本發(fā)明涉及電生理學(xué)、分子生物學(xué)和植物遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種鑒定棉花苗期耐鹽性的方法。

背景技術(shù)：

鹽堿地及次生鹽堿地已成為世界性問題，是限制作物生長及產(chǎn)量的重要因素。我國是世界鹽堿地大國之一，鹽漬化土壤面積約占我國現(xiàn)有耕地的1/4，并且面積不斷擴(kuò)大，已嚴(yán)重威脅著我國的糧食安全和生態(tài)環(huán)境，因此準(zhǔn)確了解植物對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)(薩如拉等，2014)。棉花是耐鹽性較強(qiáng)的作物之一，它以其較好的耐鹽性逐漸成為鹽堿地一種新的優(yōu)勢作物。目前，我國已成為世界上鹽堿地植棉規(guī)模最大的國家，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國植棉區(qū)內(nèi)鹽堿地約有1.7×10⁸hm²，其中2.7×10⁶hm²先后開發(fā)植棉(劉雅輝等，2014)，因此提高和改良棉花品種的抗鹽堿能力已經(jīng)成為棉花育種中重點(diǎn)目標(biāo)，而建立棉花耐鹽簡便的鑒定方法對(duì)于耐鹽性育種顯得尤為重要。而從豐富的棉花品種資源中篩選鑒定適合在鹽堿地開發(fā)的耐鹽品種顯得尤為重要，建立簡便快速的耐鹽性鑒定方法則是棉花耐鹽品種選擇和育種研究的基礎(chǔ)。耐鹽性的鑒定評(píng)價(jià)方法很多(劉國強(qiáng)等，1993；孫小芳等，2001；張國偉等，2011；王俊娟等，2011)，如發(fā)芽期篩選法、苗期鑒定法、營養(yǎng)液篩選法、大田鑒定法等；但大多耐鹽性鑒定方法復(fù)雜，測定周期長，且實(shí)際利用過程中由于處理?xiàng)l件、評(píng)價(jià)指標(biāo)和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的差異，往往導(dǎo)致同一材料耐性級(jí)別不同，限制了在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用(張鵬等，2013；姜靜涵等，2013；彭振等，2014；劉學(xué)等，2015)。因此，建立一種操作簡單、指標(biāo)明確的鑒定方法對(duì)于我國棉花種質(zhì)資源的快速篩選具有重要意義。

鹽分協(xié)迫對(duì)植物的傷害主要是通過離子脅迫，使細(xì)胞質(zhì)膜損傷，選擇透性破壞，近年來關(guān)于鹽脅迫下離子的吸收與積累的研究越來越受到重視。一些研究認(rèn)為，許多植物能夠忍耐土壤中高濃度的鹽分，主要和植物自身在鹽漬環(huán)境中維持細(xì)胞質(zhì)中較低的Na⁺含量有關(guān)(Haq et al.2002；Takahashi et al.2007)；在高鹽條件下，促進(jìn)Na⁺外排是減低植物細(xì)胞質(zhì)中Na⁺含量的重要策略(Chinnusamy et al，2005)。Na⁺的外排主要依靠位于質(zhì)膜上的Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)來完成(Zhu，2003)，SOS1把細(xì)胞內(nèi)的Na⁺分別泵到胞外，從而降低細(xì)胞質(zhì)中的Na⁺濃度，進(jìn)而減少Na⁺對(duì)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器的毒害(Blumwald，2000；He et al，2015)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鑒定棉花苗期耐鹽性的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的鑒定棉花苗期耐鹽性的方法，利用非損傷微測技術(shù)測定鹽脅迫下棉花幼苗胚軸和葉肉組織中Na⁺離子流，同時(shí)結(jié)合鹽脅迫下棉花幼苗胚軸和葉肉組織中GhSOS1基因的表達(dá)情況，從而區(qū)分耐鹽性差異的棉花種質(zhì)材料。

本發(fā)明方法中，棉花幼苗的耐鹽性與胚軸中Na⁺離子流呈負(fù)相關(guān)(偏相關(guān)系數(shù)為-0.77)，與葉肉組織中Na⁺離子流呈正相關(guān)(偏相關(guān)系數(shù)為0.45)。

在鹽脅迫48h內(nèi)，GhSOS1基因的表達(dá)呈先增加后降低的單峰曲線變化，且在鹽脅迫12-18h內(nèi)品種間差異顯著；棉花幼苗的耐鹽性與胚軸中GhSOS1基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(偏相關(guān)系數(shù)為-0.69)，與葉肉組織中GhSOS1基因的表達(dá)呈正相關(guān)(偏相關(guān)系數(shù)為0.53)；且GhSOS1基因的表達(dá)水平與Na⁺離子流呈正相關(guān)。

本發(fā)明所述棉花種質(zhì)材料包括但不限于中571、中棉所49、中棉所44和新陸中61。

前述方法中，棉花種子經(jīng)消毒處理，用水漂洗后，在水中浸種催芽直至露白，然后播種于沙壤土中培養(yǎng)至三葉期，進(jìn)行鹽脅迫處理，然后利用非損傷微測技術(shù)測定棉花幼苗胚軸和葉肉組織中Na⁺離子流，同時(shí)利用qRT-PCR法測定胚軸和葉肉組織中GhSOS1基因的表達(dá)水平，從而區(qū)分耐鹽性差異的棉花種質(zhì)材料。

本發(fā)明的鑒定棉花苗期耐鹽性的方法具體包括以下步驟：

1)棉花種子用9％的雙氧水消毒30min，用水漂洗數(shù)次后用去離子水浸種催芽直至露白，播種于滅菌的沙壤土中培養(yǎng)至三葉期，進(jìn)行鹽脅迫處理，使其土壤終含鹽量為0.3％；為保持土壤中的水分及營養(yǎng)，每隔兩天澆100mL水，每隔5天澆100mL Hoagland營養(yǎng)液；

2)鹽脅迫處理9天后，利用非損傷微測技術(shù)測定棉花幼苗胚軸及葉肉組織Na⁺離子流速，具體如下：從幼苗子葉節(jié)處切去地上部枝葉部分，保留地下部作為胚軸樣品，切取第三葉片的中間部位作為葉肉組織樣品；將測定的樣品用去離子水沖洗干凈，并將其浸沒在蒸餾水中15min，浸入100mL測試液中平衡15min，再轉(zhuǎn)入新的100mL測試液中開始測試；測試部位距樣品位置300μm處；測試持續(xù)7-10min，舍棄前2-3min的數(shù)據(jù)；其中，所述測試液配方為：0.1mmol L^-1KCl、0.1mmol L^-1CaCl₂、0.3mmol·L^-1MES，pH 6.0；

3)鹽脅迫處理9天后，利用qRT-PCR法測定胚軸和葉肉組織中GhSOS1基因的表達(dá)水平，以GhUBQ7基因作為內(nèi)參；設(shè)計(jì)的qRT-PCR特異性引物分別為：

GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′

GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；以及

GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′

GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′；

4)根據(jù)步驟2)和3)的分析結(jié)果，區(qū)分出耐鹽性差異的棉花種質(zhì)材料。

步驟1)中培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度400μmol m^-2s^-1，光照/黑暗時(shí)長為14h/10h，光照時(shí)的培養(yǎng)溫度為30±2℃，黑暗時(shí)的培養(yǎng)溫度為20±2℃。

步驟3)qRT-PCR的反應(yīng)條件為：95℃30s；95℃5s，60℃35s，40個(gè)循環(huán)；

反應(yīng)體系為：2×UltraSYBR Mixture(With ROX1)10μl,正向引物0.4μl,反向引物0.4μl,DNA模板0.8μl,RNase-Free Water 8.4μl。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述方法在篩選耐鹽性棉花品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明首次利用非損傷微測技術(shù)測定棉花幼苗胚軸和葉肉組織中Na⁺離子的動(dòng)態(tài)變化情況(而常規(guī)方法是測定根系中Na⁺離子變化)，結(jié)果表明，幼苗的耐鹽性與胚軸中Na⁺離子流呈反比，與葉肉組織中Na⁺離子流呈正比，可以有效地區(qū)分耐鹽性差異的棉花種質(zhì)材料。同時(shí)，本方法還從基因水平上研究鹽脅迫下胚軸和葉肉組織中GhSOS1的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在鹽脅迫48h內(nèi)，GhSOS1的表達(dá)呈先增加后降低的單峰曲線變化，且在鹽脅迫12-18h內(nèi)品種間差異較大；幼苗的耐鹽性與胚軸中GhSOS1的表達(dá)呈反比，與葉肉組織中GhSOS1的表達(dá)呈正比，從基因角度進(jìn)一步明確不同種質(zhì)間耐鹽性的遺傳背景差異。

利用本發(fā)明方法，根據(jù)鹽脅迫下不同耐鹽性棉花品種在Na⁺吸收動(dòng)態(tài)變化趨勢上的明顯差異，可以利用Na⁺離子流以及Na⁺平衡相關(guān)基因的差異快速、準(zhǔn)確地鑒定棉花品種的耐鹽性，具有一定的實(shí)用價(jià)值，是一種穩(wěn)定高效簡便的棉花苗期耐鹽性鑒定的方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中利用SIET技術(shù)測定棉花幼苗的胚軸(a)和葉肉(b)組織中Na+離子流的示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中鹽脅迫下不同棉花幼苗的光合速率變化情況；其中，標(biāo)以不同字母的柱值在P<0.05水平上差異顯著。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中鹽脅迫下不同棉花幼苗胚軸(a)和葉肉(b)組織中Na⁺離子流變化情況。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中鹽脅迫下不同棉花幼苗胚軸(a)和葉肉(b)組織中GhSOS1表達(dá)量變化情況；其中，標(biāo)以不同字母的柱值在P<0.05水平上差異顯著。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例 鑒定棉花苗期耐鹽性的方法

1材料與方法

供試品種和鹽脅迫處理；以鹽敏感型中571(Z571)、中等耐鹽型中棉所49(CCRI49)和中棉所44(CCRI 44)、強(qiáng)耐鹽型CZ91(新陸中61優(yōu)系)為研究對(duì)象，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，光照培養(yǎng)室溫度為(30±2)℃/(20±2)℃，光照/黑暗時(shí)間為14h/10h，光照強(qiáng)度為400μmol m^-2s^-1。種子用9％的雙氧水消毒30min，清水漂洗數(shù)次后用去離子水浸種催芽直至露白，均勻播于高溫滅菌過的沙壤土中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到三葉期，進(jìn)行鹽脅迫處理，使其土壤終含鹽量為0.3％；鹽脅迫處理9天后，測定不同處理?xiàng)l件下各指標(biāo)。為保持土壤中的水分及營養(yǎng)，每隔兩天澆100ml的水，每隔五天澆100ml的Hoagland營養(yǎng)液。

光合速率的測定；在9:00～11:00之間用Li-6400(Li-COR，Lincoln，USA)光合儀測定幼苗倒4葉的凈光合速率，測定時(shí)光照強(qiáng)度設(shè)定為1000μmol m^-2s^-1，CO₂濃度為400μmol mol^-1，葉室溫度a為25℃。

Na⁺含量的測定；取盆中待測植株，先用去離子水浸泡10min后，再用蒸餾水沖洗干凈，并用吸水紙吸去表面附著的水分；將幼苗根及地上部(莖和葉)分開，分別于105℃殺青30min后，80℃下烘直至恒重，稱其干物質(zhì)量.將烘干后的植株粉碎過篩，用1mol L^-1HCl浸提12h并振蕩30min后過濾，用原子吸收分光光度計(jì)(SpectAA-50/55，Varian，Australia)測定Na⁺濃度。

離子流速測定；采用非損傷微測技術(shù)(BIO-001A，Younger USA Sci.&Tech.Corp.，Amherst，MA，USA)測定幼苗胚軸及葉肉組織Na⁺離子流速；選生長整齊的棉花幼苗，用刀片從幼苗子葉節(jié)處切去地上部枝葉部分，保留地下部作為胚軸樣品(見圖1a)，切取第三葉片的中間部位(約5×5mm)作為葉肉組織樣品(見圖1b)；將測定的樣品用去離子水沖洗干凈，并將其浸沒在蒸餾水15min，浸入100mL測試液中平衡15min，再轉(zhuǎn)入新的100mL測試液中開始測試。測試液配方：0.1mmol L-¹KCl、0.1mmol L-¹CaCl₂、0.3mmol·L-¹MES，pH 6.0；每處理測定8株幼苗，測試部位距樣品位置300μm處；測試持續(xù)7～10min(達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài))，舍棄前2～3min的數(shù)據(jù)。

離子運(yùn)轉(zhuǎn)體表達(dá)；應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)研究鹽脅迫3h、6h、12h、24h、48h后，胚軸和葉肉組織中Na⁺運(yùn)轉(zhuǎn)體GhSOS1基因表達(dá)水平。參照孟艷艷等(2011)改良的CTAB法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Primer Express3.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，以棉花中的GhUBQ7基因(GenBank登錄號(hào)：DQ116441)作為內(nèi)參，根據(jù)GhSOS1(GenBank登錄號(hào)：KM986873)設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，引物序列分別為：1)GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′，GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；2)GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′，GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′。采用SYBR green Ⅱ熒光染料(TaKaRa，Japan)法進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析。反應(yīng)體系為：2×UltraSYBR Mixture(With ROX1)10μl,正向引物0.4μl,反向引物0.4μl,DNA模板0.8μl,RNase-Free Water 8.4μl。擴(kuò)增條件為：95℃30s；95℃5s，60℃35s，40個(gè)循環(huán)，結(jié)果采用對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析(Livak et al.2001)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，各次結(jié)果趨勢一致，取其中具有代表性的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 16.0(SPSS Inc.Chicago，USA)處理數(shù)據(jù)，以Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2結(jié)果與分析

在正常條件下，不同品種的光合速率在11.3～12.5μmol m^-2s^-1之間，且品種間無顯著差異；鹽脅迫處理顯著的降了各品種的光合速率，光合速率在3.9-8.1μmol m^-2s^-1之間；其中，Z571的光合速率降低幅度最高(下降了65.4％)，而CZ91的的光合速率降低幅度最的低(下降了31.6％)。

利用SIET技術(shù)探究了鹽脅迫9天對(duì)不同棉花幼苗胚軸和葉肉組織中Na⁺離子流的影響(見圖3)。結(jié)果表明，鹽脅迫顯著的提高了Na⁺離子向地上部的運(yùn)輸，且不同基因型棉花的Na⁺離子運(yùn)轉(zhuǎn)及再分配存在著明顯的差異；鹽脅迫下，Z571向地上部運(yùn)輸Na⁺的速率為39874pmol cm^-2s^-1，顯著高于其他品種，運(yùn)輸Na⁺的速率最低的品種為CZ91，速率僅為8413pmol cm^-2s^-1。鹽脅迫也顯著的增加了葉片中Na⁺離子的外流，其中Na⁺離子外流速率最高的為CZ91，外流速率增加了96％。

鹽脅迫下，各品種胚軸和葉肉組織中GhSOS1的表達(dá)呈先增加后降低的單峰曲線變化，且在鹽脅迫12-18h內(nèi)品種間差異較大；鹽脅迫條件下，鹽敏感品種Z571胚軸中GhSOS1的表達(dá)受影響最顯著，表達(dá)增加了2.1倍(12-18h的平均值)；而在葉肉組織中，強(qiáng)耐鹽品種CZ91受鹽脅迫影響最為顯著，其中在鹽脅迫處理12h時(shí)，CZ91的GhSOS1表達(dá)上調(diào)了4.5倍，顯著高于其他品種(見圖4)。

線性相關(guān)分析是研究2個(gè)變量間線性關(guān)系的一種基本方法。為了進(jìn)一步明確離子流和GhSOS1基因與棉花耐鹽性的關(guān)系，分別對(duì)上述指標(biāo)與光合速率進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。如表1所示，光合速率與胚軸Na⁺離子流、胚軸GhSOS1呈顯著地負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.77和-0.69；光合速率與葉肉組織Na⁺離子流、葉肉組織GhSOS1呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.45和0.53；與此同時(shí)，Na⁺離子流與GhSOS1呈顯著地正相關(guān)，胚軸和葉肉組織中Na⁺離子流與GhSOS1的相關(guān)系數(shù)分別為0.97和0.94。

表1 不同耐鹽性指標(biāo)間的Pearson相關(guān)性

注：*表示在P<0.05水平上差異顯著；GhSOS1表達(dá)量為12-18h平均值

本發(fā)明通過電生理和分子技術(shù)的相結(jié)合，建立了一種高效準(zhǔn)確的室內(nèi)鑒定棉花幼苗耐鹽性的方法。利用非損傷微測技術(shù)測定棉花幼苗胚軸和葉肉組織中Na⁺離子流，可以有效地區(qū)分耐鹽性差異的棉花種質(zhì)材料；耐鹽性與胚軸中Na⁺離子流呈顯著的負(fù)相關(guān)，與葉肉組織中Na⁺離子流呈正相關(guān)。GhSOS1的表達(dá)水平在鹽脅迫12-18h內(nèi)品種間差異最大，且與Na⁺離子流呈顯著地正相關(guān)，與各品種的耐鹽性也具有較高的相關(guān)性。研究表明，可以通過電生理技術(shù)測定棉花種質(zhì)胚軸和葉肉組織中Na⁺離子流有效的篩選耐鹽性材料，同時(shí)通過鹽脅迫下GhSOS1的表達(dá)情況，從基因的水平上進(jìn)一步明確不同種質(zhì)間耐鹽性的遺傳背景差異。

本發(fā)明選用4個(gè)耐鹽性差異顯著的棉花品種為材料，利用沙壤土為培養(yǎng)基質(zhì)，種植在人工培養(yǎng)箱中，研究鹽協(xié)迫下各品種各項(xiàng)生理指標(biāo)，如Na⁺的積累和分配、光合速率等，同時(shí)采用非損傷微測技術(shù)(Scanning Ion-selective Electrode Technique，SIET)和qRT-PCR技術(shù)，測定了鹽脅迫條件下Na⁺離子流以及Na⁺運(yùn)轉(zhuǎn)基因GhSOS1的變化情況。研究還表明，鹽脅迫下不同耐鹽性棉花品種在Na⁺吸收動(dòng)態(tài)變化趨勢上具有明顯差異，可以利用Na⁺離子流以及Na⁺平衡相關(guān)基因的差異快速、準(zhǔn)確地鑒定棉花品種的耐鹽性，具有一定的實(shí)用價(jià)值，是一種穩(wěn)定高效簡便的棉花苗期耐鹽性鑒定的方法。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaggcattc cacctgacca ac 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttgaccttc ttcttcttgt gcttg 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

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<213> 人工序列

<400> 4

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