本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)試劑盒、快速定性檢測(cè)方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：益生菌(Probiotics)是一類能夠促進(jìn)宿主腸內(nèi)微生物菌群的生態(tài)平衡，對(duì)宿主健康和/或生理功能產(chǎn)生有益作用的活性微生物。其作用主要是經(jīng)攝入宿主體內(nèi)后，能改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道中有益菌的增殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)，提高機(jī)體特異性或非特異性免疫力，從而有利于抵御各種疾病的發(fā)生。近年來，作為一類對(duì)人類有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)與保健作用的微生物，益生菌越來越受到人們廣泛關(guān)注。目前，市場(chǎng)上很多品牌紛紛推出益生菌嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品，所添加的益生菌包括乳桿菌、嗜酸乳桿菌，出現(xiàn)了不同益生菌組合配方，宣稱具有不同的功效。商家宣傳通過添加益生菌，能對(duì)嬰幼兒腸道功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)嬰幼兒免疫力發(fā)展，成為一個(gè)新的賣點(diǎn)。而有部分配方乳粉并未對(duì)添加菌種進(jìn)行明確標(biāo)識(shí)，使消費(fèi)者處于陷入模糊消費(fèi)的境地。WHO/FAO聯(lián)合出臺(tái)的《食品中益生菌評(píng)價(jià)指南》中定義，添加在食品中的益生菌必須具備三大條件：第一，必須攝入足夠的數(shù)量；第二，必須對(duì)人或動(dòng)物健康有益；第三，必須是活的微生物。明確指出益生菌功效具有菌株特異性；要求食品包裝上要注明使用菌的菌株名稱、儲(chǔ)存條件及貨架期內(nèi)活性菌的數(shù)量。為了規(guī)范益生菌在食品中的使用，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委相繼頒布了相應(yīng)的法律法規(guī)。該規(guī)定包括使用菌種、標(biāo)簽標(biāo)識(shí)、活菌數(shù)量的相關(guān)規(guī)定。關(guān)于使用菌種，2010年，衛(wèi)計(jì)委發(fā)布了衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)〔2010〕65號(hào)《可用于食品的菌種名單》，2011年第25號(hào)公告制定了《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》。2016年第6號(hào)公告將發(fā)酵乳桿菌CECT5716列入《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》。目前，我國(guó)衛(wèi)計(jì)委允許在嬰幼兒配方乳粉中允許使用的乳桿菌菌株為嗜酸乳桿菌NCFM、鼠李糖乳桿菌HN001、發(fā)酵乳桿菌CECT5716。目前中國(guó)市場(chǎng)流通領(lǐng)域產(chǎn)品主要以添加嗜酸乳桿菌NCFM為主。隨著消費(fèi)者對(duì)新興產(chǎn)品追求的熱度提升和維權(quán)意識(shí)的提高，益生菌嬰幼兒配方乳粉的安全監(jiān)管需求將會(huì)凸顯，急需開發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)該類產(chǎn)品中菌種的添加種類進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步提升嬰幼兒配方乳粉的質(zhì)量安全監(jiān)管能力?，F(xiàn)有乳酸菌檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)有《GB4789.35-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》，該方法僅能對(duì)乳桿菌屬進(jìn)行常見種的生化分型，存在鑒定操作復(fù)雜，結(jié)果不好判讀的缺陷，不能滿足相關(guān)領(lǐng)域的需要，也無法滿足按照衛(wèi)生部要求添加特定菌株的監(jiān)管需求。為了能夠確保所添加的乳酸菌為符合我國(guó)國(guó)家規(guī)定嬰幼兒配方食品中允許使用的菌種，有必要建立一種快速、簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的乳粉中嗜酸乳桿菌的快速定性檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)試劑盒，以使嗜酸乳桿菌成分的檢測(cè)快速、準(zhǔn)確；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)方法，以解決現(xiàn)有的用于檢測(cè)嗜酸乳桿菌成分的方法復(fù)雜、結(jié)果不好判讀的缺陷；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)盒的應(yīng)用，用于乳粉中嗜酸乳桿菌成分的檢測(cè)和鑒定。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：作為本發(fā)明的第一個(gè)方面，一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)試劑盒，包括用于檢測(cè)乳粉中嗜酸乳桿菌成分的特異性擴(kuò)增引物對(duì)，所述特異性擴(kuò)增引物對(duì)的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。作為本發(fā)明的第二個(gè)方面，一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：A、待測(cè)樣品預(yù)處理；B、提取待測(cè)樣品總DNA；C、以待測(cè)樣品總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，PCR擴(kuò)增體系中包括如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的引物對(duì)序列；D、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；E、分析待測(cè)樣品中是否含有嗜酸乳桿菌：如果待測(cè)樣品DNA組在746bp附近出現(xiàn)特異性條帶，則待測(cè)樣品中含有嗜酸乳桿菌，反之待測(cè)樣品中不含有嗜酸乳桿菌。根據(jù)本發(fā)明，步驟C的PCR反應(yīng)的條件如下：PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，4min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，40s，共35個(gè)循環(huán)；72℃，5min；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×ColorlessReactionBuffer12.5μL；1μL5μmol·L-1如SEQIDNO.7所示的引物和1μL5μmol·L-1如SEQIDNO.8所示的引物，樣品DNA2μL，ddH2O8.5μL，總體積25μL。根據(jù)本發(fā)明，所述的待測(cè)樣品為添加有嗜酸乳桿菌的嬰幼兒配方乳粉。根據(jù)本發(fā)明，步驟A所述的待測(cè)樣品預(yù)處理的方法包括：稱取均質(zhì)混勻的待測(cè)樣品25g，置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，制成1:10樣品勻液；或置于225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min制成1:10的樣品勻液；接著選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，于MRS培養(yǎng)基瓊脂平板(36℃±1℃)需氧培養(yǎng)48h±2h后，挑2個(gè)或2個(gè)以上單菌落轉(zhuǎn)劃MRS平板擴(kuò)增，獲得供DNA提取的單克隆菌株菌苔。根據(jù)本發(fā)明，步驟B的待測(cè)樣品總DNA的提取方法為：從2個(gè)或2個(gè)以上步驟A的平板上挑取單克隆菌株菌苔，加入200μL50mg/mL溶菌酶溶液，37℃保溫2h；接著，依次加入10μL20mg/mL蛋白酶K和400μLSDS裂解液[含12.4g/LSDS，0.5mol/LNacl，0.1mol/LTris-HCl，0.05mol/LNa2EDTA，PH8.0]，56℃中水浴2h，而后用酚/氯仿法抽提DNA，測(cè)定DNA濃度和純度，獲得待測(cè)細(xì)菌基因組DNA。作為本發(fā)明的第三個(gè)方面，一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)試劑盒在制備嗜酸乳桿菌的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)乳粉中嗜酸乳桿菌成分中的應(yīng)用。一種乳粉中嗜酸乳桿菌成分的特異性引物對(duì)，所述特異性引物對(duì)的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明所采用的嬰幼兒配方乳粉樣本的預(yù)處理方法和DNA提取方法(包括添加溶菌酶、蛋白酶K等充分對(duì)細(xì)菌破壁)，使得在益生菌的提取過程中，嗜酸乳桿菌基因組DNA可以充分釋放，為一種特異的適用于嬰幼兒配方乳粉中嗜酸乳桿菌提取的方法，為本發(fā)明首創(chuàng)。(2)本發(fā)明對(duì)目前已經(jīng)報(bào)道的嗜酸乳桿菌及食品中可能添加的如鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、雙歧桿菌、以及其他乳桿菌如干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌等其他乳桿菌的基因組序列進(jìn)行了比對(duì)分析，選擇了嗜酸乳桿菌特異的SPIDR區(qū)基因片段作為目的基因，設(shè)計(jì)了特異性的引物，以該引物對(duì)嬰幼兒配方乳粉中的嗜酸乳桿菌進(jìn)行定性檢測(cè)，該引物具有菌種特異性。(3)本發(fā)明可以在不進(jìn)行益生菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中嗜酸乳桿菌，整個(gè)過程對(duì)嬰幼兒配方乳粉中嗜酸乳桿菌的檢測(cè)程序簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、準(zhǔn)確性好，靈敏度高，重復(fù)性好。附圖說明圖1為ITS-1引物對(duì)擴(kuò)增各種乳桿菌圖。圖2為ITS-2引物對(duì)擴(kuò)增各種乳桿菌圖。圖3為S1引物對(duì)擴(kuò)增各種乳桿菌圖。圖4為S3引物對(duì)擴(kuò)增各種乳桿菌圖。圖5為S2引物對(duì)擴(kuò)增各種乳桿菌圖。圖6為嗜酸乳桿菌DNA靈敏度檢測(cè)擴(kuò)增圖。圖7為嬰幼兒配方乳粉樣品中嗜酸乳桿菌的鑒別檢測(cè)電泳圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件進(jìn)行。實(shí)施例1、乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組總DNA的提取實(shí)施例1所采用的菌株如表1所示。表1乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株將上述19種乳桿菌分別按如下方法進(jìn)行提取基因組總DNA：從乳桿菌單克隆平板上挑取菌苔，加入200μL溶菌酶溶液(50mg/mL)，渦旋混勻后，放置于37℃保溫2h，溶解菌體。接著，依次加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)和400μLSDS裂解液[含12.4g/LSDS，0.5mol/LNacl，0.1mol/LTris-HCl，0.05mol/LNa2EDTA，PH8.0]，渦旋混勻后于56℃中水浴2h。接著，加入600μL的25：24：1的Tris飽和酚/三氯甲烷/異戊醇，搖勻后13000rpm離心10min。吸取上清液轉(zhuǎn)移于另一新的離心管中，加入與上清等體積的三氯甲烷/異戊醇(24：1)，搖勻后13000rpm離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)移于另一新的離心管中，加入與上清液2倍體積的無水乙醇，混勻后靜止一會(huì)，13000rpm離心2min，棄去上清液，加入1ml70％的乙醇溶液清洗沉淀。將沉淀在室溫下放置，自然風(fēng)干，待風(fēng)干后加入100μL的TE溶液，溶解沉淀。待沉淀完全溶解后，渦旋離心，用核酸蛋白儀測(cè)定DNA濃度：取一定量DNA加雙蒸水稀釋，用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA在OD260nm和OD280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按式(1)計(jì)算。c＝A×N×50/1000(1)式中：c——DNA濃度，單位為微克/微升(μg/uL)；A——A260的值；N——核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)A260/A280比值介于1.6-2.0之間時(shí)，符合PCR檢測(cè)要求，提取獲得DNA置于-20℃長(zhǎng)期保存。結(jié)果：獲得的乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組總DNA濃度介于50-100ng/μL。實(shí)施例2、待測(cè)樣品中嗜酸乳桿菌的分離和總DNA提取取市售含嗜酸乳桿菌嬰幼兒配方乳粉樣品，以無菌操作稱取25g樣品，置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，制成1:10樣品勻液；或置于225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min制成1:10的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液)，振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)待檢樣品嗜酸乳桿菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取0.1mL樣品勻液于MRS培養(yǎng)基瓊脂平板，使用滅菌L形棒進(jìn)行表面涂布，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平板。36℃±1℃，需氧培養(yǎng)48h±2h后，挑2個(gè)或2個(gè)以上單菌落轉(zhuǎn)劃MRS平板擴(kuò)增。菌株初步鑒定：按GB/T4789.35的規(guī)定操作。獲得樣本分離單克隆菌株的菌苔后，按實(shí)施例1的方法提取總DNA。結(jié)果：獲得的嬰幼兒配方乳粉樣品中總DNA濃度介于50-100ng/μL。實(shí)施例3、嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA模板的驗(yàn)證(1)嗜酸乳桿菌候選引物特異性分析和選擇設(shè)置樣品管、陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管、空白對(duì)照管，分別加入待測(cè)樣品總DNA、嗜酸乳桿菌基因組總DNA、植物DNA(大豆基因組DNA，根據(jù)CTAB法抽提獲得)、無DNA的蒸餾水為模板各2μL；各管加入特異擴(kuò)增引物上下游5μmol·L-1各1μL和PCR試劑，無菌水補(bǔ)足體積；所述的PCR試劑為：2×ColorlessReactionBuffer12.5μL，(含400μMdATP,400μMdGTP,400μMdCTP,400μMdTTP,3mMMgCl2和DNAPolymerase，pH8.5)；引物SEQIDNO.7(5μmol·L-1)1μL、SEQIDNO.8(5μmol·L-1)1μL，樣品DNA2μL，ddH2O8.5μL，總體積25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，4min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，40s，共35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。電泳程序：用1.5％瓊脂糖、9V/cm電壓、回流冷卻電泳槽凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用美國(guó)Biorad公司凝膠成像儀成像。本實(shí)施例共設(shè)計(jì)了5對(duì)嗜酸乳桿菌特異性擴(kuò)增引物，其中ITS-1，ITS-2針對(duì)嗜酸乳桿菌16S-23SrRNA間區(qū)序列設(shè)計(jì)，S1，S2，S3針對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM中特異性SPIDR區(qū)域設(shè)計(jì)，如下所示：該驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在各個(gè)對(duì)照擴(kuò)增正常情況下為：陰性對(duì)照管無擴(kuò)增條帶；樣品管擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度的特異條帶，可確認(rèn)為嗜酸乳桿菌。如出現(xiàn)以下情況：陽性對(duì)照管沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而陰性對(duì)照管、空白對(duì)照管出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，則應(yīng)重新進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)如圖1和人圖2所示，ITS-1、ITS-2引物對(duì)擴(kuò)增出現(xiàn)較多的非特異條帶；對(duì)于鼠李糖乳桿菌有非特異擴(kuò)增；(2)如圖3和圖4所示，S1、S3引物對(duì)擴(kuò)增除了主帶外，還有另一條非特異條帶；(3)如圖5所示，S2引物對(duì)擴(kuò)增特異性最佳，所有嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和商業(yè)菌株均擴(kuò)增出746bp條帶。其中，陽性對(duì)照管擴(kuò)增電泳圖見圖5中1，2，9，12，13，14泳道。其中，圖1-圖2的各泳道說明如表2所示，圖3、圖5的各泳道說明如表3所示，圖4的各泳道說明如表4所示。表2圖1-圖2的各泳道說明表3圖3，圖5的各泳道說明表4圖4的各泳道說明實(shí)驗(yàn)結(jié)論：ITS-1、ITS-2引物對(duì)擴(kuò)增出現(xiàn)較多的非特異條帶，對(duì)于鼠李糖乳桿菌有非特異擴(kuò)增；S1、S3引物對(duì)擴(kuò)增除了主帶外，還有另一條非特異條帶。表明ITS-1、ITS-2、S1、S3引物對(duì)的特異性不強(qiáng)。S2引物對(duì)擴(kuò)增各種乳桿菌能夠精確地檢測(cè)和鑒定嗜酸乳桿菌成分，條帶單一，擴(kuò)增效率高，特異性強(qiáng)。(2)靈敏度實(shí)驗(yàn)按如下方式設(shè)置反應(yīng)管以及加入模板：反應(yīng)管1-5(泳道1-5)：1.6ng/ul，160pg/ul，16pg/ul，1.6pg/ul，0.16pg/ul，加入實(shí)施例1的嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA模板2ul。反應(yīng)管6(泳道6)：空白對(duì)照管，加入蒸餾水2ul。所有反應(yīng)管同樣加入PCR試劑、PCR反應(yīng)程序和電泳程序同實(shí)施例3(1)所示。結(jié)果：泳道1-5均擴(kuò)增出清晰條帶，其中第5泳道0.32pg嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株也能擴(kuò)增出清晰的746bp條帶。本方法靈敏度達(dá)到0.32pg嗜酸乳桿菌DNA。陽性擴(kuò)增電泳圖見圖6中第1-5泳道。其中，圖6的各泳道說明如表5所示。表5圖6的各泳道說明泳道菌種(ATCC4356)DNA濃度(pg/ul)1嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA16002嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA1603嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA164嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA1.65嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA0.166蒸餾水0實(shí)施例4、嬰幼兒配方乳粉樣品中嗜酸乳桿菌的鑒別檢測(cè)按如下方式設(shè)置反應(yīng)管以及加入模板：反應(yīng)管1-4(泳道1-4)：陽性對(duì)照管，加入實(shí)施例1的嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA模板2ul。反應(yīng)管5(泳道5)：空白對(duì)照管，加入蒸餾水2ul。反應(yīng)管6-7(泳道6-7)：樣品中分離的鼠李糖乳桿菌(標(biāo)簽標(biāo)識(shí)及其他方法鑒定)，DNA模板2ul。按GB4789.35-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)方法分離。反應(yīng)管8-11(泳道8-11)：樣品中分離的嗜酸乳桿菌(標(biāo)簽標(biāo)識(shí)及其他方法鑒定)，DNA模板2ul。按實(shí)施例2方法分離。所有反應(yīng)管同樣加入PCR試劑，同實(shí)施例3。PCR反應(yīng)程序和電泳程序同實(shí)施例3。結(jié)果：所有嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣品菌株均擴(kuò)增出746bp條帶。即分別為泳道1-4：嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；泳道8-11：樣品中分離的嗜酸乳桿菌。陽性擴(kuò)增電泳圖見圖7中泳道1-4和泳道8-11。其中，圖7的各泳道說明如表6所示。表6圖7的各泳道說明泳道菌種(菌株號(hào))1嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA(AS1.2686GIM1.208)2嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA(ATCC4356CICC6081)3嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA(NCFM)4嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA(La-14)5蒸餾水6樣品中分離的鼠李糖乳桿菌DNA7樣品中分離的鼠李糖乳桿菌DNA8樣品中分離的嗜酸乳桿菌DNA9樣品中分離的嗜酸乳桿菌DNA10樣品中分離的嗜酸乳桿菌DNA11樣品中分離的嗜酸乳桿菌DNA實(shí)施例5、S2引物對(duì)的設(shè)計(jì)過程從GenBank獲得嗜酸乳桿菌的SPIDR區(qū)序列，利用ClustalW軟件對(duì)不同種乳桿菌的基因組進(jìn)行比較確認(rèn)該區(qū)域的特異性，然后再用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)具體的嗜酸乳桿菌特異性鑒定引物，將引物序列在NCBI網(wǎng)站blast比對(duì)，結(jié)果顯示，該對(duì)引物對(duì)嗜酸乳桿菌種有擴(kuò)增特異性，結(jié)合具體序列分析對(duì)嗜酸乳桿菌種有特定區(qū)分鑒定作用。所述引物可由人工設(shè)計(jì)合成。獲得的引物對(duì)的序列如下：S2F:5'-TGTCTGCCGCCCTTGTAGT-3'(SEQIDNO：7)S2R：5'-CACCTAGCGCAAGTCAACC-3'(SEQIDNO：8)將上述引物對(duì)用于擴(kuò)增嗜酸乳桿菌基因組DNA，可獲得位于嗜酸乳桿菌Spacersintersperseddirectrepeat(SPIDR)的746bp的擴(kuò)增片斷，所述擴(kuò)增后的序列如下：TGTCTGCCGCCCTTGTAGTCTTTATACATGGCAGTTCTGAAAGTAACTTTGCCCGCATCAAAAGCAACTAAGATATTAGTTGGATCTACTTGTTTAAGAATGGCATCCAACATGTTTTTAAAGGTAAAAATCGCATTAGTGTGCAACCCATCTGGACTAGTAAAGCGATCAAGTTGCCGATACAAAGCATAAAAGGCACGAAAAGCAACTGAATTTCCATCTATTAGAAGTAATTTTTTATCTGCCATTTTATTCCCCCTTATTTATTAATTGATCTATGTTTACTTATCTATTTTACCAGTTTACGGTACACTATTTCAGCATGTTGTTTTTGGAAAAGAAAAAAGCCCTGATTAGGGACTTTTTCTTGTGATCTTTCCTTCACTGCGTTAATGTAGCTCCACTTTTTTGGAGAAAATCTTGCCCAATTATTTTAAAAATATTGTGCTTCAGGGTTACCTCCACTTTCATAGAAAAAATAAAAGGCTCTAAAAGCTACAGAGTTACCATCGAGGATCACCTCCACTTTCGTGGAGAAAATTGGAATCTCATCGTAAGAAATAAGTCGCATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCCTTTTCCTAGGATCTTCATAAGCTTCTCGCCAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATATCGTAGTCAATCTCGTACTTAAAACCACCCTGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCCAGGTTGACTTGCGCTAGGTG(SEQIDNO：11)本發(fā)明提供的利用位點(diǎn)特異性PCR準(zhǔn)確鑒別嗜酸乳桿菌的方法，當(dāng)退火溫度在66℃時(shí)，只有嗜酸乳桿菌能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，不是嗜酸乳桿菌均為陰性，重復(fù)檢測(cè)得到相同結(jié)果。該鑒別方法與傳統(tǒng)的鑒別方法比較，具有更好的特異性和重現(xiàn)性，能有效的將嗜酸乳桿菌與其它乳桿菌鑒別開來。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)的乳粉中嗜酸乳桿菌成分的五組特異性引物對(duì)中，其中S2組的特異性引物對(duì)不僅特異性好，而且靈敏度高，為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)乳粉中是否含有嗜酸乳桿菌成分提供了一種很好的方法，在嬰幼兒配方乳粉的檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景，而且，所述特異性引物對(duì)可采用本領(lǐng)域中已知的方法，進(jìn)一步制成檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒除了所述特異性引物對(duì)，還可以包括標(biāo)準(zhǔn)參照物，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。SEQUENCELISTING<110>上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院<120>嗜酸乳桿菌成分的快速定性檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用<130>161048<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1aaggcagggcagatgactgg20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2cgtccttcatcggctgttag20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3gctagtaatcgcggatcagcac22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4cattcggacatctccggatcac22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5caggttgacttgcgctaggtg21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6gagagcaatttcaagcacgatt22<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>7tgtctgccgcccttgtagt19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8cacctagcgcaagtcaacc19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9cttctgtctgccgcccttgt20<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>10gggtggcaatatcttcctt19<210>11<211>746<212>DNA<213>人工序列<400>11tgtctgccgcccttgtagtctttatacatggcagttctgaaagtaactttgcccgcatca60aaagcaactaagatattagttggatctacttgtttaagaatggcatccaacatgttttta120aaggtaaaaatcgcattagtgtgcaacccatctggactagtaaagcgatcaagttgccga180tacaaagcataaaaggcacgaaaagcaactgaatttccatctattagaagtaatttttta240tctgccattttattcccccttatttattaattgatctatgtttacttatctattttacca300gtttacggtacactatttcagcatgttgtttttggaaaagaaaaaagccctgattaggga360ctttttcttgtgatctttccttcactgcgttaatgtagctccacttttttggagaaaatc420ttgcccaattattttaaaaatattgtgcttcagggttacctccactttcatagaaaaaat480aaaaggctctaaaagctacagagttaccatcgaggatcacctccactttcgtggagaaaa540ttggaatctcatcgtaagaaataagtcgcatataggatcacctccacatacgtggagaaa600atccttttcctaggatcttcataagcttctcgccaggatcacctccacatacgtggagaa660aatatcgtagtcaatctcgtacttaaaaccaccctgggatcacctccacatacgtggaga720aaatccaggttgacttgcgctaggtg746當(dāng)前第1頁1 2 3