，其序列如SEQIDNO.2；探針SMN-Ex7-P，其序列如SEQIDNO.3。本發(fā)明的試劑盒針對性地對SMA致病基因SMN1基因的Exon7關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行檢測，從而反映SMN1基因的拷貝數(shù)；其中，引物SMN-Ex7-F和引物SMN-Ex7-R特異性擴(kuò)增SMN1和SMN2基因的Exon7，而探針SMN-Ex7-P特異性針對SMN1Exon7c.840位點(diǎn)，該P(yáng)CR引物對和Taqman探針能夠針對性地對SMN1基因進(jìn)行檢測，而不受SMN2基因的干擾。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒，還可以包括：引物SMN-In7-F，其序列如SEQIDNO.4；引物SMN-In7-R，其序列如SEQIDNO.5；探針SMN-In7-P，其序列如SEQIDNO.6。上述試劑盒還能夠針對性地對SMA致病基因SMN1基因的Intron7關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行檢測，進(jìn)一步反映SMN1基因的拷貝數(shù)；其中，引物SMN-In7-F和引物SMN-In7-R特異性擴(kuò)增SMN1和SMN2基因的Intron7，而探針SMN-In7-P特異性針對SMN1Intron7IVS7+87位點(diǎn)，該P(yáng)CR引物對和Taqman探針能夠針對性地對SMN1基因進(jìn)行檢測，而不受SMN2基因的干擾。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒，還可以包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列如SEQIDNO.7；引物RPP30-Ex1-R，其序列如SEQIDNO.8；探針RPP30-Ex1-P，其序列如SEQIDNO.9。上述試劑盒還設(shè)置用于檢測內(nèi)參基因RPP30的引物對和探針，有利于提高檢測的準(zhǔn)確性；其中，引物RPP30-Ex1-F和引物RPP30-Ex1-R特異性擴(kuò)增內(nèi)參基因RPP30Exon1，而探針RPP30-Ex1-P特異性檢測RPP30基因。本發(fā)明對上述各引物和探針的設(shè)置濃度不作嚴(yán)格限制，只要其濃度范圍不影響SMA致病基因的正常檢測即可，可以為本領(lǐng)域的常規(guī)濃度范圍，例如10-20μM。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒還可以包括對照DNA標(biāo)本，例如SMA患者、SMA攜帶者、正常人等的對照DNA標(biāo)本，其可在對待檢測者進(jìn)行SMA致病基因檢測時作為對照，從而便于根據(jù)檢測結(jié)果對待檢測者的類型進(jìn)行判定。在本發(fā)明的具體方案中，脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒還包括：非脊髓性肌萎縮癥正?；蛐蛯φ战MgDNA標(biāo)本、脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本和脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本中的至少一種；特別是，本發(fā)明的試劑盒同時包括上述三種標(biāo)本，從而能夠?qū)Υ龣z測者的類型進(jìn)行精確地判定。具體地，非脊髓性肌萎縮癥正?；蛐蛯φ战MgDNA標(biāo)本中SMN1基因Exon7和Exon8、SMN2基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為2；脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為1，SMN2基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為2；而脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為0，SMN2基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為2。對上述各對照組gDNA標(biāo)本的濃度不作嚴(yán)格限制，只要其濃度范圍不影響SMA致病基因的正常檢測即可，可以為本領(lǐng)域的常規(guī)濃度范圍，例如10-200ng/μL。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒還可以包括其它必要的試劑，例如用于熒光定量PCR的相關(guān)試劑；具體可以為2×TaqPCRMastermix，其可以包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑、穩(wěn)定劑等本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方式進(jìn)行自行配制或通過普通市售獲得。本發(fā)明還提供上述任一所述的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒在脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試上的應(yīng)用；特別是在脊髓性肌萎縮癥致病基因攜帶者檢測上的應(yīng)用。具體地，可以采用上述任一所述的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒以待檢測者基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。本發(fā)明還提供一種脊髓性肌萎縮癥致病基因攜帶者檢測方法，包括如下步驟：提取待檢測者的基因組DNA；對待檢測者基因組DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量；以待檢測者基因組DNA為模板進(jìn)行第一熒光定量PCR，得到第一熒光定量曲線；其中，第一熒光定量PCR體系包括：引物SMN-Ex7-F，其序列如SEQIDNO.1；引物SMN-Ex7-R，其序列如SEQIDNO.2；探針SMN-Ex7-P，其序列如SEQIDNO.3。在本發(fā)明中，可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法提取待檢測者的基因組DNA并對待檢測者基因組DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，例如可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的試劑盒進(jìn)行提取；提取的待檢測者基因組DNA的濃度可以為20-150ng/μL。此外，可以采用熒光定量儀對待檢測者基因組DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因攜帶者檢測方法，通過對待檢測者基因組DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量后，通過熒光定量PCR得到待檢測者的熒光定量曲線(即第一熒光定量曲線)；通過對待檢測者的熒光定量曲線與SMA患者、SMA攜帶者、正常人的熒光定量曲線進(jìn)行比對，即可直觀地判定待檢測者的類型。上述方法無需對曲線Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與轉(zhuǎn)換，檢測速度快，操作簡便，結(jié)果直觀清晰，檢測成本低，從而有利于作為臨床患者診斷和攜帶者篩查，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因攜帶者檢測方法，還包括：以非脊髓性肌萎縮癥正常基因型對照組gDNA標(biāo)本、脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本和脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本中的至少一種為模板進(jìn)行所述第一熒光定量PCR，得到相應(yīng)的第一熒光定量對照曲線；特別是，本發(fā)明可以上述三種為模板同時進(jìn)行所述第一熒光定量PCR，從而分別得到正常人的熒光定量對照曲線、SMA攜帶者的熒光定量對照曲線以及SMA患者的熒光定量對照曲線。上述方法同時對待檢測者和上述對照組進(jìn)行熒光定量PCR，從而能夠通過對待檢測者和對照組的熒光定量曲線的比對而準(zhǔn)確地獲得待檢測者的類型，有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。具體地，待檢測者的熒光定量曲線與正常人的熒光定量曲線相同或相似時，可判定該待檢測者為正常人，即不攜帶SMA致病基因；待檢測者的熒光定量曲線與SMA攜帶者的熒光定量曲線相同或相似時，可判定該待檢測者為SMA攜帶者；待檢測者的熒光定量曲線與SMA患者的熒光定量曲線相同或相似時，可判定該待檢測者為SMA患者。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因攜帶者檢測方法，還包括：以待檢測者基因組DNA和非脊髓性肌萎縮癥正?；蛐蛯φ战MgDNA標(biāo)本、脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本和脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本中的至少一種為模板進(jìn)行第二熒光定量PCR，得到第二熒光定量曲線和第二熒光定量對照曲線；其中，第二熒光定量PCR體系包括：引物SMN-In7-F，其序列如SEQIDNO.4；引物SMN-In7-R，其序列如SEQIDNO.5；探針SMN-In7-P，其序列如SEQIDNO.6。上述方法針對一個樣本結(jié)合兩個位點(diǎn)同時檢測，有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步地，所述第一熒光定量PCR體系和第二熒光定量PCR體系還包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列如SEQIDNO.7；引物RPP30-Ex1-R,其序列如SEQIDNO.8；探針RPP30-Ex1-P，其序列如SEQIDNO.9。上述方法以內(nèi)參基因RPP30作為參照，有利于確保檢測結(jié)果的一致性。本發(fā)明對第一熒光定量PCR和第二熒光定量PCR的體系和程序不作嚴(yán)格限制，不影響SMA致病基因的正常檢測即可，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的體系和程度。優(yōu)選地，第一熒光定量PCR和第二熒光定量PCR程序?yàn)椋鹤冃裕?5℃預(yù)變性2分鐘；PCR循環(huán)擴(kuò)增：95℃變性15秒，61℃退火和延伸33秒，共45個循環(huán)。在該條件下，SMN1基因和RPP30基因的PCR擴(kuò)增效率接近100％。本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒和檢測方法，在對待檢測者基因組DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量的基礎(chǔ)上，針對一個樣本兩個位點(diǎn)同時檢測，其通過與熒光變化曲線結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了SMN1基因拷貝數(shù)的直觀、準(zhǔn)確、快速檢測，進(jìn)而能夠?qū)崿F(xiàn)SMA致病基因攜帶者與正常人的區(qū)分；該方法無需對曲線Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與轉(zhuǎn)換，檢測速度快，操作簡便，結(jié)果直觀清晰，檢測成本低，有利于作為臨床患者診斷和攜帶者篩查，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用，可以作為SMA分子流行病學(xué)調(diào)查、孕前和產(chǎn)前篩查。附圖說明圖1為8個樣本的第一熒光定量PCR曲線；其中：1為RPP30基因；2為SMN1基因Exon7純合缺失型SMA患者；3為SMN1基因Exon7只有1個拷貝的SMA攜帶者；4為SMN1基因Exon7為2個拷貝的正常人；圖2為8個樣本的第二熒光定量PCR曲線；其中：5為RPP30基因；6為SMN1基因Intron7只有1個拷貝的SMA攜帶者；7為SMN1基因Intron7為2個拷貝的正常人；8為SMN1基因Intron7純合缺失型SMA患者；圖3為96個樣本的第一熒光定量PCR曲線；其中：1為RPP30基因；2為SMN1基因Exon7純合缺失型SMA患者；3為SMN1基因Exon7只有1個拷貝的SMA攜帶者；4為SMN1基因Exon7為2個拷貝的正常人；圖4為96個樣本的第二熒光定量PCR曲線；其中：5為RPP30基因；6為SMN1基因Intron7只有1個拷貝的SMA攜帶者；7為SMN1基因Intron7為2個拷貝的正常人；8為SMN1基因Intron7純合缺失型SMA患者。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒，包括：引物SMN-Ex7-F，其序列為：5'-CCGCTATCTATATATAGCTATCTATG-3'(SEQIDNO.1)；引物SMN-Ex7-R，其序列為：5'-CCTACATTAACCTTTCAACTTTT-3'(SEQIDNO.2)；探針SMN-Ex7-P，其序列為：5'-FAM-CTTACAGGGTTTCAGACAAAAT-MGB-3'(SEQIDNO.3)。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒還包括：引物SMN-In7-F，其序列為：5'–CCTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3'(SEQIDNO.4)；引物SMN-In7-R，其序列為：5'–TTGTGAAAGTATGTTTCTTCCACAT-3'(SEQIDNO.5)；探針SMN-In7-P，其序列為：5'-FAM-CCTTTCAACTTTTTAACATCT-MGB-3'(SEQIDNO.6)。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒還包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列為：5'-TTTGGACCTGCGAGCG-3'(SEQIDNO.7)；引物RPP30-Ex1-R，其序列為：5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'(SEQIDNO.8)；探針RPP30-Ex1-P，其序列為：5'-JOE-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3'(SEQIDNO.9)。其中，上述各引物和探針的濃度均為10μM。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒還包括：非脊髓性肌萎縮癥正常基因型對照組gDNA標(biāo)本(正常人標(biāo)本)、脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本(SMA攜帶者標(biāo)本)和脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本(SMA患者標(biāo)本)；其中，非脊髓性肌萎縮癥正常基因型對照組gDNA標(biāo)本中SMN1基因Exon7和Exon8、SMN2基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為2；脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為1，SMN2基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為2；而脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為0，SMN2基因Exon7和Exon8的拷貝數(shù)均為2；此外，各對照組gDNA標(biāo)本的濃度均為50ng/μL。進(jìn)一步地，本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒還包括：2×TaqPCRMastermix，其購自北京天根生化科技有限公司。實(shí)施例2脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒的應(yīng)用一、獲取待檢測者的基因組DNA從本遺傳中心樣本資源庫中所保存的基因組DNA中，選取均已經(jīng)過MLPA方法檢驗(yàn)的樣本1050份(其中包括50例純合缺失型SMA患者、500例雜合缺失型SMA攜帶者和500例正常人)。盲法分析：采用NanoDropND-2000測定上述基因組DNA濃度，取濃度在20-150ng/μL，A260/A280在1.8-1.9之間的樣本作為待檢測者的基因組DNA進(jìn)行盲法編號，備用；對于不符合上述要求的標(biāo)本，不納入本次分析檢測。二、對待檢測者基因組DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量1、配制工作液(Qubitworkingsolution)DNA結(jié)合染料HS試劑(HSReagent)用HS緩沖液(HSBuffer)按照1：200稀釋，即得到1×工作液(1×Qubitworkingsolution)。2、標(biāo)準(zhǔn)品的制備分別取標(biāo)準(zhǔn)品1(Quantstandard1，0ng/μL)和標(biāo)準(zhǔn)品2(standard2，10ng/μL)各10μL，與190μL上述1×工作液(1×Qubitworkingsolution)轉(zhuǎn)入Qubit專用的測量管，作為標(biāo)準(zhǔn)品。3、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線利用Qubit@2.0熒光計(jì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；具體地，打開Qubit@2.0熒光計(jì)電源后，依次點(diǎn)擊“DNA”，“dsDNA”，“highsensitivity”，“Read”，“Standard”，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、準(zhǔn)確定量取2μL各待檢測者基因組DNA與198μL1×工作液(1×Qubitworkingsolution)轉(zhuǎn)入Qubit專用的測量管中混合；隨后室溫避光孵育2min，使DNA與染料充分結(jié)合，然后置于Qubit@2.0熒光計(jì)中進(jìn)行熒光檢測；具體地，選擇程序：“dsDNA”，“highsensitivity”，“Read”，“CalculateStolkConc”，選擇加入的DNA體積，自動得到各檢測者基因組DNA的濃度。5、稀釋采用LowTE緩沖液稀釋各待檢測者基因組DNA至5ng/μL，備用。三、第一熒光定量PCR(SMN1基因Exon7檢測)以上述5ng/μL的各檢測者基因組DNA為模板，采用實(shí)施例1的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒，按照表1的熒光定量PCR反應(yīng)體系制備反應(yīng)體系；同時，以非脊髓性肌萎縮癥正?；蛐蛯φ战MgDNA標(biāo)本、脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本和脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本作為對照。表1第一熒光定量PCR體系組份體積DNA(5ng/μL)6.02×TaqPCRMastermix10引物SMN-Ex7-F(10μM)0.2引物SMN-Ex7-R(10μM)0.4探針SMN-Ex7-P(10μM)0.4引物RPP30-Ex1-F(10uM)1引物RPP30-Ex1-R(10μM)1探針RPP30-Ex1-P(10μM)0.4H2O0.2ROX(50×)0.4總體積20采用定量PCR儀(ABIHT7900，lifetechnologies公司)進(jìn)行第一熒光定量PCR；其中，第一熒光定量PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95℃2分鐘；PCR循環(huán)擴(kuò)增：95℃變性15秒，61℃退火和延伸33秒，共45個循環(huán)；在61℃延伸時采集FAM和JOE通道熒光信號，分別得到各待檢測者的第一熒光定量曲線、正常人的第一熒光定量對照曲線、SMA攜帶者的第一熒光定量對照曲線以及SMA患者的第一熒光定量對照曲線；其中，SMN1基因和RPP30基因的PCR擴(kuò)增效率接近100％。將各待檢測者的第一熒光定量曲線分別與正常人的第一熒光定量對照曲線、SMA攜帶者的第一熒光定量對照曲線以及SMA患者的第一熒光定量對照曲線進(jìn)行比對，從而獲知各待檢測者類型，即SMA患者、SMA攜帶者或正常人。圖1和圖4分別為8個樣本和96個樣本的第一熒光定量PCR曲線；其中：1為RPP30基因；2為SMN1基因Exon7純合缺失型SMA患者；3為SMN1基因Exon7只有1個拷貝的SMA攜帶者；4為SMN1基因Exon7為2個拷貝的正常人。四、第二熒光定量PCR(SMN1基因Intron7檢測)以上述5ng/μL的各檢測者基因組DNA為模板，采用實(shí)施例1的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒，按照表2的熒光定量PCR反應(yīng)體系制備反應(yīng)體系；同時，以非脊髓性肌萎縮癥正?；蛐蛯φ战MgDNA標(biāo)本、脊髓性肌萎縮癥攜帶者基因型對照組gDNA標(biāo)本和脊髓性肌萎縮癥患者基因型對照組gDNA標(biāo)本作為對照；其中，SMN1基因和RPP30基因的PCR擴(kuò)增效率接近100％。表2第二熒光定量PCR體系采用定量PCR儀(ABIHT7900，lifetechnologies公司)進(jìn)行第二熒光定量PCR；其中，第二熒光定量PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95℃2分鐘；PCR循環(huán)擴(kuò)增：95℃變性15秒，61℃退火和延伸33秒，共45個循環(huán)；在61℃延伸時采集FAM和JOE通道熒光信號，分別得到各待檢測者的第二熒光定量曲線、正常人的第二熒光定量對照曲線、SMA攜帶者的第二熒光定量對照曲線以及SMA患者的第二熒光定量對照曲線。將各待檢測者的第二熒光定量曲線分別與正常人的第二熒光定量對照曲線、SMA攜帶者的第二熒光定量對照曲線以及SMA患者的第二熒光定量對照曲線進(jìn)行比對，從而獲知各待檢測者類型。圖2和圖4分別為8個樣本和96個樣本的第二熒光定量PCR曲線；其中：5為RPP30基因；6為SMN1基因Intron7只有1個拷貝的SMA攜帶者；7為SMN1基因Intron7為2個拷貝的正常人；8為SMN1基因Intron7純合缺失型SMA患者。上述1050份樣本經(jīng)本發(fā)明上述方法檢測后，檢測結(jié)果見表3。對比例采用現(xiàn)有權(quán)威的SMA臨床檢測試劑盒作為比較例。對比試劑盒為：SALSAMLPAP060probemixSMA，荷蘭MRC公司，Cat：P060-100R。采用MLPA(多重連接依賴探針擴(kuò)增)方法進(jìn)行檢測，具體為：1、DNA變性取5μL實(shí)施例2的各待檢測者基因組DNA(50ng)，98℃加熱5分鐘。2、雜交加入1.5μLMLPABuffer和1.5μLSALSA探針的混合物，95℃加熱1分鐘，然后于60℃雜交16-18個小時。3、連接加入3μLbufferA、3μLbufferB、25μL水和1μL連接酶于54℃孵育20分鐘，然后于98℃加熱5分鐘使連接酶失活。4、PCR擴(kuò)增加入7.5μL水、2μLSALSA引物混合物，0.5μLDNA聚合酶，然后開始PCR擴(kuò)增；程度為：95℃，30秒；60℃，30秒共35個循環(huán)；之后72℃延伸20分鐘。5.毛細(xì)管電泳加入甲酰胺變性，經(jīng)ABI3130XL分析儀檢測，再經(jīng)軟件Coffalyser分析結(jié)果，檢測結(jié)果見表3。表3兩種檢測方法的檢測結(jié)果由表3結(jié)果可知：采用本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒進(jìn)行檢測，與MLPA檢測方法相比，其準(zhǔn)確性達(dá)到100％，假陽性率為0％，特異性達(dá)到100％，檢測結(jié)果與MLPA檢測方法所獲得的結(jié)果完全一致。本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒及檢測方法，能夠快速、簡便地檢測SMN1基因的拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)SMA患者、攜帶者及正常人的快速分子診斷，其重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，能夠滿足當(dāng)前大規(guī)模人群的SMA攜帶者篩查和常規(guī)分子診斷要求。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。序列表<110>鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院<120>脊髓性肌萎縮癥致病基因檢測試劑盒及其應(yīng)用<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>1ccgctatctatatatagctatctatg26<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2cctacattaacctttcaactttt23<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3cttacagggtttcagacaaaat22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4cctattttccttacagggtttc22<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5ttgtgaaagtatgtttcttccacat25<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6cctttcaactttttaacatct21<210>7<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>7tttggacctgcgagcg16<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gagcggctgtctccacaagt20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9ttctgacctgaaggctctgcgcg23當(dāng)前第1頁1 2 3